CC BY
14
УДК 541.64:543.544
М.Л. Придатченко1,2, И.А. Тарасова1,2, К. Масселон3, А.В. Горшков4,
М.В. Горшков2
1 Московский физико-технический институт (государственный университет)
2 Институт энергетических проблем химической физики РАН 3 CEA, Universite Joseph Fourier, Grenoble, France 4 Институт химической физики им. Н.Н. Семёнова РАН
Единый подход к созданию универсальных баз данных точных масс и времён удерживания пептидных маркеров белков на основе модели критической хроматографии биомакромолекул
Изучена возможность приведения к единой, «независимой» от условий разделения, шкале времён удерживания пептидов, полученных с использованием различных инструментальных ВЭЖХ платформ и протоколов разделения. В частности, была выдвинута и экспериментально подтверждена концепция линейной корреляции хроматографических времён удерживания биомакромолекул, а также были проведены эксперименты по определению диапазона параметров разделения смесей пептидов, в которых линейная корреляция соблюдается. На основе выявленной общей функциональной зависимости между хроматографическими временами удерживания предложена процедура приведения времён удерживания пептидов, измеренных а различных экспериментальных условиях, к единой универсальной шкале нормализованных времён удерживания. Предложенная процедура нормализации была протестирована на экспериментальных данных для сложных протеолитических смесей пептидов. Показано, что получаемая точность совпадения нормализованных времён удерживания в единой шкале составляет порядка 1%, что сравнимо с точностью хроматографических измерений. Предложенный в работе подход может быть использован при создании хромато-масс-спектрометрических баз данных пептидных маркеров белков в задачах «скорострельной» протеомики.
Ключевые слова: протеомика, высокоэффективная жидкостная хроматография, смесь пептидов, хромато-масс-спектрометрические базы данных пептидных маркеров белков.
I. Введение
Х.1. Идентификация пептидов на основе «скорострельной» протеомики
В настоящее время значительная часть исследований в биологии сконцентрирована вокруг новой области — протеомики, целью которой является исследование распределения белков, их взаимодействия и модификации внутри клеток живых организмов. Задачи, решаемые протеомикой, представляют серьезное испытание для исследователей из-за разнообразия и сложности белков и пептидов, содержащихся в биологических системах. Постоянно меняющаяся природа протеома является основной сложностью его анализа: протеомные исследования требуют проведения анали-
за большого количества образцов, полученных для определённых физиологических состояний или в определённых условиях окружающей среды. В свою очередь это диктует и стимулирует основную тенденцию методического развития аналитических технологий в протеомике в сторону повышения скорости и производительности анализа. Хромато-масс-спектромет-рия является одной из «базовых» аналитических технологий, используемых в про-теомных исследованиях, в которых масс-спектрометрия (МС) является основным методом, используемым в протеомике для структурной идентификации биомолекул. Одним из ключевых элементов этой технологии является разделение смесей биомолекул на входе масс-спектрометра. В большинстве протеомных исследований пептидная смесь предварительно разделяет-
ся методами одномерной или двухмерной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для каждого пептида измеряется молекулярный вес, а также молекулярный вес его фрагментов, полученных тем или иным методом тандемной масс-спектрометрии (МС/МС). Полученные данные о массах пептида и фрагментов затем используются в поиске по базам данных белков с целью его идентификации. Следует, однако, отметить, что только от 5 до 15% всех данных, полученных методами тандемной масс-спектро-метрии, дают положительную идентификацию пептидов через базы данных белков. Причинами этого является, во-первых, проблема неточности геномных баз данных, на основе которых производится поиск и идентификации пептидов с последующим использованием полученных данных при создании баз данных ВЭЖХ-МС/МС. Во-вторых, существует проблема неэффективности и неточности методов тандемной масс-спектрометрии, на основе которых производится поиск пептидов по геномным базам данных белков с их последующей идентификацией. Фрагментация методами МС/МС может быть неполной, либо в неправильном месте, либо массы фрагментов будут измерены с недостаточной точностью (например, неправильно идентифицированы мо-ноизотопные пики в масс-спектрах фрагментов пептида). Решение этих проблем видится в интегрировании различных ортогональных методов получения информации о первичной структуре пептидов и, в первую очередь, жидкостной хроматографии. Поэтому буквально в последние несколько лет начали развиваться подходы так называемой «скорострельной» (в англоязычной литературе — shotgun) про-теомики, в основе которых лежит идея использования пептидных маркеров белков. В качестве маркеров могут выступать меченные изотопами пептиды либо пептиды, уникальные для того или иного белка. В последние годы было показано, что, если масса пептида может быть измерена с точностью, достаточной для уникальной идентификации пептида, предсказанного для конкретной геномной последовательности, такой пептид может быть использован как биомаркер соответствующего родительского белка. Это в свою оче-
редь даёт возможность проведения количественной высокопроизводительной идентификации белков на основе хромато-масс-спектрометрических методов анализа без использования рутинных масс-спектрометрических подходов к секвенированию, основанных на фрагментации ионов пептидов. Результатом хромато-масс-спектро-метрического анализа является база данных точных масс для точно определённых пептидных последовательностей и соответствующих им хроматографических времён удерживания. Такие базы данных получили название баз данных точных масс и времён пептидных меток, или маркеров, белков (Accurate Mass and Time, AMT, tags), которые в процессе «простого» (без использования тандемной масс-спектрометрии) хромато-масс-спектромет-рического анализа могут использоваться как биомаркеры на наличие в образце того или иного белка. Создание таких баз данных AMT потенциально позволит количественно идентифицировать тысячи белков за время одного анализа (порядка 1 часа) [1-4]. Несмотря на кажущуюся простоту и даже «тривиальность», развитию метода АМТ и его широкому использованию препятствует тот факт, что в отличие от масс, которые однозначно привязаны к шкале масс элементов, хроматографические данные не универсальны: они зависят от конкретных экспериментальных условий разделения и используемых инструментальных платформ. Поэтому, прежде чем включать хроматографические времена в базу данных АМТ, следует разработать процедуру приведения хроматографических времён удерживания пептидов к единой шкале и сделать их «независимыми» от условий хроматографического разделения. Решение этой задачи было основной целью работы.
I.2. Создание баз данных АМТ: проблема стандартизации времён удерживания
Ранее неоднократно делались попытки введения единой процедуры нормализации хроматографических данных. Например, в работе Петритиса с коллегами из Тихоокеанской северо-западной национальной лаборатории США было предложено нормализовывать экспериментальные времена удерживания приведением их
к отрезку [0; 1] с помощью линейного уравнения у = к • х + т, где коэффициент т отвечает за так называемые «мёртвые» объёмы удерживания, а к — за наклон градиента [5]. При этом сами коэффициенты линейного уравнения авторы предложили находить эмпирически с помощью генетического алгоритма, широко применяющегося, в частности, в биоинформатике. В основе используемого ими генетического алгоритма лежит итерационный процесс оптимизации коэффициентов к и т [6].
Другой подход к нормализации хроматографических времён удерживания также основан на использовании линейного преобразования, коэффициенты в котором вычисляются с помощью выбранного внутреннего стандарта [7]. Причём хроматограмма реального образца делится на временные интервалы по временам выхода пептидов стандарта, и для каждого временного отрезка вычисляются коэффициенты линейного уравнения к и т на основе экспериментальных времён удерживания пептидов внутреннего стандарта. Времена удерживания пептидов, вышедших из колонки в определённом временном интервале, нормализуются в этом интервале с использованием соответствующих калибровочных коэффициентов.
Группа из исследовательского центра рака в Вашингтоне предложила использовать в качестве нормализованных времён удерживания расчётные значения гидро-фобности пептидов [4], обуславливая такой подход линейной корреляцией между гидрофобностью пептидов и их хроматографическими временами удерживания [8].
Следует отметить, что применение всех предложенных до сих пор подходов к стандартизации времён удерживания ограничивается необходимостью придерживаться жёстко заданного экспериментального протокола разделения или определённого, заранее выбранного, хроматографического стандарта — калибранта. Это приводит к тому, что создаваемые таким образом хроматографические базы данных становятся привязанными к конкретным экспериментальным условиям и используемым инструментальным комплексам. Возникает серьезная дилемма: с одной стороны, создание баз данных для протеомов сложных организмов требует одновремен-
ных усилий со стороны разных исследовательских групп и лабораторий в рамках совместных проектов, с другой стороны, не существует в настоящее время общего подхода к созданию баз данных, не привязанных к конкретным экспериментальным условиям. Иными словами, базы данных, особенно в части, касающейся хроматографических времён удерживания, не являются универсальными или переносимыми с одной инструментальной платформы на другую, и становится неясным, каким образом создавать базы данных, в которых заложены хроматографические времена удерживания пептидных маркеров белков. Цель настоящей работы — разработка процедуры нормализации хроматографических времён удерживания при создании баз данных АМТ, позволяющей привести экспериментальные хроматографические данные для пептидов к единой, универсальной шкале времени.
II. Результаты и обсуждение
II.1. Описание экспериментальных условий
Эксперименты по разделению и идентификации индивидуальных пептидов и их смесей проводились на наносистеме Ultimate 3000 (Dionex, США), которая имела в качестве детектора масс-спектрометр на основе линейной радиочастотной ионной ловушки LTQ (Thermo Fisher, Бремен, Германия). Масс-спектрометр был оборудован наноэлектроспреем (Proxeon Biosystems, Оденсе, Дания), позволяющим получать многозарядные макромоле-кулярные ионы, которые затем фрагментировались в ионной ловушке в столкновениях с молекулами буферного газа (CAD). Разделение смесей пептидов производилось при скоростях подачи растворителя в диапазоне от 200 до 400 нл/мин для различных профилей градиента бинарной смеси растворителя вода-ацетонитрил в диапазоне от 0,3%B до 1,7%B в минуту. Время нарастания градиента варьировалось от 30 до 120 мин. Мобильная фаза состояла из двух компонентов: (А) 98% воды, 1,9% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты и (В) 80% ацетонитрила, 19,9% воды, 0,1% муравьиной кислоты.
В работе использовались коммерческие стандарты протеолитических смесей белков: дайджест белка Cytochrome C и дайджест шести белков 6 Protein Mixture, производимые фирмой Dionex/LCPacking (USA).
Для расчётов теоретических времён удерживания нами была использована модель предсказания хроматографических объёмов/времён удерживания биомолекул по их аминокислотной последовательности на основе концепции жидкостной хроматографии в критических условиях [11], реализованная в виде программного обеспечения «Теоретический хроматограф». «Теоретический хроматограф» позволяет предсказывать времена удерживания белков и пептидов в зависимости от их первичной структуры при заданных экспериментальных параметрах разделения: (1) параметры колонки (внутренний диаметр и длина колонки, размер пор, фактор, показывающий долю пространства в колонке, занятую твёрдой фазой); (2) профиль градиента и (3) состав компонентов растворителя. Для расчёта времён удерживания «Теоретический хроматограф» использовались полученные нами ранее [11, 12] эффективные энергии адсорбции для 20 наиболее часто встречающихся природных аминокислот, а также C- и N-концевых групп.
II.2. Концепция линейной корреляции хроматографических времён удерживания
В основе подхода, рассмотренного в данной работе, лежит предположение о линейной корреляции времён удерживания
пептидов, полученных в разных условиях разделения, наиболее широко используемых в протеомных исследованиях. Действительно, если у нас наблюдается линейная корреляция между хроматографическими данными, полученными в различных условиях разделения, то достаточно выбрать определённые условия в качестве стандарта и «привязывать» экспериментальные данные к данным, соответствующим этим стандартным условиям через элементарную процедуру нормировки. Нормализованные таким образом времена удерживания можно вносить в базы данных, поскольку в этом случае пептид А в любых экспериментах будет иметь после нормализации те же абсолютные значения точных времен, что и в базе данных.
Н.Э. Экспериментальная проверка концепции линейности хроматографических данных
Для проверки, насколько применима концепция линейной корреляции экспериментальных хроматографических времён удерживания и определения диапазона экспериментальных параметров разделения, в рамках которых она выполняется, нами был проведён ряд экспериментов по выявлению влияния на времена удерживания следующих параметров разделения: скорость градиента, скорость потока бинарной смеси растворителя, характеристики колонок. Параметры использованных хроматографических колонок и их производители представлены в табл. 1. Влияние указанных параметров также было исследовано с использованием различных хроматографических систем от разных производителей.
Таблица 1
Параметры хроматографических колонок, использовавшихся в экспериментах
Колонка Производитель Фаза i.cl., MKM Длина, MM Размер частиц, MKM Размер nop, Â
1 LC-Parcking PepMap С18 75 150 3 100
2 LC-Parcking PepMap С18 75 250 3 100
3 Waters Atlanties С18 75 150 3 100
4 LC-Parcking PepMap С18 75 150 5 100
5 LC-Parcking PLRP-S 75 150 5 300
6 Merk Si Monolith 100 150 N/A 130
Таблица 2
Коэффициенты линейной корреляции экспериментальных времён удерживания пептидов протеолитической смеси пептидов белка Cytochrome C для различных условий разделения, использовавшихся колонок и протоколов
Наклон градиента
1,7% R /мин 1,2%!?/мин 1,4% R /мин 0,8%-В/мин 0,4%!?/мин 0,3%-В/мин
Колонка 1 0,992 0,998 0,998 0,997 0,995 0,988
Скорость потока растворителя
200 нл/мин 300 нл/мин 400 нл/мин
0,8%В/мин 0,998 0,998 0,997
Колонка
1 2 3 4 5 6
1,7%В/мин 0,994 0,994 0,978 0,992 0,974 0,990
0,3%В/мин 0,988 0,992 0,966 0,990 0,967 0,988
120 гг 100 80
• Пептиды дайджеста белка Cytochrome с
• Пептиды дайджеста 6 белков стандарта
ф
Б
г
о
X
N
о
m
60
40
20
0
20
40
60
80
R2 = 0.99
100
120
RTexp, мин (ВЭЖХ система 1)
Рис. 1. Линейная корреляция времён удерживания пептидов протеолитического дайджеста белка Cytochrome C и коммерческого стандарта, состоящего из 6 белков, полученных в различных лабораториях для различных экспериментальных условий и протоколов разделения. Система 1: градиентный ВЭЖХ хроматограф Agilent 1200 с колонкой на обращенной фазе (ИНЭП ХФ РАН, Москва). Система 2: градиентный ВЭЖХ хроматограф Dionex Utlimate 3000 с колонкой на обращенной фазе (CEA, Гренобль). Для обеих систем использовались различные протоколы разделения, отличающиеся как профилем градиента, так и составом бинарной смеси растворителей
На рис. 1 представлен пример корреляции между хроматографическими временами удерживания, полученных в разных лабораториях для протеолитических смесей пептидов белка Cytochrome C и стандартного набора 6-ти белков. В табл. 2 суммированы результаты измеренных коэффициентов линейной корреляции для различных протоколов и параметров разделения. Как видно из представленной таблицы, наблюдается высокая линейная корреляция между экспериментальными
данными, что подтверждает изначальное предположение о «линейности» хроматографических данных. Следует отметить, что выбранные нами протоколы и параметры разделения охватывают практически весь диапазон экспериментальных параметров, используемых в современных протеомных исследованиях при решении задачи идентификации и количественного анализа белков на основе хромато-масс-спектрометрии и протеомных баз данных. Осталось только понять, всегда ли при-
менима концепция «линейности» хроматографических данных для пептидов. На первый взгляд, концепция линейности выглядит тривиальной. Действительно, если обратиться к базовому уравнению жидкостной хроматографии:
К
удерживание
К
мертвый
объем + KD ■ ^обьЄм
пор;
где Ко — хроматографический коэффициент распределения, то, поскольку Ко пропорционален энергии адсорбции и не зависит от условий разделения (для одной и той же кислотности и ряда других химических свойств бинарной смеси растворителя), линейность между временами удерживания должна всегда наблюдаться. Однако это упрощённый взгляд на природу разделения пептидов, который исхо-
дит из представления о чисто адсорбционном механизме разделения по аналогии с разделением низкомолекулярных соединений. Вместе с тем ранее нами было показано [11-13], что разделение пептидов нельзя рассматривать по аналогии с разделением низкомолекулярных соединений, поскольку для них, как и в случае макромолекул, существуют три режима разделения в зависимости от хроматографических условий: адсорбционный (разделение идёт через механизмы адсорбции), эксклюзион-ный (определяемый энтропийными факторами) и переходный, критический (между эксклюзией и адсорбцией). В зависимости от режима разделения в случае пептидов наблюдается изменение порядка выхода из хроматографической колонки.
а)
TGPNLHGLFGR
25.68
MIFAGIK
:053 266 3.J9 4SJ 5ГІ 834 149 1Ш 1170 13.33 1668 1762 19 34 21 04 2217 2114 ■ ' і 1 і і ‘і 1 і і і 1 і ■' і 1 ' ■ і 1 ' ' і 1 ' і і 1 і ' ' 1 ' ' 'I ' ! 'I ' ' 1 1 і і і 1 ' і 'і ,27tl j;u MIS 3, Гб 3!И Зі 18 37.5! 3S.SI 1> ' 1 '
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
Tim« (mtn)
б)
Рис. 2. Изменение порядка выхода пептидов, имеющих близкие времена удерживания, при изменении условий градиентного элюирования. Хроматограммы пептидов TGPNLHGLFGR и MIFAGIK, полученные при изменении наклона градиента с 1,7%В/мин (2а) на 0,3%В/мин (2б)
На рис. 2 приведён пример, полученный нами для протеолитической смеси пептидов белка Cytochrome C, который иллюстрирует обозначенную выше проблему. Пептиды TGPNLHGLFGR и MIFAGIK из этой смеси имеют близкие значения времён удерживания. При изменении скорости градиента меняется порядок выхода этих пептидов из хроматографической ко-
лонки. Это наглядный пример проявления «макромолекулярной» сущности поведения биомолекул в условиях хроматографического разделения на обращенной фазе. При быстром градиенте разделение пептидов идёт в эксклюзионном режиме и время удерживания определяется не адсорбцией пептидов (как в случае медленного градиента), а длиной аминокислотной
последовательности пептидов. В результате более длинный пептид TGPNLHGLFGR выходит раньше, несмотря на то, что его адсорбционные свойства выше, чем у более короткого пептида MIFAGIK. Таким образом, проблема линейности между экспериментальными хроматографическими временами удерживания для пептидов не является тривиальной и требует дальнейших систематических исследований. На основе полученных данных мы можем только констатировать тот факт, что в широком диапазоне и, что особенно важно, в пределах экспериментальной ошибки измерения времён удерживания пептидов в современной хроматографии концепция «линейности» соблюдается. Это позволяет утверждать о возможности введения единой (с точки зрения протоколов разделения или используемых хроматографических систем) шкалы времён удерживания, или, точнее, нормализованных времён удерживания, на основе простых линейных соотношений. Таким образом, задача сводится к нахождению процедуры такой нормализации, которая позволит избежать ограничений чисто эмпирических подходов, упомянутых выше, и при этом решить проблемы, связанные с изменениями порядка выхода пептидов при изменении экспериментальных параметров, пример которых представлен на рис. 2.
11.4. Модель ВюЬССС как основа единой шкалы времён удерживания
Для решения проблемы нормализации экспериментальных данных при создании баз данных пептидных маркеров белков нами предлагается использовать методы предсказания теоретических времён удерживания в зависимости от аминокислотных последовательностей пептидов и конкретных условий разделения. В основе предлагаемого подхода лежит ранее предложенная нами модель хроматографического разделения пептидов В1аЬССС, развитая на основе критической хроматографии биомакромолекул [11-13]. Модель В1аЬССС позволяет однозначно предсказывать времена удерживания пептидов в зависимости от их аминокислотной последовательности, наличия и локализации по-сттрансляционных модификаций, а также в комбинации с масс-спектрометрией
высокого разрешения определение неизвестных последовательностей (секвениро-вание de novo) [14]. Используя теоретическое предсказание времён удерживания для выбранного пептидного стандарта (например, протеолитическая смесь пептидов белка Cytochrome C), можно ввести новую шкалу времени, в которой экспериментальные значения времён удерживания исследуемых пептидов будут иметь одни и те же (для одних и тех же пептидов) нормализованные времена. В основе предлагаемой процедуры нормализации лежит рассмотренное выше предположение о том, что хроматографические данные, полученные для одних и тех же образцов на различных хроматографических системах с использованием различных хроматографических колонок, состава мобильной фазы и профиля градиента, линейно коррелируют, то есть для одного и того же пептида
ЯТэксп. 1 а ■ RT3Kcn. 2 + Ь.
Дальнейшее построение шкалы нормализованных времён делается следующим образом: выбирается пептидный стандарт, для которого рассчитываются теоретические значения времён удерживания в условиях единого, заранее определённого протокола разделения («базисный» протокол). Далее теоретические времена удерживания для пептидов стандарта нормализуются в диапазоне [0; 1], где время удерживания для наиболее гидрофобного пептида стандарта выбирается равным 1,0 (в принципе приведение шкалы времени в отрезок [0; 1] необязательно, однако представляется более удобным с точки зрения общности шкалы). Подставляя в линейное уравнение экспериментальные и теоретические значения времён удерживания RTsti для пептидов стандарта, определяются калибровочные коэффициенты:
RTst,г(теор. норм.) а ■ RTst,г(эксп.) + Ь.
Используя полученные калибровочные коэффициенты а и Ь, все экспериментальные времена RTexp, г для исследуемых пептидов переводятся в новую шкалу нормализованных времён с помощью опять же линейного уравнения
RTexp,г(норм.) а ■ RTexp,г(эксп.) + Ь.
Рассмотренная процедура нормализации схематически представлена на рис. 3.
Ясно, что поскольку шкала времени привязана к теоретическим временам удерживания стандарта в одних и тех же условиях разделения, то после нормализации экспериментальные времена удерживания пептидов, полученные в различных условиях разделения, при использовании различных профилей градиентов и разных хроматографических систем, становятся едиными для всех пептидов. Предложен-
Таблица
Сравнение экспериментальных времён удерживания пептидов TGPNLHGLFGR и М1ЕЛС1К с предсказанными на основе разработанной авторами модели BioLCCC для различных
профилей градиента
ная процедура аналогична процедуре калибровки в масс-спектрометрии, при которой измеряемые физические величины (например, циклотронные частоты в масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса, или времена пролёта во время-пролётных масс-спектрометрах) привязываются к единой шкале масс на основе углерода 12 С.
3
Градиент от 0 до 50%В в течение 30 минут Градиент от 0 до 35 %В в течение 120 минут
Пептид ТСРКШСЬЕСК МШАСЛК ТСтРКШСГГСК МШАСЛК
КТгхр. МИН 20,31 20,64 64,89 61,45
ИТтеор, мин 20,37 21,31 64,8 60,45
Нормализация времен удерживания образца:
КТ|П0ГП,=а(НТ®‘:Р}+Ь
Рис. 3. Схематическое представление предложенной в работе процедуры нормализации экспериментальных хроматографических данных для пептидов на основе модели ВюЬССС
Очевидно, что для предложенной процедуры нормализации пептиды, меняющие свой порядок выхода из колонки, представляют определённую сложность: никаким линейным преобразованием времён удерживания мы не получим инверсии порядка выхода пептидов при изме-
нении протокола элюирования. Использование модели BiсLCCC для предсказания времён удерживания позволяет решить эту проблему. Действительно, поскольку модель ВкТССС основана на «макромоле-кулярном» представлении о процессе разделения пептидов в условиях градиентного элюирования, эта модель является на сегодняшний день единственной, учитывающей переход от адсорбционного к экс-клюзионному режиму разделения для пептидов. В табл. 3 представлены результаты расчёта теоретических времён удерживания для пептидов TGPNLHGLFGR и MIFAGIK из рассмотренного выше примера инверсии выхода при изменении скорости нарастания градиента (рис. 2). Как видно из этой таблицы, модель BiсLCCC не только правильно предсказывает порядок выхода указанных пептидов, но и даёт правильные количественные оценки изменения абсолютных значений времён выхода для конкретных хроматографических условий. Для решения проблемы инверсии в задаче нормализации времён удерживания можно предложить следующий подход: с помощью модели BiсLCCC проверяется наличие инверсии порядка выхода близких по удерживанию пептидов при переходе от реального хроматографического протокола к «базисному», в котором создаётся единая шкала нормализованных
Определение коэффициентов прямой: у=ах+Ь
времен. В случае обнаружения такой инверсии данным пептидам приписываются теоретические нормализованные времена удерживания, которые и используются в дальнейшем при создании баз хроматографических данных.
II.5. Экспериментальная проверка нормализации времён удерживания пептидов на основе модели BioLCCC
Экспериментальная проверка предложенной процедуры нормализации осуществлялась на примере протеолитиче-ской смеси белка Cytochrome C, который нами был выбран в качестве стандарта. В этом смысле полученные данные можно рассматривать как аналогию определения точности калибровки масс-спектрометров на основе сравнения экспериментальных и теоретических масс веществ калибранта после калибровки. В табл. 4 представлены результаты обработки и нормализации времён удерживания пептидов
дайджеста, полученные в результате измерений, проведённых при использовании различных хроматографических систем и протоколов разделения. В качестве «базисного» протокола нами был выбран так называемый протокол Pilot, предлагаемый фирмой Dionex/LCPacking: 60 мин градиент со скоростью нарастания градиента
0,8%В/мин, в бинарной смеси вода ацетонитрил (фаза А 98% вода /2% ацетонитрил; фаза В 20% вода /80% ацетонитрил) с кислотностью растворителя pH = 2, пропускаемой через капиллярную наноколонку (75 мкм внутренний диаметр, 150 мм длина) на обращенной фазе Ci8 со скоростью потока 300 нл/мин. Полученные предварительные данные свидетельствуют о том, что предложенная процедура нормализации хроматографических времён удерживания пептидов позволяет получать универсальные времена удерживания с точностью порядка 1-2%, что сравнимо с точностью хроматографических экспериментов.
Таблица 4
АМТ базы данных для протеолитической смеси белка Cytochrome C
№ Последовательность М m/z (I) (П) (III) Ср. зн.
1 KYIPGTK 805,5 403,8 0,3532 0,3540 0,3692 0,3588
2 YIPGTK 677,4 678,4 0,3883 0,3853 0,3804 0,3847
3 IFVQK 633,4 634,4 0,4199 0,4176 0,4010 0,4128
4 KTGQAPGFSYTDANK 1583,8 528,9 0,4821 0,4949 0,5053 0,4941
5 TGQAPGFSYTDANK 1455,7 729 0,5520 0,5469 0,5611 0,5533
6 KGEREDLIAYLK 1433,8 479,1 0,6382 0,6399 0,6708 0,6496
7 TGPNLHGLFGR 1167,6 390,4 0,6694 0,6767 0,6557 0,6673
8 MIFAGIK 778,4 390,3 0,6850 0,6859 0,6562 0,6757
9 EDLIAYLK 963,5 482,9 0,7989 0,7817 0,7692 0,7833
10 IFVQKCAQCHTVEK 1632,8 545,5 0,8408 0,8439 0,8861 0,8569
11 GITWGEETLMEYLENPKK 2137 713,7 0,9326 0,9464 0,9581 0,9457
12 GITWGEETLMEYLENPK 2008,9 1005,7 1,0185 1,0079 1,0131 1,0132
Полученные нами времена удерживания нормализованы по предложенной в работе процедуре, основанной на использовании модели критической хроматографии биомакромолекул ВюЬССС. Нормализованные времена удерживания представлены в колонках (I) — (III), соответствующих различным условиям градиентного элюирования: (I) 4-50%В в течение 60 мин, (II) 0-50%В в течение 30 мин, (III) 0-35%В в течение 120 мин. Средняя ошибка нормализованных времён (отклонение нормализованного времени от среднего для каждого из пептидов), полученных для различных экспериментальных условий, составляет около 1%
III. Благодарности
Работа была выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (РФФИ, грант 08-04-01339 и 08-04-91121-АФГИР), Международной ассоциации (INTAS, грант Genomics 05-10000004-7759) и Отделения химических наук и материалов РАН (программа ОХНМ 4.2 «Создание эффективных методов химического анализа и исследования структуры веществ и материалов»).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Conrads T.P., Anderson G.A.,
Veenstra T.D., Pasa-Tolic’ L., Smith R.D. Utility of Accurate Mass Tags for Proteome-Wide Protein Identification // Anal. Chem. — 2000. — N. 72.
P. 3349-3354.
2. Norbek A.D., Monroe M.E.,
Adkins J.N., Anderson K.K., Daly D.S.,
Smith R.D. The Utility of Accurate Mass
and LC Elution Time Information in
the Analysis of Complex Proteomes //
Am. Soc. Mass Spectrom. — 2005.
3. Kieffer-Jaquinod S., Gorshkov A.V.,
Gorshkov M.V., Court M., Brugiere S., Bruley C., Ferro M., Garin J.,
Masselon C.D. Proteomic biomarkers discovery using the Accurate Mass and Time Tags approach // 23rd LC/MS Montreux Symposium, Montreux, Switzerland. — 2006.
4. May D., Fitzgibbon M., Liu Y.,
Holzman T., et al. A Platform for
Accurate Mass and Time Analyses of Mass Spectrometry Data // Journal of Proteome Research. — 2007. — V. 6. -P. 2685-2694.
5. Petritis K., Kangas L.J.,
Ferguson P.L., et al. Use of Artificial Neural Networks for the Accurate Prediction
of Peptide Liquid Chromatography
Elution Times in Proteome Analyses // Anal. Chem. — 2003. — N. 75.
P. 1039-1048.
6. Falkenauer E. Genetic Algorithms and Grouping Problems. — Chichester, England: John Wiley & Sons Ltd, 1997.
7. Sapirstein H.D., Scanlon M.G.,
Bushuk W. Normalization of HighPerformance Liquid Chromatography
Peak Retention Times for computerized comparison of Wheat prolamtn chromatograms // J. Chromatography A. — 1989. — V. 469. — P. 127-135.
8. Krokhin O.V., Craig R., Spicer V., et al. An Improved Model for Prediction of Retention Times of Tryptic Peptides in Ion Pair Reversed-phase HPLC // Molecular & Cellular Proteomics. — 2004. — N. 3. — P. 908-919.
9. Meek J.L., Rossetti Z.L. Factors affecting retention and resolution of peptides in high performance liquid chromatography // J. Chromatogr. — 1981. — V. 211(1). — P. 15-28.
10. Riddle L.A., Guiochon G.
Influence of Mobile Phase Gradients on the Retention and Separation of Peptides from a Cytochrome-c Digest by Reversed-Phase Liquid Chromatography // Chromatographia. — 2006. — V. 64, N. 3/4.
11. Gorshkov A.V., Tarasova I.A.,
Evreinov V.V., Savitski M.M., Nielsen M.L., Zubarev R.A., Gorshkov M.V. Liquid Chromatography at Critical Conditions: Towards a Comprehensive Approach to Sequence Dependent Retention Time Prediction // Anal. Chem. — 2006. — N. 78. — P. 7770-7778.
12. Gorshkov A.V., Evreinov V.V.,
Tarasova I.A., Gorshkov, M.V. Applicability of the critical chromatography concept to proteomics problems: Dependence of
retention time on the sequence of amino acids // Polymer Science. Ser. B. — 2007. — V. 49 (3-4). — P. 93-107.
13. Tarasova I.A., Gorshkov A.V.,
Evreinov V.V., Zubarev R.A, Gorshkov M.V. On the applicability of the critical chromatography concept to proteomics problems: Experimental study of the
dependence of peptide retention time on the sequence of amino acids // Polymer Science. Ser. B. — 2008. — 50 (2). — P. 1-15.
14. Тарасова И.А. Жидкостная хроматография в критических условиях в сочетании с масс-спектрометрией для изучения первичной структуры биомолекул // Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук. — МФТИ, 2007.
Поступила в редакцию 29.12.2007.
