CC BY
15ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия Б, 2007, том 49, № 4, с. 732-749
МЕТОДЫ
=========^ ИССЛЕДОВАНИЯ
УДК 541.64:543.544
О ПРИМЕНИМОСТИ КОНЦЕПЦИИ КРИТИЧЕСКОЙ ХРОМАТОГРАФИИ К ЗАДАЧАМ ПРОТЕОМИКИ. ЗАВИСИМОСТЬ ВРЕМЕНИ УДЕРЖИВАНИЯ ОТ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ
В ЦЕПИ1
© 2007 г. А. В. Горшков*, В. В. Евреинов*, И. А. Тарасова**, М. В. Горшков**
* Институт химической физики им. H.H. Семенова Российской академии наук 119991 Москва, ул. Косыгина, 4 ** Институт энергетических проблем химической физики Российской академии наук 119334 Москва, Ленинский пр., 38, корп. 2 Поступила в редакцию 18.05.2006 г. Принята в печать 10.11.2006 г.
Предложена модель разделения пептидов, основанная на методе критической хроматографии макромолекул. В рамках модели рассмотрена совокупность экспериментальных данных по разделению пептидов. Определены основные феноменологические параметры модели - эффективные энергии адсорбции аминокислотных остатков, что позволило предсказать влияние характера их чередования в цепи на времена удерживания. Модель применена для оценки возможности разделения в разных хроматографических режимах пептидов с одинаковым аминокислотным составом, различающихся последовательностью расположения звеньев в цепи, а также содержащих изомеры аминокислот, зеркальные последовательности с разными концевыми группами.
ВВЕДЕНИЕ
Одной из задач химии биомакромолекул и протеомики является определение первичной структуры цепи, включая как саму последовательность аминокислотных остатков, так и наличие в ней в определенных местах функциональных или модифицированных групп, "перестановку" аминокислот и другие особенности строения. Аналогичная задача, существующая в химии синтетических полимеров, в настоящее время успешно решается применением метода критической хроматографии в сочетании с масс-спектромет-рическим детектированием. Возможно ли применение идей и методов критической хроматографии к задаче определения последовательности
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Отделения химии и наук о материалах РАН (программа "Создание эффективных методов химического анализа и исследования структуры веществ и материалов"), а также Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 06-04-49632) и фонда INTAS (гранты 04-83-2643 и Genomics 05-10000004-7759).
E-mail: evreinov@polymer.chph.ras.ru (Евреинов Виктор Викторович).
биомакромолекул и, если возможно, то какие результаты следует ожидать? Эти вопросы обсуждаются в настоящей работе на примере разделения пептидов - относительно коротких макромолекул, состоящих из 10-50 аминокислотных остатков. В рамках модели критической хроматографии рассмотрена совокупность экспериментальных данных по разделению пептидов на обращенной фазе и определены основные феноменологические параметры модели - эффективные энергии адсорбции аминокислотных остатков. Таким образом оказывается возможным теоретически предсказать времена (объемы) удерживания для пептида с любой заданной последовательностью и оценить применимость критической хроматографии для решения задач разделения пептидов с различными первичными последовательностями, разным числом, типом и местом модифицированных (функциональных) групп в цепи, пептидов, содержащих изомеры лейцина (Ь) и изолейцина (I), а также зеркальных последовательностей. Экспериментальная проверка предсказаний модели, а также объединение
хроматографических Данных с масс-спектромет-рическими в рамках единого комплекса для "чтения" последовательностей пептидов и других биомакромолекул будут предметом дальнейших исследований.
ОТЛИЧИЕ АДСОРБЦИИ МАКРОМОЛЕКУЛ ОТ АДСОРБЦИИ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЕЩЕСТВ
Основной измеряемой величиной в хроматографии макромолекул является объем удерживания Уя, определяемый коэффициентом распределения Кф равным отношению концентраций макромолекул в подвижной фазе объемом У0 и в порах объемом Ур:
ук = У0 + К-,Ур (1)
Коэффициент распределения в свою очередь зависит от изменения свободной энергии макромолекулы ДО при ее попадании из межчастичного пространства в пору неподвижной фазы
V _ £р _ ~Атт - Уо2Р
а ~ С« ~ V 6 ~ V 7„
ур у р^ о
и, следовательно, определяется отношением статистических сумм макромолекул в поре и в межчастичном "неограниченном" пространстве
В случае градиента состава растворителя коэффициент распределения зависит от объема V прокачанного через колонку растворителя Ка = К/У). При этом считается, что при медленном изменении состава элюента локальное равновесие в колонке успевает установиться, и для определения объема удерживания можно применять квазиравновесный подход. Тогда объем удерживания определяется следующим образом:
Г йУ = 1 (2)
J УрКл(У) к}
о
Чтобы количественно описать разделение макромолекул, необходимо задать зависимость К/У). Подобный расчет может быть сделан в рамках простой модели адсорбции цепи. Тем са-
мым оказывается возможным теоретически предсказать характер разделения макромолекул.
Прежде чем перейти к рассмотрению модели адсорбции и экспериментальному определению необходимых для расчета параметров, резюмируем качественные различия адсорбции макромолекул по сравнению с адсорбцией низкомолекулярных соединений.
Принципиальным отличием макромолекул от низкомолекулярных соединений (мономеров) является связанность звеньев в цепь [1]. В процессах адсорбции звенья цепи взаимодействуют с поверхностью коллективно. Это взаимодействие отражает не только индивидуальные свойства (химическое строение) звена, но и коллективные свойства всей цепи (ее последовательность). Если адсорбция несвязанных мономеров проистекает плавно в достаточно широком диапазоне температур, то для макромолекул она осуществляется скачком в узком температурном диапазоне вблизи критической температуры Гсг, при которой потери энтропии связи вблизи поверхности компенсируется энергией притяжения. Если Т > Тст, то макромолекулы находятся в растворе, и их доля на поверхности исчезающе мала, при Т < Гсг они резко локализуются на поверхности. Адсорбция макромолекулы носит характер фазового перехода в системе связанных в цепь звеньев. Связанность звеньев в цепь, называемая "линейной памятью", означает, что равновесное состояние по отношению к адсорбционному взаимодействию реализуется с учетом ограничений, накладываемых ковалентными химическими связями. Поскольку энергия этих связей намного превышает энергию адсорбционного взаимодействия мономерного звена, в процессе адсорбции цепь не разрушается, следовательно, при адсорбции должен проявляться и характер связанности звеньев.
Равновесные свойства адсорбирующейся макромолекулы определяют объем (время) удерживания в хроматографии. Функция распределения, описывающая адсорбционное взаимодействие низкомолекулярных веществ е~^(Г)/кТ (е(Г) - энергия взаимодействия с поверхностью в состоянии Г),
для макромолекул заменяется на е I I ,
I*
где функции g¡ - связи между соседними звеньями.
т
к О
1
й 0 + 1
Рис. 1. Решеточная цепь случайных блужданий в щелеобразной поре как модель хроматографи-ческого разделения макромолекул пептидов.
Тогда статистическая сумма адсорбирующейся макромолекулы представляется в виде
2 = = о)
Специфическое сильное взаимодействие между мономерами цепи за счет химических кова-лентных связей и связанные с ним ограничения в реализации равновесного состояния макромолекулы играют большую роль и в других процессах с участием макромолекул, таких, например, как переход клубок-глобула. Для описания этих явлений применяются современные методы физики конденсированного состояния, изложенные в работах [2-4].
Несмотря на сложность адсорбции макромолекул, ее можно количественно описать с помощью простой, но не тривиальной модели. Как и в теории растворов, наиболее наглядной оказывается решеточная модель, в которой макромолекула представляется цепью случайных блужданий [5]. Данная модель дает, безусловно, приближенное описание реальных макромолекул. Однако она с успехом применяется для описания закономерностей хроматографии полимеров [6, 7], в том числе и для практического поиска условий, наилучших для их разделения по тем или иным структурным особенностям. Оказывается, что при соответствующем экспериментальном определении феноменологических параметров, описывающих адсорбционное взаимодействие звеньев цепи, результаты расчетов близки к экспериментальным данным [8].
МОДЕЛЬ ХРОМАТОГРАФИИ МАКРОМОЛЕКУЛ И ЕЕ СЛЕДСТВИЯ
В решеточной модели раствора непрерывное пространство заменяется, например, простой кубической решеткой, узлы которой заняты либо молекулами растворителя, либо звеньями цепи (рис. 1). Адсорбент представляется в виде набора щелеобразных пор размера 1>, а каждой конфигурации макромолекулы ставится в соответствие цепь блужданий по узлам решетки. Если звенья цепи попадают на поверхность, то они взаимодействуют с ней с энергией -е, что приводит к множителю е?,кт в конфигурационном интеграле. В силу симметрии задачи имеет смысл отслеживать блуждания цепи только по координате х, перпендикулярной адсорбционным поверхностям, т.е. модель, по сути, одномерна. Как показывает эксперимент, для синтетических полимеров выбор щелеобразной поры хорошо соответствует реальной картине разделения. По-видимому, истинная фрактальная размерность порового пространства адсорбентов на основе силикагеля близка к двум.
Связанность звеньев в цепь описывается переходной матрицей (оператором) И^(е), элементы которой имеют смысл условной вероятности попадания звена г цепи в точку х1 при условии, что звено / - 1 находилось в точке дс, _ ^
Щ£) =
2/3/ 1/б/
1/6 О
О О 2/3 1/6 О 1/6 2/3 1/6
О 1/6 2/3 1/6 О 0 1/6/ 2/3/
(4)
Для простоты будем считать энергию £ выраженной в единицах кТ. Размерность матрицы (в единицах размера звена) определяется шириной поры. Обычно принимают размер звена а ~ 10 А, так что для реальных адсорбентов размерность переходной матрицы невелика: В - 10-30.
Для цепи длиной N функция распределения последнего звена в цепи по координатам внутри поры имеет вид
Р„ = МГР,
0'
(5)
где Р0 = и - стартовый вектор, все компоненты которого равны единице, описывающий равновероятное начало цепи в любой точке внутри поры. Прямым перемножением матриц можно убедиться, что компоненты вектора РдХ**) действительно содержат все возможные конфигурации цепи, начинающейся внутри поры и заканчивающейся в точке хк. Для нахождения статистической суммы Хр необходимо просуммировать по всем точкам хк - координатам конца цепи:
гр = иг^рс
(6)
Очевидно, что это есть не что иное, как запись конфигурационного интеграла (3) в дискретном пространстве узлов решетки (и - единичный вектор). Статистическая сумма цепи нормирована таким образом, что в неограниченном пространстве (межчастичном пространстве объемом У0) = 1 для любой длины цепи N. С учетом нормировки для получения коэффициента распределения Кл необходимо Хр в уравнении (6) разделить на размер поры Д выраженный в единицах размера звена. Тогда
„ -А 17*Г 1 ~
Кл = е = ъ р
(7)
Таким образом, модель случайных блужданий позволяет элементарно рассчитать коэффициент
распределения и предсказать закономерности хроматографического разделения макромолекул в соответствии с основным уравнением (1). Значения У0 и Ур - константы колонки, объем межчастичного пространства (подвижной фазы) и суммарный объем пор (неподвижной фазы). Экспериментально определяемый объем удерживания Ук есть, по сути, статистическая сумма макромолекулы в колонке. В отличие от времени удерживания, объем удерживания имеет глубокий физический смысл. На практике обычно используют время удерживания гк, которое зависит от объемного расхода растворителя и пропорционально Ук. В дальнейшем мы будем говорить в основном об объемах удерживания.
КРИТИЧЕСКИЕ УСЛОВИЯ И ЕДИНЫЙ МЕХАНИЗМ
ХРОМАТОГРАФИИ МАКРОМОЛЕКУЛ
Напомним, какие следствия для хроматографии полимеров вытекают из предложенной модели в важнейших частных случаях. Если взаимодействие звеньев цепи с поверхностью равно нулю (е = 0), то, очевидно, реализуется эксклюзионный режим хроматографии макромолекул. Это непосредственно следует из формы переходной матрицы в уравнении (4). При £ = 0 сумма элементов матрицы в первой и последней строке меньше единицы, и их последовательное перемножение приводит к тому, что компоненты вектора РдК**) уравнения (5) вблизи стенок быстро стремятся к нулю. Следовательно, при увеличении длины цепи часть пространства поры вблизи стенок оказывается "исключенной", и калибровка (в стандартных координатах характерна эксклюзионному режиму разделения (рис. 2). С ростом энергии отталкивания £ — картина практически не меняется, за исключением того, что эффективный размер поры становится равным О-2, что несущественно для широких пор: й > 1.
Другой предельный случай (адсорбционный режим) соответствует сильной энергии притяжения, такой, что цепь оказывается адсорбированной на какой-либо из поверхностей поры. В адсорбционном режиме статистическая сумма, коэффициент распределения Ка и объем удерживания Ук экспоненциально сильно зависят от длины цепи. Это также можно заметить из
Рис. 2. Режимы хроматографии макромолекул на примере полиэтиленоксида: переход от экс-кл юз ионного (7) к адсорбционному (3) режиму через критический режим (2) на обращенной фазе -С18 в бинарном растворителе вода-аце-тонитрил при изменении его состава. Цифры у кривых - содержание компонента В, об. %.
формы переходных матриц: при их перемножении основной вклад будут давать экспоненциально большие члены. В пределе е —- каждое звено цепи взаимодействует с поверхностью.
Кроме этих двух режимов, обычных для хроматографии макромолекул, существует еще один, особый режим разделения, называемый критическим. Из вида уравнения (4) легко заметить, что при энергии взаимодействия звена с поверхностью £сг = 1п(6/5) (при компенсации потерь энтропии энергией притяжения) суммы компонентов в первой и последней строке Неравны единице. Следовательно, равномерное распределение Р0 сохраняется для цепей любой длины, статистическая сумма при этом в точности равна объему поры Д коэффициент распределения равен единице, Кл = 1, а объем удерживания
УК = У0 + УР <8>
В критическом режиме размер макромолекул и ММР как бы "исчезают", что создает наилучшие условия для исследования других, отличных от ММР, типов структуры макромолекул: числа и типа функциональных групп в цепи, ее топологии, распределения по составу и архитектуре со-
полимеров. Для синтетических полимеров ММР существует всегда, и в эксклюзионном или адсорбционных режимах маскирует какие-либо другие структурные особенности цепи. Для биомакромолекул ММР отсутствует, так что в определенном смысле хроматография биополимеров проще: возможности эксклюзионного и адсорбционного режимов разделения для исследования их структуры также реализуемы.
Критическая хроматография была введена в практику хроматографии в работе [9] и в настоящее время широко используется для разделения макромолекул по разным типам их структуры [10-13]. Особенности критического режима есть следствие масштабной инвариантности системы вблизи критической точки адсорбции. Они имеют глубокую связь с общей теорией фазовых переходов [14], которую в рамках настоящей работы обсуждать не представляется возможным.
Критический режим объединяет эксклюзион-ный и адсорбционный режимы в рамках единого механизма хроматографии. Как показано в настоящее время в работах по хроматографии полимеров, рассматриваемая модель адсорбции цепи случайных блужданий (или ее аналог, сводящийся к уравнению теплопроводности) адекватно описывает основные закономерности разделения макромолекул.
Напомним также, как проявляются особенности адсорбции макромолекул при их градиентном элюировании, тем более что обычно разделение биомакромолекул происходит в условиях градиента состава растворителя.
Скачкообразный переход макромолекул в адсорбированное состояние значительно упрощает картину их разделения. Обычно градиент растворителя осуществляется таким образом, что эффективная энергия взаимодействия звена с поверхностью уменьшается с увеличением объема прокачанного растворителя. До тех пор, пока энергия взаимодействия звена больше критической (е > £ст), макромолекула экспоненциально сильно адсорбируется и практически не движется вдоль колонки. Как только величина энергии уменьшается до критического значения, макромолекула резко десорбируется и перемещается по колонке со скоростью растворителя. Таким образом, градиентная хроматография макромолекул неявно предполагает переход через кри-
тическую точку адсорбции. Следовательно, особенности критической точки также важны для понимания закономерностей градиентной хроматографии макромолекул. Эти закономерности заметно упрощаются для узких пор: в данном случае существенным становится не характер чередования различных мономеров, а их количество в цепи.
В градиенте растворителей макромолекулы распределяются по составам смесей, в которых реализуются соответствующие критические энергии, и выходят в узких зонах вблизи своих критических точек. Критические энергии зависят от химического строения звеньев цепи. С учетом ступенчатого характера перехода в адсорбированное состояние даже макромолекулы, весьма близкие по строению звеньев (например, изомеры), в градиенте растворителя могут разделяться. Градиент используется и для быстрого поиска критических точек адсорбции макромолекул в различных хроматографических системах.
ЭФФЕКТИВНАЯ ЭНЕРГИЯ АДСОРБЦИИ ЗВЕНА
Основным феноменологическим параметром представленной выше модели является микроскопическая эффективная энергия взаимодействия звена цепи (для пептидов - аминокислотного остатка). В общем случае эта энергия есть функция химического строения звена, поверхности адсорбента, химического строения и состава растворителя и температуры колонки. Ясно, что рассчитать такую энергию исходя из первых принципов методами квантовой химии и молекулярной динамики вряд ли возможно. Однако эффективная энергия может быть определена экспериментально в рамках корреляционной теории, например теории Снайдера [15]. Подробное описание применения теории Снайдера для моделирования разделения олигомеров с функциональными группами дано в работах [10, 11], ниже сформулированы краткие принципы такого подхода. Для оценки эффективной энергии можно использовать любую другую корреляционную теорию, ее связь с приведенной выше формальной теорией адсорбции макромолекул осуществляется аналогично. Вместе с тем теория Снайдера имеет в своей основе простую лэнгмюровскую модель адсорбции компонентов растворителя и
весьма просто "вписывается" в рассматриваемую решеточную модель адсорбции цепи.
Имея в виду приложение модели к разделению пептидов, в первую очередь необходимо определить зависимость эффективной энергии от состава бинарного растворителя. Для простоты зафиксируем тип адсорбента (обращенная фаза типа -Сх8) и компоненты бинарного растворителя (для пептидов обычно это вода и ацетонитрил с добавками 0.1-0.2% трифторуксусной кислоты, так, чтобы рН составлял 2.0).
В силу малости средней концентрации мономеров в клубке весьма эффективным оказывается применение приближения системы разорванных звеньев [1]. Энергия взаимодействия звена с поверхностью принимается такой же, как и для его низкомолекулярного аналога. Эта энергия е отражает равновесие в многокомпонентной системе звено-поверхность-растворитель. В соответствии с теорией Снайдера ее можно представить в виде
е = Х°-г0(Ыв) (9)
Здесь - абсолютная энергия взаимодействия звена с поверхностью, £0(УУВ) - энергия десорбции растворителя (обычно называемая его элюирую-щей силой), зависящая от состава (мольной доли компонента В бинарного растворителя А - В). Уравнение (9), основанное на пренебрежении взаимодействием звеньев с растворителем и молекул растворителя друг с другом, достаточно хорошо обосновано для полярных адсорбентов типа сили-кагеля. Для обращенной фазы возможно, что такое упрощение не столь хорошо обосновано. Однако надо иметь в виду, что в нашем случае корреляционная теория применяется в рамках упрощенной модели цепи. Усложнение только корреляционной теории и включение в нее взаимодействий в растворе без соответствующего усложнения, в том числе и модели цепи, вряд ли оправдано. Можно сказать, что выражение (9) для эффективной энергии просто постулируется, не вдаваясь в его физическое обоснование.
Рассмотрим цепь блужданий на решетке в бинарном растворителе с компонентами А (вода) и В (ацетонитрил). Модель предполагает короткодействующее (точечное) взаимодействие звена с поверхностью, ограниченное размером порядка
размера звена а ~ 10 А. Попадание звена на поверхность вызывает десорбцию либо молекул А, либо молекул В.
В растворе вся поверхность занята молекулами растворителя. В силу малости средней концентрации звеньев в клубке можно предположить, что адсорбция звеньев макромолекулы слабо влияет на равновесное распределение компонентов растворителя на поверхности и в растворе. Тогда усредненная матрица перехода (Щ может быть представлена в виде
= (1-0в)ЩХ°-еА) + евЩХо-ев),
где 6В - степень заполнения поверхности компонентом В. Легко заметить, что (Щ есть
(Ю = ]¥(е*) = )У(Х0-еАВ)
Здесь
£ав = еА-1п[(1-ев) + евехр(еА-ев)],
а еа и ев - соответствующие элюирующие силы "чистых" компонентов А и В. Следовательно, в бинарном растворителе цепь представляется блужданием по решетке с матрицей перехода, имеющей ту же структуру, что и в однокомпо-нентном растворителе, но с заменой элюирую-щей силы на эффективную величину £АВ. Введем константу равновесия компонентов растворителя на поверхности:
Тогда для элюирующей силы смеси получаем
£дв = £А + 1п[1-#в + ЛГвехр(ев-еА)] (10)
Это есть уравнение Снайдера [15] для элюирующей силы бинарного растворителя. Таким образом, изменение состава растворителя приводит к изменению эффективной энергии адсорбции звена цепи. Корреляционная теория позволяет непрерывным образом описать переход от адсорбции к эксклюзии через критический режим при изменении состава растворителя и связанные с данным переходом изменения в характере разделения макромолекул.
Для применения корреляционной теории и описания характера разделения макромолекул при любых изменениях состава растворителя необходимо определить три основных феноменологических параметра: энергию адсорбции звена Х° и элюирующие силы растворителей еА и ев. Для этого необходимо исследовать переход от экс-клюзионного режима к адсорбционному при нескольких фиксированных составах бинарного растворителя. Фактически для определения параметров корреляционной теории достаточно трех составов, один из которых соответствует критическому режиму, а два других - адсорбционному и эксклюзионному. Критический состав дает простейшее уравнение, связывающее феноменологические параметры модели:
еСг = Х0-^^) = 1п6/5 «0.18
При этом Кл = 1.0 и Ук = У0 + Ур. Для других составов необходимо рассчитывать Ук по уравнениям (1), (7), (10) и сравнивать их с экспериментально наблюдаемыми величинами. Варьируя Х°, еА, £в и добиваясь наилучшего совпадения теории и эксперимента, оказывается возможным определение параметров модели, необходимых для описания с хорошей точностью перехода от эксклюзии к адсорбции. Знание этих параметров дает возможность предсказывать особенности разделения макромолекул известной структуры в данном бинарном растворителе А и В при любом его составе и при любом характере изменения состава во времени (градиенте).
Рассмотрим, как эту модель можно применить для предсказания времен удерживания пептидов с разной последовательностью.
ГЕТЕРОПОЛИМЕР И ЭФФЕКТИВНЫЕ ЭНЕРГИИ АДСОРБЦИИ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ
Принципиальным отличием биомакромолекул от макромолекул синтетических полимеров является гетерогенность их цепей и отсутствие ММР. В рамках предложенной модели гетерогенность цепи учитывается следующим образом:
г = игЩелг)Щ8лг_1)...Ще2)^(е1)Ро (")
Здесь Ще,) - переходная матрица г аминокислотного остатка, имеющего энергию взаимодей-
ствия с поверхностью £,. Для определения коэффициента распределения теперь необходимо знать не только степень полимеризации пептида, но и последовательность аминокислотных остатков в его цепи, его "текст" {5}.
Уже сама форма записи статистической суммы в виде (11) позволяет сделать принципиальный вывод о ее зависимости от последовательности составляющих цепь аминокислотных остатков. Переходные матрицы Ще,) некоммутативны:
\ViWj Ф \VjWi
и цепи, имеющие абсолютно одинаковый аминокислотный состав, но различающиеся характером чередования звеньев, могут иметь разные коэффициенты распределения. Следовательно, предлагаемая модель органически содержит в себе различие адсорбционных свойств биомакромолекул, отличающихся последовательностью составляющих их аминокислотных остатков.
Запись эффективной энергии взаимодействия 8дв в виде уравнения (10) и "расцепление" свойств звена и растворителя позволяют применить корреляционную теорию и для гетерополимеров. Для описания разделения биомакромолекул по их первичной последовательности {5} необходимо задать последовательность феноменологических
параметров {X,0}, характеризующих эффективное взаимодействие аминокислотных остатков цепи с поверхностью (будем называть это адсорбционным энергетическим профилем последовательности). Указанные параметры определяются экспериментально, после чего модель позволяет оценить объем удерживания пептида с любым известным "текстом" {5}.
Наиболее простой способ определения эффективных энергий адсорбции аминокислотных остатков - исследование перехода от эксклюзии к адсорбции и определение критических точек для синтетических гомополимеров полиаминокислот. Однако далеко не все полиаминокислоты можно синтезировать, кроме того, многие из них не растворимы в смеси вода-ацетонитрил. Тем не менее, достаточно лишь для одной растворимой полиаминокислоты / экспериментально определить эффективную энергию адсорбции остат-
ка и константы растворителей £а и £в. Затем, заменяя в этой последовательности всего одну, например, крайнюю аминокислоту, можно найти
эффективные энергии взаимодействия {Х(°} и для всех других аминокислотных остатков.
Идейно такая постановка задачи аналогична задаче об адсорбции макромолекул с одной концевой функциональной группой. В критических условиях для растворимой полиаминокислоты, имеющей в последовательности на конце N другую аминокислоту с энергией адсорбции гм, коэффициент распределения Ка однозначно связан с разностью эффективных энергий взаимодействия этих аминокислот (см. выражение (6)):
К* = ¿(и^„(£„)^Ле( = £сг)Р0) = = ¿(иГ^„(£„)Р0) = 1+|(/"~Х'°-1)
В предлагаемой корреляционной теории параметры растворителя £А, £в не зависят от свойств макромолекулы, они предполагаются одинаковыми для макромолекул любой природы. Эти параметры могут быть определены вообще независимо от пептидов, например, по исследованию перехода от эксклюзии к адсорбции макромолекул полиэтиленоксида.
Для завершения построения корреляционной теории необходимо учесть различие адсорбционных свойств адсорбентов одного типа (например -С18) в разных колонках или одного и того же адсорбента (одной колонки) со временем. Ясно, что активность колонки со временем меняется, что в обычной хроматографии низкомолекулярных соединений учитывается коррекцией наблюдаемых объемов удерживания на объем удерживания известного стандартного вещества. Такой же подход применим и для макромолекул: для эффективной энергии взаимодействия можно записать
£ = а(Х°-£Ав)
Параметр а интерпретируется, аналогично теории Снайдера, как "активность" адсорбента и определяется по времени удерживания стандартного пептида с известной последовательностью аминокислотных остатков.
Кроме эффективных энергий адсорбции аминокислотных остатков в корреляционную теорию необходимо включить энергию адсорбции
концевых групп а также энергию адсорб-
ции модифицированных аминокислотных остат-
V0
ков ам для предсказания времен удерживания модифицированных пептидов.
Прежде чем приступать к проверке, насколько адекватно предлагаемая модель описывает существующие экспериментальные данные по хроматографии пептидов, несколько переформулируем ее. Примем, что цепь пептида начинается справа налево (с С-конца к 1Ч-концу). Будем считать первым мономером решеточной цепи первый аминокислотный остаток с С-конца. Тогда "стартовый" вектор цепи Р0, описывающий распределение первого звена в поре, будет иметь вид
Ро =
Статистическая сумма пептида с заданным "текстом" {5} общей длиной N запишется следующим образом:
ZP({S}) = iffjH^Po
(13)
/ = 2
Обычно в корреляционной теории выбирается наиболее слабый растворитель (пентан для нормальной фазы или вода для обращенной фазы), для которого элюирующая сила полагается равной нулю (еА = 0). Такая нормировка ничего не меняет, поскольку на изменение элюирующей силы от состава растворителя влияет лишь разность ев - еА. Соответствующей перенормировкой энергий взаимодействия можно всегда выбрать элюирующую силу одного из компонентов (более слабого) равной нулю. Будем считать такую нормировку выполненной, так что элюирующая сила слабого компонента - воды еА = 0.
Наконец, для определения объема удерживания при градиенте состава растворителя интеграл (2) удобно записать в дискретном виде, аппрокси-
мируя непрерывную функцию К ¿У) ступенчатой КДГд где V, - порция растворителя постоянного состава:
и-1
и-1
VR-V0= ^Vi + Kd(Vn)V Jl-£
V;
i = 1
i = 1
Kd(Vi)VP
(14)
Здесь п - номер порции растворителя, в котором макромолекула выходит из колонки, определяемый условием
п- 1
1
i=l
<•<1
1
j = 1
Kd(Vi)Vf
Применим модель для описания экспериментальных данных по разделению пептидов, представленных в серии работ [16-19].
В этих работах также предложен корреляционный подход для предсказания объемов удерживания пептидов. Он основывается на принципе аддитивности вкладов аминокислотных остатков во время удерживания пептида:
о>
(15)
где CRi - коэффициент удерживания i-го типа аминокислотного остатка, число которых л, (степень полимеризации пептида N = щ). Параметр t0 позволяет учесть небольшие различия в свойствах адсорбентов (активность) и определяется по стандартам S^Ss (Peptide retention standards, Pierce Biotechnology Inc.). Коэффициенты удерживания находятся экспериментально по модельным синтетическим пептидам для обращенной фазы, бинарного растворителя вода (А) -ацетонитрил (В) с добавками трифторуксусной кислоты и рН 2.0, в градиенте 0-100 об. % В с наклоном 1 об. % В/мин. Стандартная скорость подачи растворителя 1 мл/мин. Теоретические расчеты, представленные ниже, предполагают эти условия, если не оговаривается иное.
Уравнение (15) соответствует приближению к описанию разделения пептидов "со стороны" низкомолекулярных соединений. Очевидно, что оно не содержит информацию о последовательности цепи {£}, а только лишь о ее аминокислотном составе. Такое приближение достаточно хорошо
обосновано для коротких пептидов, которые адсорбируются на поверхности всеми звеньями.
При увеличении длины цепи аддитивность должна нарушаться, что связано с "включением" энтропии цепи и появлением в конфигурации адсорбированной цепи петель и хвостов, не имеющих контакта с поверхностью. Для учета этого обстоятельства в уравнение (15) вводятся дополнительные корреляционные поправки [18], также не имеющие физического смысла. Более сложные варианты такого подхода не ограничиваются линейной частью, а используют в уравнении (15) полиномы и, следовательно, дополнительные наборы корректирующих коэффициентов.
Как будет показано ниже, наблюдающиеся экспериментально отклонения от аддитивности, возникающие при увеличении длины цепи, автоматически вытекают из предлагаемой нами модели и не требуют введения дополнительных поправок. Кроме того, она в отличие от уравнения (15) или его полиномиальных аналогов явно учитывает не только аминокислотный состав, но и последовательность цепи {5}.
Модель цепи блужданий соответствует принципу аддитивности в предельных случаях коротких цепей или очень сильной энергии адсорбции звеньев е, > 1. При этом цепь фактически находится в единственном основном состоянии, когда она полностью распластана на поверхности и взаимодействие зависит от ее аминокислотного состава, а не от последовательности. В градиенте растворителя при переходе от адсорбционного к эксклюзионному режиму даже короткая макромолекула не взаимодействует с поверхностью всеми звеньями. Из-за вклада других состояний цепи должна появляться зависимость ее времени удерживания от последовательности. Данный эффект в общем случае не очень велик, и целью работы является оценка его масштаба, который, очевидно, будет зависеть от конкретной последовательности звеньев в цепи. Такие оценки при корректном определении феноменологических параметров модели могут давать количественное представление о возможностях хроматографии для решения разных задач протеомики.
СРАВНЕНИЕ МОДЕЛИ С ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМИ ДАННЫМИ
Опишем в рамках предлагаемой модели совокупность экспериментальных данных работ [16-19]. В расчетах по уравнениям (7), (13), (14) необходимо задать константы колонки V0 и Vp, а также размер пор адсорбента D. Поскольку указанные параметры в работах [16-19] не определялись экспериментально, мы приняли для них следующие величины: V0 « VP ~ 1.3 мл для колонки 4.1 х 250 мм и «1.7 мл для колонок 4.6 х 250 мм. Размер пор D, выраженный в единицах звеньев, принят D = 30 для адсорбентов с порами 300 А и 10 для пор 100 А. Обозначения аминокислотных остатков, используемые ниже, соответствуют общепринятым.
Использованные в работе [16] модели пептидов Ac-GXXLLLKK-amid, где X - аминокислотный остаток, позволяют из экспериментальных хроматографических данных по их разделению
определить необходимую шкалу энергий X?.
Параметры растворителя еА = 0 и £в = 2.40 выбирались такими, чтобы совокупность экспериментальных времен удерживания модельных пеп-
тидов при наиденных величинах л, , а также пептидов разной длины описывалась наилучшим образом. При этом энергии концевых групп Ас-(СН3-СО-) и -amide (-CO-NH2) принимались равными нулю (еАс_ = е_апиёе - 0)» что является естественным приближением для взаимодействия этих групп с обращенной фазой.
Энергия определялась следующим образом. На первом этапе варьированием энергий ,
Xq , Xl добивались совпадения экспериментальных и расчетных объемов удерживания для трех основных моделей:
Ac-GGGLLLKK-amid, Ac-GLLLLLKK-amid,
Ac-GKKLLLKK-amid
Это дает возможность найти энергии адсорбции остатков аминокислот К, G, L, содержащихся в трех модельных соединениях. Затем, варьированием уже только одной энергии Хг°, из объемов удерживания оставшихся моделей определялись
все остальные энергии. Найденная таким образом шкала энергий, которая является основой для
К Н R N G
0.266 0.386 0.516 0.614 0.656
А Р С Y V
1.143 1.143 1.296 1.686 1.751
Если пептиды имеют другие концевые группы (Н21Ч-, -СООН), то их наличие меняет энергию адсорбции концевых аминокислотных остатков:
= Хк + £н2н-> = + е-соон- Использованные в работе [16] модели У-ОШХКК-г, ще У, Ъ -разные типы концевых групп, без труда позволяют найти еН2ы- = -1.69 и £_соон =
Наконец, активность колонки а определялась из времени удерживания стандарта который был использован в работах [16-19] также для подстройки времен удерживания.
Для начала рассмотрим зависимость объемов удерживания от длины цепи и рассчитаем объемы удерживания пептидов, приведенных в табл. 1 и на рис. 4. Как видно, модель дает правильную зависимость изменения объемов удерживания при увеличении длины цепи и весьма точно описывает экспериментальные данные работы [18] без дополнительных корреляционных коэффициентов, не имеющих физического смысла. Очевидно, что наблюдающаяся нелинейность связана именно с энтропией цепи и вытекает из свойств модели.
X?
2.51-
1.5-
■|И|И|И|Н|И|И|И|И|И|Н|И|И|И|И|И|И<И|И|И|
KHRNGSQDTEAPCYVMILFW
Рис. 3. Диаграмма энергий взаимодействия аминокислотных остатков с поверхностью обращенной фазы -С18. Обозначения аминокислотных остатков соответствуют стандартным.
всех последующих расчетов, приведена ниже и на диаграмме рис. 3.
S Q D Т Е
0.698 0.746 0.781 0.876 0.984
М I L F W
1.822 2.156 2.298 2.319 2.436
Следует сказать, что пептиды, приведенные в табл. 1, - это, фактически, гомополимеры, хотя и со сложной структурой повторяющейся единицы. Поэтому для них, как и для обычных гомополи-меров, должны существовать критические точки, в которых зависимость времен удерживания от длины исчезает. Для примера мы рассчитали критический состав воды и ацетонитрила, вблизи которого для этих пептидов должна пропадать зависимость разделения от длины цепи: NCT = 29.5 об. % В (1-6), 32.5 об. % В (7-11), 48.5 об. % В (12-17), 61.0 об. % В (18-20). Экспериментальное исследование адсорбционного перехода для этих пептидов и обнаружение критических точек, в которой исчезает зависимость от длины цепи, может служить серьезным дополнительным аргументом в пользу предлагаемой модели и ее физической сущности. Кроме того, такое исследование позволяет определить энергию взаимодействия концевых групп Ас- и -amide. Мы положили значение этой энергии равным нулю, что может быть не совсем верно. С другой стороны, отклонение наблюдаемых зависимостей от предсказаний теории позволит понять, в каких направлениях она должна быть усовершенствована.
На рис. 5 показано изменение объемов удерживания стандартов Sj-S5 (табл. 2) при изменении наклона градиента. Общая формула стандартов S2-S5 следующая: Ac-RGXXGLGLGK-amid. Остатки XX в общей формуле есть GG в стандарте S2, AG (S3), VG (S4) и VV (S5). Стандарт St имеет ту же последовательность, что и S3, однако вместо концевой группы Ас- у него концевая группа H2N-.
Очевидно, что уменьшение наклона градиента увеличивает объемы удерживания. Как видно, и в этом случае имеем качественное согласие теории с экспериментом [17].
На рис. бив табл. 3 представлены результаты расчета и экспериментальные данные для ряда
Таблица 1. Расчетные и наблюдаемые [18] времена удерживания синтетических пептидов разной длины на обращенной фазе -С18, (а = 1.092)
Пептид, № Строение пептида ^набл ' мин 0? ' "теор мин
1 Ас-(СКС1ХЗ) 1-аш1ёе 10.0 6.8
2 Ас-(ОКСЬС)2-а1шёе 16.6 15.2
3 Ас-(СКСЬС)4-агшёе 21.9 22.8
4 Ас-ЧСКСЬО^-апиёе 24.4 25.5
5 Ас-(СКСЬС)8-аш1ёе 26.6 27.1
6 Ас-(СЖСЬС) 10-агшёе 27.8 28.1
7 АсКСЬв АКв ДвУв) !-а1шёе 16.1 17.5
8 Ас-(С1ХгАКСАСУС)2-аггиёе 22.1 25.3
9 Ас-(СЬСАКСАСУ03-а1шёе 25.1 28.2
10 Ас-(СЬСАКСАСУС)4-агшс1е 26.8 29.7
11 Ас-(СЬСАКСАСУС)5-агшс1е 28.0 30.7
12 Ас-(1ХгЬКА) ^агшёе 18.3 15.7
13 АсЦ1ЛЗЬКА)2-апис1е 29.7 31.0
14 Ас-(ЬСЬКА)4-агшс1е 39.9 40.3
15 Ас-(ЬСЬКА)6-а1Ш<1е 44.6 43.7
16 Ас-(1Х}ЬКА)8-апи<1е 48.4 45.4
17 Ас-(1Х1ЬКА) 10-апи(1е 56.0 46.4
18 Ас-(1ХЗЬКЬ) 1-аш1ёе 25.2 22.8
19 Ас-(ЬСЬКЬ)2-агшс1е 38.5 40.6
20 Ас-(1ХтЬКЬ)4-апи(1е 49.8 50.8
пептидов, взятых из работы [17]. Для этих соединений согласие теории и эксперимента хуже, и наблюдается определенный разброс, который связан в том числе и с тем, что мы не учитывали различия в активности поверхности для разных колонок. По-видимому, авторы работы [17] проводили такую коррекцию по стандарту 84, однако первичная информация о времени удерживания
такого стандарта, необходимая для определения активности, в работе не приводится. Тем не менее, даже без стандартизации колонок и условий разделения для всех случаев модель правильно описывает тенденции и масштаб изменения объемов удерживания при изменении последовательности цепи пептида.
Отметим, что пептиды, исследованные в работе [17], дают возможность оценить зависимость времени удерживания от слабой "дефектности" последовательности (перестановки нескольких остатков в цепи). В частности, пептидами с переставленным остатками являются следующие пары образцов: (20, 22), (39, 42), (40, 41), (35, 44) и (45, 46). Любой вариант аддитивной модели дает одинаковый объем удерживания для указанных пар. Напротив, предлагаемая нами модель даже для коротких цепей предсказывает небольшие различия во времени удерживании, связанные с перестановкой остатков (слабыми различиями в "текстах"). Масштаб этой зависимости определяется как конкретной последовательностью, так и типом "переставляемых" остатков, но важно отметить сам факт того, что модель "видит" перестановку.
Экспериментальное разделение последовательностей с переставленными аминокислотами должно наблюдаться только для пары (20, 22). Это не удивительно, поскольку перестановки в данной паре "разрушают" блок сильно взаимодействующих остатков Ь. Для других пар разделение в экспериментальных условиях работы [17] невозможно. Вместе с тем предсказываемые небольшие различия во временах удерживания пептидов коррелируют с наблюдаемыми временами удерживания. Наконец, следует отметить, что невозможность разделения пар не является принципиальной: изменяя градиент или проводя хрома-тографирование в изократическом режиме, можно добиться их разделения. Например, при
Таблица 2. Расчетные времена удерживания синтетических пептидов на обращенной фазе -С18 (а = 1.06)
для разного градиента состава растворителя
V, об. % В/мин 81 Эз
4 6.9 7.2 7.6 8.2 9.3
2 9.6 10.3 11.1 12.2 14.4
1 13.7 15.1 16.7 18.8 23.2
0.5 19.6 22.5 25.5 29.6 38.0
_|_I_I-1-1_
10 30 50
N
Рис. 4. Зависимость объема удерживания от длины цепи пептидов. Точками обозначены экспериментальные значения [18], кривыми - расчетные для структур 1-6 (/), 7-11 (2), 12-17 (3), 18-20 (4) (табл. 1).
уменьшении наклона градиента В до 0.25 об. % В/мин расчетный объем удерживания пары (39, 40) становится соответственно 38.2 и 37.1 мл, что может оказаться вполне достаточно для их разделения.
Таким образом, предложенная модель разделения пептидов, учитывающая связанность звеньев в цепь, в общем правильно и непротиворечиво описывает совокупность экспериментальных данных работ [16-19]. В отличие от альтернативных подходов, эта модель основана на простой физической картине адсорбции макромолекул, имеющей весьма надежное экспериментальное обоснование в хроматографии синтетических полимеров. Как и в случае с синтетическими полимерами, модель правильно схватывает суть явления и при корректном определении феноменологических параметров впервые дает возможность оценить времена удерживания пептидов, различающихся расположением звеньев в цепи, и осуществить выбор оптимальных условий разделения, необходимых для "чтения" аминокислотных последовательностей.
Примем, что предложенная модель соответствует действительности, и рассмотрим, как тонкие различия в первичной структуре пептидов могут проявляться в хроматографии.
Уц
05 ¿0 Й ¿0 1 /у, (об. % В/мин)"1
Рис. 5. Зависимость объема удерживания от наклона линейного градиента бинарного растворителя вода-ацетонитрил для стандартов 8^85 (табл. 2). V- скорость изменения компонента В.
В качестве первого примера возьмем так называемые перевернутые, зеркальные последовательности ОЕАОА1ЖХОСОУ1УТАО и ОАТУ-1УСЮВЬ>П_АЕ>АЕО. Очевидно, что разделение таких последовательностей не следует из аддитивной модели (15). Не вытекает оно и из предлагаемой нами модели. Однако, если эти последовательности содержат разные концевые группы, отличающиеся энергией взаимодействия с поверхностью (например, ГШ2----агшс!е), то картина полностью меняется. Наша модель предсказывает разделение указанных выше последовательностей, отличающихся перестановкой концевых групп.
Различие во взаимодействии зеркальных последовательностей с переставленными концевыми группами есть следствие связанности аминокислотных остатков в цепь. Концевая группа меняет условия взаимодействия с поверхностью не только крайних звеньев, но в том числе и удаленных по цепи аминокислот. Поскольку в зеркальных последовательностях концевая группа Н2И-находится в разном окружении аминокислотных остатков, ее вклад в общую энергию взаимодействия пептидов оказывается различным.
Проанализируем этот вопрос количественно. На рис. 7а показан энергетический профиль "текста" рассматриваемых зеркальных пептидов. Перестановка концевых групп приводит к неболь-
эксп> мин
22
18
14
30
20
10
- (а)
Л2 = 0.9635
(б)
10 20
расчет' мин
30
Рис. 6. Корреляция между расчетными и экспериментальными [17] временами удерживания стандартов пептидов Б^з (а) и пептидов (б) (табл. 3).
шой разности объемов удерживания АУЛ = 0.3 мл, достаточной для ее экспериментального обнаружения на современных высокоэффективных колонках. Очевидно, что различие в удерживании связано с асимметрией энергетического профиля правой и левой части "текста". Если переставить аминокислотные остатки и увеличить асимметрию энергетического профиля (рис. 76), то перестановка концевых групп приведет к заметно большему различию во времени удерживания зеркальных "текстов", АУК = 1.1 мл. Напротив, симметризация профиля (рис. 7в) делает перестановку концевых групп в зеркальных последовательностях незаметной, АУК = 0.08 мл. В вырожденном случае однородного гомополимера перестановка концевых групп, очевидно, не влияет на объем удерживания.
Рассмотрим теперь пептиды, содержащие остатки лейцина Ь и изолейцина I. Такие пептиды
2.5 г
1.5
0.5
2.5
1.5
0.5
2.5
1.5
0.5
(а)
1
СЕАОАЬЫЬЬОССУIУ Т А в
(б)
к
ОЕАОАТЫЬЬОССУ I У Ь АО
(в)
1
1
1
СЕТБАЬ УСЮЮУ I АКАС
Рис. 7. Энергетический профиль пептида ОЕАОАЬНШХЮУПГГАО (а), и результат перестановки аминокислотных остатков, приводящей к асимметричному (б) и симметричному (в) профилю.
характеризуются тем, что современные методы масс-спектрометрии из-за одинаковой массы изомеров не позволяют их идентифицировать ни по макромолекулярному иону, ни по спектрам фрагментации. Вместе с тем хроматография дает возможность разделять такие макромолекулы. В качестве примера рассмотрим стандарт 85 с текстом Ас-ЯОУУСЬОЬСК-агтс1е и заменим последовательно все остатки лейцина Ь на изолейцин I. Теория предсказывает разделение таких последовательностей в градиенте с наклоном 0.5 об. % В/мин (рис. 8).
Исследуем, до какой степени предложенная модель может использоваться для "чтения тек-
Таблица 3. Расчетные и наблюдаемые [17] времена удерживания синтетических пептидов разной длины и последовательности, а также с различными концевыми группами на обращенной фазе -С18 (а = 1.0)
*
н Строение пептида ^набл ' Ь » "теор
в <и Е МИН МИН
10 Н2М-(РРСЬМ)-апис1е 20.28 18.20
11 Ас-(КСЬСЬК)-агшс1е 14.64 9.94
20 Ас-(К01ХиЖ)-а1тс1е 23.93 18.94
21 Ас-(КК1ХЬКК)-апис1е 20.73 15.62
22 Ас-(К1Х1ЬСЬК)-а1тс1е 21.67 17.66
23 Н2Ы-(0¥МС\Ш0Р>-0Н 26.78 25.40
24 АсЧТОЬЬАСЮКЬапиёе 13.99 16.68
25 Н2МЧТОЬЬАООКЬаш1ёе 4.68 11.71
26 Ас-(Т1Х}ЬАСКЖ)-апш1е 4.57 9.90
27 Ас-ЧОАКЬЕАКСЬаппёе 6.08 10.03
28 Ас-(ТВЬЬСКХЖ)-агшс1е 12.87 14.63
30 Н2М-(НКТ05РУСЬМ>-а1тс1е 14.91 21.63
31 Н^-фМНОРРУСЬМЬагшёе 29.75 31.13
32 Н2^У0ААГОУ1Ш)-ОН 17.06 20.48
33 Н2Ы-ЧНРКР0дрРОЬМЬапис1е 26.03 26.20
34 Н2М-(ОУРК81Х5РУОЬМЬат1ае 22.36 24.90
35 Ас-(СКРКСРРЬЯКУК)-а1Шс!е 16.16 18.31
36 Н2Ы^<ЗСРККРРЬККУКЬапп<1е 14.18 15.92
37 Ас-(СКРККРРии1УК)-а1Шс1е 15.94 17.90
38 АсЧСКОККРРЬ1Н1УК)-а1т(1е 10.03 13.53
39 АсЧСКРС1*РР1.ККУК)-апи<1е 16.02 19.03
40 АсНСКРККСРитУЯЬахшёе 14.63 16.42
41 Ас-ССКРККРСЬЫкУЯЬапнёе 14.55 16.33
42 АсЧтеРККРРЬКЯТОЬапиёе 16.01 18.93
43 АсЧСКРККРРСКаУКНнтёе 11.12 12.81
44 Ас-(СКРККРРиШУЯ)-агтс1е 15.73 18.32
45 АсЧОКРККРРиЖУЯ)-а1шс1е 16.01 18.33
46 Ас-(СКРККРРи*ЯУС)-аггис1е 15.59 18.27
47 Ас-(ОКРККРРЬКЕОК)-ат1ёе 12.89 14.94
48 Ас-(У8КТдТ8дУАРАЬат1ёе 12.76 16.92
49 Ас-(У8КТЕТ80УАРАЬат1ёе 13.07 17.58
50 Ас-(У8КТАТ80УАРА)-ат1ёе 15.51 18.04
51 Ас-(А8КТЕТ80УАРА)-ат1ёе 10.72 15.98
52 Ас-ф!ШАЕСУтАЕЕЬ)-а1Шс1е 25.67 24.35
53 АсЧШМАНС¥ГОАЕЕЬ)-апи<1е 23.85 23.05
54 АсЧтОАЕЮУГОАЕЕЬЬапиёе 24.72 23.85
55 АсЧОКОАШУГОАЕЕ^апиёе 24.98 24.16
56 АсЧ8О0ЕККК01А8УКСЬ)-ат1ёе 15.47 17.96
57 H2N-(AGCKNFFWKTFTSC)-OH 26.03 28.15
58 Ас-(САКЬЕАКС)2-агшс1е 14.40 18.87
Примечание. Номера пептидов взяты из работы [17'
ста" пептида. Определим, как объем удерживания зависит от всевозможных перестановок аминокислотных остатков в цепи полипептида. Снова возьмем стандарт 85 и найдем, насколько плотно разные последовательности цепей с одним и тем же аминокислотным составом распределены по объему удерживания.
Стандарт 85 состоит из N = 10 аминокислотных остатков общей формулы С4Ь2У2КЯ. Такая структура может образовать следующее количество разных последовательностей:
л'
= 37800
ГЬ!
с
Применяя уравнения (13) и (14) ко всем "текстам", можно определить для каждого из них объем удерживания. При стандартном градиенте 1 об. % В/мин объем удерживания распределен в интервале от УЕт1п = 8.56 мл до УКтах = = 9.88 мл. Максимальной величине соответствует структура ККОСКЮУЬЬУ, а минимальной -иЮУСЮУОКЬ.
Плотность распределения последовательностей стандарта 85 представлена на рис. 9. Как видно, это распределение в интервале от УКт{п до УКтах очень неравномерно, что очевидно. Редко встречающиеся последовательности, в которых
"сильные" остатки Х(° > 1 (правая половина диаграммы на рис. 3) образуют блоки, имеют заметно большие времена удерживания, чем последовательности, в которых "сильные" и "слабые" < 1 остатки (левая половина диаграммы на рис. 3) перемешаны по цепи. В целом область распределения последовательностей по объему удерживания заметно больше, чем типичная ширина хроматографического пика для колонки с эффективностью = 5000. Таким образом, точное определение времени удерживания значительно сокращает число возможных последова-тельносгей-"кандидатов". Однако количество таких последовательностей все-таки остается достаточно большим, что не дает возможности "прочитать текст" и однозначно определить последовательность искомой цепи 85. Для этого необходимо дополнять хроматографические измерения данными масс-спектрометрии.
Рис. 8. Теоретические хроматограммы пептида 85, Ас-1ШУУСЬСЬСК-агшс1е (7) и пептида, в котором лейцин Ь заменен на изолейцин I (2), демонстрирующие возможность их разделения в градиенте с наклоном 0.5 об. % В/мин.
Экспериментальная проверка следствий предложенной модели, а также ее интеграция с масс-спектрометрическими базами данных макромо-лекулярных ионов и их фрагментов для "чтения" последовательностей будут представлены в следующей части работы.
ОБСУЖДЕНИЕ МОДЕЛИ
Кратко обсудим некоторые особенности предложенной модели, границы применимости и возможные пути ее усовершенствования.
Простота модели и ее практической реализации для предсказания объемов удерживания связаны с пренебрежением взаимодействия звеньев друг с другом и с молекулами растворителя, т.е. с идеальностью модели адсорбирующейся цепи. Ясно, что такое упрощенное представление предназначено в первую очередь для примерной оценки эффектов связывания аминокислотных остатков в цепь. Вместе с тем это приближение достаточно хорошо согласуется и с корреляционной теорией определения эффективной энергии, в которой также пренебрегается взаимодействиями в растворе. Можно сказать, что обе части модели оказываются приближениями одного порядка. Усложнение какой-то одной из этих частей без
V*
Рис. 9. Плотность распределения последовательностей р по объему удерживания. VR -удерживаемый объем "искомой" первичной последовательности, A V^- ширина пика на полувысоте; в области 2AVr содержится порядка 800 вариантов последовательностей.
соответствующего усложнения другой вряд ли оправдано, а последовательное введение взаимодействий в растворе приведет (даже в рамках численного моделирования) к заметному усложнению расчетов и (что более важно) к усложнению экспериментального определения возникающих дополнительно феноменологических параметров.
Сказанное выше относится и к макромолекулам синтетических полимеров, однако, как показывает накопленный экспериментальный опыт, излишняя детализация и усложнение модели разделения за счет взаимодействий в растворителе пока не оправданы. Введение критической точки адсорбции как стандартного состояния корреляционной теории и перенормировка эффективной энергии взаимодействия расширяют возможности модели адсорбции идеальной цепи и позволяют осуществить достаточно точное описание закономерностей разделения сложных макромолекул гомополимеров и сополимеров.
Другим упрощающим обстоятельством является представление о точечном характере взаимодействия аминокислотных остатков с поверхностью. Для преимущественно гидрофобных взаимодействий остатков с поверхностью -С18 такое приближение, по-видимому, оправдано. Вместе с
\
тем многие остатки содержат ионогенные группы, способные ионизоваться в смеси воды и аце-тонитрила. В частности, в условиях рН 2.0 группы
-Ш2 существуют в форме -МНз, так что взаимодействие этих групп с поверхностью не носит характер гидрофобного и вряд ли локально. Кроме того, в цепи может быть несколько таких групп, и из-за их электростатического отталкивания часть цепи между ними никак не может быть гауссовой и соответствовать цепи случайных блужданий. Цепь между двумя одноименно заряженным остатками скорее должна рассматриваться как полностью вытянутая палочка, адсорбирующаяся на поверхности целиком. Это "улучшает" условия применимости принципа аддитивности, который, как следует из работ [16-19], во многих случаях дает хорошее предсказание для времени удерживания. Такие усложнения необходимо учитывать при рассмотрении реальных пептидов и интерпретации наблюдаемых экспериментально отклонений от предсказаний в рамках преложенной модели. Однако даже в таком случае мы считаем продуктивным использовать модель случайных блужданий в качестве нулевого приближения и рассматривать отклонения на ее фоне.
Что касается других объемных взаимодействий удаленных по цепи звеньев, сблизившихся в результате изгиба цепи и имеющих преимущественно характер отталкивания, то их влиянием, по-видимому, можно пренебречь. Как показывает опыт хроматографического исследования оли-гомеров [10, 11], для цепей со степенью полимеризации менее 100 влияние объемных взаимодействий в хороших растворителях не слишком заметно.
Вместе с тем в пептидах могут существовать и другие объемные взаимодействия, энергия которых по порядку величины близка к химической связи, например, сульфидные мостики ~8-8~. Тогда такая связь в процессе взаимодействия с поверхностью не разрушается и накладывает дополнительные ограничения на реализацию равновесных состояний цепи. Если в цепи имеется один мостик, то ее структура имеет вид цикла размером Ы, к которому "ковалентно" привязаны два хвоста длиной Л^ и Ы2. Предложенную модель можно обобщить и на подобные структуры. В
этом случае статистическая сумма макромолекулы в поре может быть записана в виде
D N N2
Z ~ X UTI ИЧе,)|*><ЧП W(e')P°
к = 1 i = 1 « = 1 1=1
(\к), (к\ соответственно вектор-сголбец и вектор-строка, все элементы которых равны нулю за исключением к-го, равного единице).
В рамках модели никак не учитывается возможное влияние на взаимодействие аминокислотного остатка его ближайших соседей. Например, взаимодействие остатка А "в окружении" остатков Н, ~НАН~, может отличаться от того, которым он обладает в окружении L, -LAL-. Такой учет потребует введения дополнительных поправок к эффективной энергии. Хотя технически это несложно сделать, однако нет оснований вводить поправки без более подробного экспериментального исследования предсказаний модели и ее возможностей для расчета времени удерживания. Возможно, что при более точном сопоставлении теории и эксперимента учет данных поправок будет необходим.
Возможность "чтения текста" аминокислотной последовательности в хроматографии пептидов связана с тонкими эффектами компенсации вблизи поверхности потерь энтропии цепи энергией притяжения. В этом смысле предложенная модель разделения идейно гораздо ближе к критической хроматографии LCCC, нежели к традиционной адсорбционной хроматографии низкомолекулярных соединений. Поэтому естественно называть предложенную модель критической хроматографией биомакромолекул, или BioL-ССС. Такое сокращение предполагается использовать в дальнейшем.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Принципиальным отличием предложенной модели хроматографии пептидов является то, что в ней явным образом учитывается связанность аминокислотных остатков в цепь, т.е. последовательность. Такой подход дает больше возможностей для понимания характера разделения биомакромолекул. Он значительно глубже аддитивного, применяемого для интерпретации хроматограмм пептидов и предсказания их объема удерживания. Эта модель может быть положена в основу хромато-
графии пептидов, а также применена для совместного использования с масс-спектрометрическими базами данных. Модель дает правильное описание разделения пептидов с разными последовательностями в целом, однако в частностях ее предсказания могут отличаться от экспериментально наблюдаемых объемов удерживания. Это связано с идеализацией как модели цепи пептида и ее адсорбции, так и самой хроматографической системы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Лифшиц ИМ. // Журн. эксперим. и теорет. физики. 1968. Т. 55. № 6. С. 2408.
2. Lifshits I.M., Grosberg A.Yu., Khokhlov A.R. // Rev. Mod. Phys. 1978. V. 50. № 3. p. 684.
3. Де Жен П. Идеи скейлинга в физике полимеров. М.: Мир, 1982.
4. Гросберг А.Ю., Хохлов А.Р. Статистическая физика макромолекул. М.: Наука, 1989.
5. DiMarzio Е.А., Rubin R.J. I I J. Chem. Phys. 1971. V. 55. №9. P. 4318.
6. Скворцов A.M., Беленький Б.Г., Ганкина Э.С., Тен-ников М.Б. II Высокомолек. соед. А. 1978. Т. 20. № 3. С. 678.
7. Горбунов A.A., Скворцов A.M. // Высокомолек. соед. А. 1980. Т. 22. № 5. С. 1137.
8. Горшков A.B., Евреинов В.В., Энтелие С.Г. II Высокомолек. соед. А. 1982. Т. 24. № 3. С. 524.
9. Горшков A.B., Евреинов В.В., Энтелие С.Г. // Докл. АН СССР. 1983. Т. 272. № 3. С. 632.
10. Entelis S.G., Evreinov V.V., Gorshkov A.V. // Adv. Polym. Sei. 1986. V. 76. P. 129.
11. Энтелие С.Г., Евреинов В.В., Кузаев А.И. Реакци-онноспособные олигомеры. М.: Химия, 1985.
12. Pasch Н., Trathnigg В. HPLC of Polymers. Berlin; Heidelberg; New York: Springer-Verlag, 1999.
13. Горшков A.B., Евреинов B.B. // 100 лет хроматографии. М.: Наука, 2003. С. 136.
14. Eisenriegler Е., Kremer К., Binder К. // J. Chem. Phys. 1982. V. 77. № 12. P. 6296.
15. Snyder L.R. Principles of Adsorption Chromatography. New York: Marcel Dekker, 1968.
16. Guo D., Mant СЛ., Taneja A.K., Parker J.M.R., Hodges R. И J. Chromatogr. 1986. V. 359. P. 499.
17. Guo D., Mant C.T., Taneja A.K., Hodges R. И J. Chromatogr. 1986. V. 359. P. 519.
18. Mant C.T., Burke L.T.W., Black J.A., Hodges R. // J. Chromatogr. 1988. V. 458. P. 193.
19. Mant C.T., Burke L.T.W., Zhou N.E., Parker R.J.M., Hodges R. II J. Chromatogr. 1990. V. 485. P. 365.
Applicability of the Critical Chromatography Concept to Proteomics Problems: Dependence of Retention Time on the Sequence of Amino Acids
A. V. GorshkoV, V. V. Evreinov®, I. A. Tarasova*, and M. V. Gorshkov*
a Semenov Institute of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, ul. Kosygina 4, Moscow, 119991 Russia
b Institute of Energy Problems of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, Leninskiipr. 38/2, Moscow, 119334 Russia
e-mail: evreinov@polymer.chph.ras.ru)
Abstract—A peptide separation model based on the technique of liquid chromatography of macromolecules at the critical condition was proposed. In terms of this model, the array of experimental data on the separation of peptides is considered. The main phenomenological parameters of the model—effective adsoiption energies of amino acid residues—were determined, thus allowing the influence of character of their alternation in the chain on retention times to be predicted. The model is applicable to investigation into the feasibility of separation in different chromatographic modes of peptides with the same amino acid composition and different sequences of units in the chain, as well as peptides containing amino acid isomers and mirror sequences with different terminal groups.
