CC BY
12
УДК 541.144.8
ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ ТЕТРАЦИКЛИНОВОГО РЕПРЕССОРА ТЕТЯ0 ТЕТРАЦИКЛИНОМ
М. М. Белякова, Е. В. Петрова, В. А. Спиридонова, Е. Н. Добров, А. М. Копылов, Ц. А. Егоров*, Б. Виттманн-Либольд**, В. Сэнгер ***
(кафедра химии природных соединений)
Исследована возможность использования тетрациклина (Тс) как прямого фотоаффинного реагента на системе: комплекс тетрациклина с тетрациклиновым белком-репрессором TetRD. При облучении светом с длиной волны 366 нм Тс модифицирует полипептидную цепь белка на участках 159-Е73 и/или А173-Е183. Оба пептида содержат аминокислотные остатки, по данным рентгеноструктурного анализа участвующие в образовании нековалент-ных взаимодействий с Тс в комплексе. Впервые показано, что Тс может быть использован как фотоактивируемый модифицирующий реагент для изучения структуры центров связывания мишеней действия этого антибиотика.
Несмотря на то что тетрациклин (Тс) уже много лет широко используется в медицине, молекулярные механизмы его действия на бактериальные клетки точно не изучены, что препятствует рациональному проведению работ по созданию новых антибиотиков этой группы. В чувствительных к Тс клетках антибиотик взаимодействует с малой субчастицей рибосом и ингибирует синтез белка [1]. В клетках, имеющих наиболее распространенный и изученный тип системы устойчивости к Тс, антибиотик взаимодействует с тетрациклиновым белком-репрессором , который активирует синтез трансембранного белка ТйЛ, обеспечивающего транспорт Тс из бактериальной клетки [2]. Для выяснения молекулярных основ механизма действия антибиотика необходимо установить структуру комплексов антибиотик - мишень. Метод рентгенострук-турного анализа (РСА) имеет свои ограничения, поэтому необходима разработка других подходов, позволяющих получать информацию на молекулярном уровне. Таким комплементарным подходом является метод фотоаффинной модификации.
Для выявления участков полипептидной цепи, находящихся в непосредственном контакте с Тс, мы решили применить метод так называемой сшивки нулевой длины: УФ -индуцированного ковалентного сшивания при облучении комплекса светом с длиной волны 366 нм, при которой копланарная сопряженная система связей колец Б-С-Б в молекуле Тс (рис. 1) обеспечивает мощное поглощение [3], в то время как молекулы белка не поглощают.
Метод УФ-индуцированного ковалентного сшивания Тс был использован ранее для определения компонентов, участвующих во взаимодействии с антибиотиком, например для такого сложного надмолекулярного комплекса как рибосома [4, 5]. Тем не менее, широкое использование этого метода для изучения молекулярной структуры центров связывания Тс станет возможным только после того, как будет обнаружена прямая корреляция между данными модификации и РСА. Сэнгером с коллегами [6] была установлена третичная структура белка Те1Яв в комплексе с Тс методом РСА с разрешением 2.4 А и предложена схема контактов Тс с аминокислотными остатками белка (рис. 2). Именно поэтому в качестве объекта для исследования продуктов фотовстраивания тетрациклина в данной работе был выбран комплекс Тс с белком-реп-рессором Те®°. Исследование такого комплекса методом УФ-индуцированного ковалентного сшивания позволит
ОН О ОН 0
Рис. 1. Структурная формула молекулы тетрациклина
определить возможность получения данных на атомном разрешении.
Экспериментальная часть
В работе использовали 7-[3Н]-тетрациклин с удельной активностью 18 ГБк/ммоль (New England Nuclear, США) и препарат белка TetRD, полученный в Институте кристаллографии Свободного университета Берлина (Германия), с концентрацией 33 мг/мл. Стандартный буфер A -50 мМ трис-HCl рН 8.0, 5 мМ MgCl2, 150 мМ NaCl, 2 мМ дитиотрейтол.
Комплексообразование 7-[3Н]-Тс с TetRD проводили в объеме 200 мкл. Различное количество белка инкубировали в буфере А при комнатной температуре в течение 15 мин, добавляли Тс до конечной концентрации 0.05 мкМ. Образцы перемешивали, инкубировали при ком -натной температуре еще 10 мин и помещались в лед. Степень комплексообразования определяли методом сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах Millipore GS с размером пор 0.22 мкм. Фильтры промывали дважды 0.5 мл 0.25 М раствором ЭДТА рН 8.0, трижды деионизованной водой и буфером А. Образец наносили на фильтр, трижды промывали 0.5 мл буфером А при скорости 1 мл/мин, фильтры тщательно высушивали на воздухе. Количество связавшегося меченого Тс определяли методом жидкостного сцинтилляционного счета в 5 мл сцин-тиллятора ЖС-106 на счетчике «Tracor Analitic» (Франция). По данным связывания определяли оптимальное мольное соотношение Тс: белок для экспериментов по УФ-индуцированному ковалентному сшиванию.
Облучение комплекса проводили дуговой ртутной лампой ДРШ-250 (СССР) с максимумом испускания 366 нм и электрической мощностью 250 Вт в одноразовых пластиковых кюветах с длиной оптического пути 1 см, пропускающей свет с расстояния 25 см только с X > 320 нм. Кювету охлаждали водой со льдом. Концентрация Тс составляла 0.85 мкМ, концентрация белка TetRD -6.7 мкМ.
Выделение комплекса сшитого Тс с белком ТетЯ3 из реакционной смеси после облучения и разделение пептидов после протеолиза проводили методом ВЭЖХ на колонке с октилсиликагелем в обращенной фазе на хроматографе «Gilson 802-C», детекция при 214 нм. Как элю-ент использовали раствор 0.1% трифторуксусной кислоты (ТФУ) в ацетонитриле. Выделение комплекса проводили в градиенте концентрации ацетонитрила 10-60% (40 мин) и 60-75% (20 мин). Скорость элюции составляла 0.5 мл/мин. Комплекс высушивали на вакуумном испарителе «Speedvac» (Savant, США), осадок растворяли в 200 мкл 25 мМ NH4HC03 pH 7.8. Для гидролиза белка добавляли 10 мкг протеиназы V8 и инкубировали при непрерывном перемешивании в течение 17 ч при 25°.
Полученный гидролизат фракционировали на пептиды методом ВЭЖХ. Разделение пептидов проводили в градиенте концентрации ацетонитрила 0-40 % в течение 90 мин с последующим увеличением концентрации аце-тонитрила до 60% за 35 мин, далее концентрация ацето-нитрила была постоянной. Во фракциях элюата объемом
0.5 мл после высушивания и растворения в воде определяли значение радиоактивности, внося пробу в 5 мл сцин-тиллятора ЖС-8. Фракции пептидов собирали по поглощению отдельно и определяли значения радиоактивности. Секвенирование пептидов, содержащих радиоактивную метку, проводили на автоматическом газожидкостном сек-венаторе «Кпаиег-816» по методике фирмы.
Результаты и обсуждение
Целью работы является установление прямой корреляции между данными рентгеноструктурного анализа (РСА) центра связывания Тс белком ТйЯ0 и данными фотоин-дуцированного химического сшивания Тс с отдельными аминокислотами белка (рис. 2). Следует отметить, что, несмотря на популярность метода фотоиндуцированного химического сшивания, для многих реагентов (в том числе нулевой длины) подобные корреляции в литературе отсутствуют.
При химической модификации существенным моментом является выбор отношения реагент-мишень. В большинстве случаев использование избытка реагента может приводить к дополнительной неспецифической модификации белка. Чтобы этого избежать, мы определили условия максимального образования комплекса ТеЖ-Тс методом сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах в обратном варианте [7]: заданное количество Тс титруется возрастающими количествами белка. На рис. 3 приведена изотерма связывания Тс белком Те®°. При увеличении концентрации белка удерживание комплекса на мембране возрастало и достигало постоянного значения на уровне 70% связывания при соотношении Тс : белок = 1:8. Именно это соотношение, практически полностью обеспечивающее отсутствие избытка модифицирующего реагента, и было использовано в опытах по УФ-индуцируемому ковалент-ному сшиванию.
Рис. 3. Изотерма связывания тетрациклина с белком Те1Я в буфере А (данные 5 экспериментов). Концентрация тетрациклина 0.05 мкМ
Результаты М-концевого секвенирования У8 пептидов фракции 7 (в пикомолях указано количество аминокислоты, идентифицируемой на каждом шаге отщепления
Рис. 2. Схема возможных контактов Тс с аминокислотными остатками белка Те1Яс по данным РСА [6]. Числовые индексы со штрихами обозначают аминокислотные остатки, принадлежащие второй молекуле белка Те1Яс в димере
Номер шага Аминокислота Содержание кислоты, пмоль
1 А 204
I 15
2 Ь 152
3 Р 104
А 17
4 I 84
Я 6
5 м 84
н 3
6 э 51
н 2
7 8 12
8 э 38
9 40
Рис. 5. Профиль элюции У8 пептидов модифицированного Тс белка Те1Я на колонке ЯР-300. Детекция при 214 нм, чувствительность 0.2. Прямоугольниками обозначены значения радиоактивности в имп/минмл за вычетом фона (60 имп/минмл)
MARLNRE^SVTOAALE^LLNE^TGroGLTTRKLAQKLAQKLGIE^QPT
LYWHVKNKRALLDALAVE^ |lLARHH64PYSLDAAGE I^SWQSFLR NN82AMSF86RRALLRYRDGAKVH100LGTR104P105DE^KQQYDTV 113E^TQ116LRFMTE^ NGFCLRDGL131YAI134CAVSSHFTLGAVL E147^ QQEiHTAALTDRPAAPDEiNLPPLL170REi AL174QIM177D
lie
ISDDGE QAFLHGLE^SLIRGFE^VQTALLQIVGGDKLIIPFC
Рис. 4. Аминокислотная последовательность белка ТйЯ . Стрелками обозначены пептидные связи, гидролизуемые протеиназой У8:Е-Х. Верхними индексами обозначены аминокислотные остатки, сближенные с Тс по данным РСА. В рамку заключены 2 пептида, идентифицированные во фракции 7 (рис. 5)
Для УФ-облучения использовали дуговую ртутную лампу ДРШ-250 с максимумом излучения при 366 нм и электрической мощностью 250 Вт. Препараты комплекса Тс с белком Те1Яс в буфере А облучали в течение 10 мин, комплекс отделяли от несвязанных Тс, продуктов фотолиза и солей методом ВЭЖХ. Выход модификации составлял около 6% по Тс.
Очищенный модифицированный белок гидролизовали протеиназой У8, расщепляющей полипептидную цепь после остатков глютаминовой кислоты. Возможный набор пептидов, получаемый гидролизом протеиназой У8, представлен на рис. 4. По данным РСА, как видно из рис. 4, в комплексе с репрессором с Тс сближено более 10 аминокислотных остатков из различных пептидов белка. Смесь пептидов модифицированного Те®° после гидролиза протеиназой У8 фракционировали методом ВЭЖХ и в полученных фракциях определяли поглощение при 214 нм и радиоактивность (рис. 5). Практически вся радиоактивность обнаружена во фракции 7.
При М-концевом ступенчатом секвенировании пептидов фракции 7 были идентифицированы два пептида: основной и минорный (таблица). М-концевая последовательность основного пептида соответствовала пептиду У8: А173-Е183 белка ТеЖ0, а М-концевая последовательность минорного - последовательности У8: 159-Е73 (рис. 4, таблица). К сожалению, при данных условиях разделения
время выхода обоих пептидов совпадает. Более того, положение модифицированного пептида может совпадать (или не совпадать) с исходным пептидом. Поэтому в условиях данного эксперимента не представляется возможным однозначно определить, какой из двух пептидов (или оба) модифицируется Тс. Несмотря на это, оба найденных пептида содержат в своем составе аминокислотные остатки, по данным РСА сближенные в комплексе с молекулой Тс [6] (рис. 2). В состав этих пептидов входят аминокислоты Н64 и М177, обладающие сильными нуклеофильными свойствами. Именно они могут рассматриваться как наиболее вероятные места атаки продуктами фотолиза Тс.
В настоящей работе впервые получена прямая корреляция между данными РСА и результатами фотоаффинной модификации Тс в комплексе с белком Те1Яв, что позволяет сопоставить данные для кристаллического состояния комплекса с данными о его поведении в растворе. Полученные результаты открывают принципиально новые возможности для изучения структуры центров связывания Тс в других молекулярных мишенях.
Работа поддержана грантами РФФИ 98-04-49005 и «Университеты России» 5099 и 5157.
Выражаем благодарность Б.М. Сергееву за помощь при проведении фотолиза и А.Х. Мусолямову за секвени-рование пептидов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Suzuka J., Kaji H., Kaji A. // Proc. Nat. Acad. Sie. USA. 1966.
55. P. 483.
2. Hillen W., Berens C. // Annu. Rev. Microbiol. 1994. 48. P. 345.
3. Стрельцов С. А., Куханова М. К., Гурский Г. В. и др. // Молекулярная биология. 1975. 9. C. 910.
4. Goldman R. A., Hasan T., Hall C. C., Strycharz W. A., Cooperman B. S. // Biochemistry. 1983. 22. P. 359.
5. Oehler R., Polacek N., Steiner G., Barta A. // Nucl. Acid Res.
1997. 25. P. 1219.
6. Kisker C., Hinrichs W., Tovar K., Hillen W., Saenger W. // J.
Mol. Biol. 1995. 247. P. 260.
7. Hillen W, Klock G., Kaffenberger I, Wray L. V., Reznikoff W. S.
// J. Biol. Chem. 1982. 257. P. 6605.
Поступила в редакцию 13.10.9S
