CC BY
15ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ, Серия А, 2008, том 50, № 3, с. 479-493
СТРУКТУРА, = СВОЙСТВА
УДК 541.64:543.544
О ПРИМЕНИМОСТИ КОНЦЕПЦИИ КРИТИЧЕСКОЙ ХРОМАТОГРАФИИ К ЗАДАЧАМ ПРОТЕОМИКИ. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАВИСИМОСТИ ВРЕМЕНИ УДЕРЖИВАНИЯ ПЕПТИДОВ ОТ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В ЦЕПИ1
© 2008 г. И. А. Тарасова*, А. В. Горшков**, В. В. Евреинов**, К. Адаме***,
Р. А. Зубарев***, М. В. Горшков*
*Институт энергетических проблем химической физики Российской академии наук 119334 Москва, Ленинский пр., 38, корп. 2 **Институт химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук 119991 Москва, ул. Косыгина, 4 ***Uppsala University, Biological and Medical Center, Laboratory for Biological and Medical Mass Spectrometry Box 583, S-75 123 Uppsala, Sweden Поступила в редакцию 18.01.2007 г. Принята в печать 27.08.2007 г.
Представлены экспериментальные данные по разделению синтетических и природных пептидов, рассмотренные в рамках предложенной авторами модели разделения, которая учитывает связанность аминокислотных остатков в цепь и коллективный характер их взаимодействия с поверхностью. Показано, что модель правильно предсказывает разделение пептидов одинакового аминокислотного состава, имеющих различия в чередовании остатков в цепи. Такие различия могут быть обусловлены перестановками аминокислотных остатков, наличием в цепи концевых групп, изомеров аминокислот или зеркальных последовательностей. Модель разделения применена для предсказания времен удерживания пептидов, полученных путем ферментативного гидролиза трипсином белков E. coli и белка альбумина BSA. Показано, что модель в целом правильно отражает совокупность экспериментальных данных по разделению таких пептидов и впервые позволяет связать последовательность в цепи с объемом удерживания.
ВВЕДЕНИЕ
Ранее авторами [1, 2] была сформулирована модель разделения биомакромолекул, основанная на представлении об адсорбции макромолекулы как адсорбции цепи случайных блужданий. Обработка в рамках этой модели существующих в литературе [3-5] экспериментальных данных по хроматографии синтетических и природных пеп-
1 Работа выполнена при финансовой поддержке Отделения химии и наук о материалах РАН (программа "Создание эффективных методов химического анализа и исследования структуры веществ и материалов"), а также Российского фонда фундаментальных исследований (код проекта 06-04-49632) и фонда INTAS (гранты 04-83-2643 и Genomics 05-10000004-7759).
E-mail: evreinov@polymer.chph.ras.ru (Евреинов Виктор Викторович).
тидов показала, что она непротиворечиво описывает наблюдаемые закономерности. В отличие от альтернативных моделей разделения [6, 7], широко используемых для предсказания времени удерживания пептидов, предложенная модель дает возможность связать объем или время удерживания не только с аминокислотным составом, но и с последовательностью аминокислотных остатков в цепи пептида - его "текстом". В настоящей работе рассмотрено соответствие модели экспериментальным данным по разделению синтетических и природных пептидов, полученных на разных неподвижных фазах типа -С18 и на разных экспериментальных установках.
МОДЕЛЬ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ ПЕПТИДОВ ВюЬССС
Система уравнений, описывающая хромато-графическое разделение пептидов в условиях градиентного элюирования в бинарном растворителе с компонентами А и В и профилем МВ(У) (V -объем прокачанного через колонку растворителя) подробно рассмотрена в работе [1]. Эти уравнения представляются в виде
£лб( V) = £л + 1п (N в (V) е0*- Ел) -1 + Мв (V)) £,( V) = а( X0- £лб( V))
К(V) = 1 иТП w(е;( V))Ро (1)
V» - V о
VpKd( V)
= 1
да задает адсорбционный энергетический профиль макромолекулы {X0}, где X0 - стандартная
энергия адсорбции 1-го аминокислотного остатка. В каждой точке рассчитывается е; (V) - энергия адсорбции 1-го аминокислотного остатка цепи с учетом десорбции компонентов растворителя. Масштабный фактор а учитывает небольшие различия в энергии адсорбции остатков на разных неподвижных фазах типа -С18. По "тексту" последовательности аминокислотных остатков пептида строится цепь случайных блужданий с переходными матрицами W(e¡ (V)) и вычисляется статистическая сумма, численно совпадающая с коэффициентом распределения КЛ(У) в поре размером Э. Наконец, рассчитывается объем или время удерживания интегрированием функции от коэффициента распределения. Константы колонок V0 и Vp соответствуют объему межчастичного пространства и объему пор.
I
о
Кратко уравнения (1) могут быть интерпретированы следующим образом. Градиентный профиль (мольная доля ИВ компонента В) определяет в каждой точке объема растворителя "элюирую-щую силу" смеси еАВ(^, зависящую от силы отдельных компонентов еА и £В. В свою очередь "текст" последовательности аминокислот пепти-
Стандартные энергии адсорбции аминокислотных остатков {X0} - основные феноменологические параметры модели, приведены ниже. Они определены экспериментально для бинарного растворителя вода-ацетонитрил с добавками трифторуксусной кислоты на обращенной фазе типа -С18 [1, 2].
К Н Я N О Б 0 Б Т Е
0.266 0.386 0.516 0.614 0.656 0.698 0.746 0.781 0.876 0.984
А Р С У V М I Ь Б
1.143 1.143 1.296 1.686 1.751 1.822 2.156 2.298 2.319 2.436
Феноменологические параметры, описывающие энергию адсорбции компонентов растворителя, для воды и ацетонитрила приняты соответственно £А = 0 и £В = 0.45.
Система уравнений (1) подробно рассмотрена в работе [1]. Она осуществляет перенос идей метода критической хроматографии макромолекул (ЬССС) на синтетические и природные биомакромолекулы. Модель разделения биомакромолекул, описываемая системой (1), будет называться в дальнейшем моделью ВюЬССС (моделью критической хроматографии в приложении к биомакромолекулам).
Прежде чем перейти к рассмотрению приложения модели ВюЬССС для объяснения экспериментальных закономерностей разделения пептидов, сделаем несколько общих замечаний относительно пределов ее применимости.
Основной целью хроматографии макромолекул является в общем случае их разделение по характеру чередования разных мономеров в цепи. Для макромолекул пептидов разделение должно осуществляться как по набору аминокислотных остатков (которые можно условно назвать "буквами" с различными энергиями взаимодействия с поверхностью), так и по их последовательности
("тексту", составленному из этих букв). Если возможность разделения макромолекул пептидов по набору их аминокислотных остатков очевидна, то разделение по "текстам" макромолекул, содержащих перестановки аминокислотных остатков -не вполне очевидный факт. Это особенно заметно, если подходить к проблеме "со стороны" низкомолекулярных соединений. Обычно такой подход сводится к вариантам аддитивного приближения, когда каждый остаток дает определенный "вклад" в статистическую сумму, в коэффициент распределения или во время удерживания [6, 7]. Ясно, что при таком подходе ни о какой связи объема удерживания с "текстом" последовательности цепи речи не идет.
Напротив, подход со стороны высокомолекулярных соединений органически содержит в себе зависимость удерживания от последовательности звеньев в цепи, что непосредственно следует из некоммутативности произведения переходных матриц описывающих блуждание звеньев по решетке в уравнении (1). Возможность разделения макромолекул гетерополимера по "текстам" связана с тем, что взаимодействие разных звеньев с поверхностью скоррелировано из-за сильных ковалентных связей, соединяющих мономеры в цепь. Для выбранного звена его взаимодействие с поверхностью зависит от удаленных по цепи соседей, и их перестановки могут заметно повлиять на это взаимодействие [8].
Существует два предельных случая корреляции звеньев в цепи гетерополимера. Гибкая макромолекула моделируется цепью случайных блужданий, в которой каждый остаток представляется звеном кубической решетки. Жесткая макромолекула моделируется стержнем, длина которого много больше ее диаметра, и который может изгибаться в результате тепловых флукту-аций. В модели ВюЬССС макромолекула моделируется гибкой цепью случайных блужданий. Помимо математической простоты существуют еще две причины выбора такого приближения в качестве исходного.
Во-первых, опыт исследования олигомеров показывает, что даже в предельном случае очень коротких цепей модель случайных блужданий (или эквивалентная ей гауссова модель) дает хорошее количественное описание разделения макромолекул самой разной природы: от жестких
макромолекул эпоксидных смол, поликарбонатов и сложных полиэфиров до гибких цепей поли-этиленоксида или полипропиленоксида.
Во-вторых, корреляции в цепи случайных блужданий дают максимальную зависимость объема удерживания от "текста" последовательности, что позволяет оценить предельные возможности хроматографии для разделения пептидов с разными последовательностями.
Модель адсорбции флуктуирующего гетерогенного стержня также может быть использована в ВюЬССС. Возможно, что такая модель наиболее адекватна макромолекулам пептидов. Однако ее математические аспекты, а главное - возможность соотнесения феноменологических параметров гибкости цепи экспериментально наблюдаемым величинам, представляются более сложными. Эти вопросы нами пока подробно не рассматривались, однако качественный вывод для модели жесткого гетерогенного стержня достаточно очевиден: перестановки остатков в середине цепи, по-видимому, мало существенны, а важно лишь то, какие остатки располагаются ближе к концам. Вообще говоря, цепь, моделируемая жестким стержнем, должна быть ближе к широко распространенным аддитивным моделям: основной вклад дают состояния, в которых макромолекула располагается на поверхности целиком, при этом каждый остаток взаимодействует с поверхностью.
Гибкая цепь также может располагается на поверхности целиком. Это возможно в пределе очень коротких цепей или очень сильной энергии взаимодействия звеньев с поверхностью, близкой к энергии химической связи. По этой причине для гибких коротких цепей аддитивное приближение дает вполне разумную связь между составом цепи и объемом удерживания. Однако по мере роста длины цепи реализация состояния полностью адсорбированной цепи быстро становится затруднительной, так как требуется слишком большая энергия взаимодействия. В общем случае равновесное состояние адсорбированной цепи представляет собой чередующиеся участки взаимодействующих с поверхностью адсорбированных звеньев и связывающих их десорбированных петель и хвостов. Тем самым условия аддитивности нарушаются и появляется зависимость адсорбционных свойств от последовательности составляю-
щих цепь звеньев. Равновесное состояние макромолекулы реализуется в результате тонкого баланса энергии притяжения звеньев и потери энтропии цепи, связанной с ограничениями в их расположении вблизи поверхности по сравнению с неограниченным пространством.
Высказанные выше качественные представления справедливы и вблизи критической точки перехода макромолекулы из адсорбированного в десорбированное состояние: очевидно, что такому переходу предшествует образование петель и хвостов и, как следствие, нарушение принципа аддитивности. Адсорбционно-десорбционный переход всегда имеет место при градиентном элюиро-вании макромолекул. В начальный момент макромолекулы адсорбированы на поверхности, затем, по мере увеличения элюирующей силы растворителя, они десорбируются и перемещаются вдоль колонки. Тем самым вблизи критической точки адсорбции осуществляются условия, в которых должна проявляться последовательность аминокислотных остатков в цепи.
Следует отметить, что в десорбированном состоянии при движении вдоль колонки макромолекулы разделяются по размерам по экслюзионно-му механизму. В адсорбционном режиме макромолекулы также медленно мигрируют вдоль колонки и разделяются по разным признакам их первичной структуры. Модель ВюЬССС учитывает все эти особенности реального разделения. Вместе с тем переход пептидов в адсорбированное состояние (в зависимости от конкретной первичной последовательности), по-видимому, осуществляется достаточно резко в узкой области состава растворителя. Поэтому основной вклад в разделение вносит область состава растворителя вблизи критической точки адсорбции. Предельно упрощая, можно сказать, что пептиды распределяются в градиенте состава растворителя вблизи своих критических точек, зависящих от их конкретной первичной последовательности.
Помимо учета линейной памяти (связанности звеньев в цепь) модель ВюЬССС основана на линейных соотношениях свободной энергии. Это позволяет записать в корреляционном виде зависимость эффективной энергии взаимодействия аминокислотного остатка от состава растворителя и типа адсорбента в уравнении (1). Такой подход опирается на простейшие представления об
адсорбции компонентов растворителя, восходящие к изотерме Ленгмюра. В рамках линейного приближения можно "расцепить" адсорбционные свойства собственно аминокислотного остатка, подвижной и неподвижной фазы и тем самым предсказать изменение характера разделения при изменении формы градиентного профиля.
Изложенные выше качественные представления являются первым приближением к реальной картине, однако они дают зависимость объема удерживания от последовательности аминокислотных остатков в цепи.
Следует сделать еще одно замечание. В модели, описываемой уравнением (1), неявным образом предполагается короткодействующий характер взаимодействия аминокислотных остатков с поверхностью. Это может быть неверно для остатков, содержащих ионогенные группы ^Н2. Если количество кислоты в растворителе соответствует условию рН 2.0, то такие группы ионизируются, и их взаимодействие с поверхностью становится нелокальным. Пептиды, получающиеся в результате ферментативного гидролиза белков трипсином (для простоты будем называть их триптическими пептидами), имеют по крайней
мере одну такую заряженную группу -КИ+ на Оконце. Если же в цепи есть несколько аминокислотных остатков с такими группами, то необходимо принять во внимание и возможность их электростатического взаимодействия друг с другом. Оценка влияния заряженных групп на картину разделения в рамках модели ВюЬССС будет предметом дальнейших экспериментальных исследований.
Изменение формы энергетического профиля цепи при перестановке остатков или замене одного из них меняет объем удерживания. Модель ВюЬССС позволяет для любой заданной последовательности оценить изменение объема удерживания, а следовательно, и возможность обнаружения перестановки или замены методом хроматографии. В общем случае перестановки могут приводить и к близким, неразличимым объемам удерживания. Поэтому решение обратной задачи (однозначного "чтения текста" неизвестного пептида из точно измеренного объема удерживания) в рамках хроматографии вряд ли возможно в общем случае. Необходимо привлечение "ортого-
нальных" хроматографии методов масс-спектро-метрии.
Отметим, что масс-спектрометрия сама по себе также не дает ответа на вопрос о последовательности пептидов. Более того, точное измерение массы пептида отвечает лишь на вопрос о его аминокислотном составе. В пределах погрешности измерения, типичной для современных масс-спектрометров (10-100 м.д.), число возможных вариантов аминокислотных составов, соответствующих измеренной массе, может достигать сотен и тысяч (соответственно, возможных вариантов "текстов" последовательностей может быть на несколько порядков больше) [9].
Задача "чтения текста" пептида решается методом тандемной масс-спектрометрии, с использованием фрагментации макромолекул по пептидным связям и измерения масс фрагментов. Но даже и в этом случае однозначное установление последовательности затруднительно в силу ряда причин.
Во-первых, эффективность существующих методов фрагментации, как правило, невысока, не все пептидные связи удается разрушить и тем самым получить полный спектр фрагментации.
Во-вторых, ряд аминокислот имеет близкие либо совпадающие массы. Например, в паре глю-тамин (Q) и лизин (K) отличие в массах составляет всего 0.036, а массы лейцина (L) и изолейцина (I) просто одинаковы. Это делает затруднительным или невозможным их однозначную идентификацию. Даже для таких сложных методов измерения, каким является масс-спектрометрия ионного циклотронного резонанса [10], точность измерения масс в спектрах фрагментов относительно невысока.
Наконец, даже если не рассматривать задачу "чтения текста" неизвестного пептида, а решать типичную задачу протеомики - идентификацию пептида (а следовательно, и белка, которому он принадлежит), используя поиск по базам данных масс и последовательностей известных белков, то также можно столкнуться со значительными сложностями. Существующие поисковые системы, такие как Mascot или SEQUEST, могут содержать ошибочные данные о последовательности (по некоторым оценкам до 30%) или давать несколько возможных "текстов".
Несмотря на то, что решение обратной задачи с использованием BioLCCC также дает множество возможных "текстов" последовательностей, это множество не совпадает с множеством "текстов", получаемых из масс-спектрометрических данных. Следовательно, объединение метода BioLCCC и тандемной масс-спектрометрии в едином исследовательском комплексе значительно уменьшает число возможных "текстов"-кандида-тов по сравнению с тем, что дают эти методы по отдельности.
Перед тем, как перейти к обсуждению экспериментальных данных, необходимо отметить некоторые особенности применяемых в настоящее время в исследованиях пептидов хроматографи-ческих систем. В отличие от стандартных аналитических хроматографических систем, использующих большие колонки и малые внеколоночные объемы, разделение пептидов обычно осуществляется в наносистемах. Последние имеют очень небольшой объем колонки, который много меньше, чем, например, объем вводимой пробы, что приводит к необходимости использования специфических способов ввода образца в колонку. Обычно исследуемый образец в объеме 5 мкл вводится в колонку объемом 300 нл в течение 30 мин, при этом неявно предполагается, что в течение времени ввода все пептиды сильно адсорбируются в начале колонки и не мигрируют вдоль нее. Помимо того, что для гидрофильных пептидов такое предположение не вполне правильно, при указанном способе ввода в начальный момент в колонке создаются "плохие" хроматогра-фические условия, соответствующие высокой концентрации пептидов на поверхности и их взаимодействию друг с другом. Последнее обстоятельство никак не учитывается в модели BioLCCC. Таким образом, при интепретации экспериментальных данных по разделению пептидов в наносистемах необходимо принимать во внимание и эти факторы.
С учетом сказанного выше рассмотрим совокупность экспериментальных данных по разделению синтетических пептидов с разными последовательностями, а также сложных смесей пептидов, получаемых при ферментативном гидролизе трипсином белков E. coli и BSA.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Эксперименты по разделению и идентификации индивидуальных пептидов и их смесей проводили на двух хроматографических системах: макроскопической (стандартной) аналитической системе ВЭЖХ HP1100 ("Hewlett Packard/Agilent", США) и наносистеме ВЭЖХ Agilent 1100. Стандартная система ВЭЖХ HP1100 имела в составе УФ-детектор на основе диодной матрицы, позволяющий определять объем удерживания любых пептидов на нескольких длинах волн. Наносисте-ма ВЭЖХ Agilent 1100 была объединена с гибридным масс-спектрометром LTQ-FT ("Thermo Electron", США). Масс-спектрометр был оборудован наноэлектроспреем (Proxeon Biosystems, Дания), позволяющим получать макромолекулярные ионы, а также использовать несколько методов их фрагментации, включая диссоциацию, активированную соударениями (ДАС) с молекулами буферного газа в ионной ловушке, и рекомбинант-ную диссоциацию при электронном захвате (ДЭЗ). Эти методы использовали для последующей идентификации последовательностей с помощью поисковой системы Mascot, доступной через Интернет (Matrix Science, США, www.matrix-science.com).
Разделение синтетических пептидов, содержащих изомерные остатки изолейцина (I) и лейцина (L), H-RAAAAIAAAAR-OH и H-RAAAA-LAAAAR-OH, осуществляли на стандартной системе НР1100 на колонках 4.0 х 150 мм, заполненных фазой Диасфер 110-С18 (БиоХимМак СТ, Москва) с размером частиц 5 мкм и размером пор 110 А. Компонент А мобильной фазы представлял собой воду с добавкой 0.1 об. % трифторук-сусной кислоты (ТФУК), компонент В - ацето-нитрил, также содержащий 0.1 об. % ТФУК. Разделение пептидов осуществляли при линейном по времени градиенте состава растворителя от начальной точки 2 об. % В до конечной точки 30 об. % В в течение 30 мин. Скорость подачи растворителя 0.5 мл/мин, объем вводимой пробы 20 мкл, концентрация образцов в пробе порядка 0.1 мг/мл.
Для разделения зеркальных последовательностей H-GALYIYLGDGLDTADAEG-amide, H-GE-ADATDLGDGLYIYLAG-amide и таких же последовательностей с OH-группами на С-конце использовали стандартную хроматографическую
систему НР1100, аналитическую колонку Vydac 218TP54 размером 4.6 х 250 мм, заполненную фазой -С18 c размером частиц 5 мкм и размером пор 300 А. Объем вводимой пробы 20 мкл, концентрация образцов в пробе 0.1 мг/мл. Компонент А мобильной фазы представлял собой воду с добавкой 0.1 об. % ТФУК, компонент В - смесь 90.0 об. % ацетонитрила, 9.9 об. % воды и 0.1 об. % ТФУК, что соответствует pH 2.0. Пептиды с одинаковыми концевыми группами, содержащиеся в смеси в соотношении 2 : 1, были попарно проанализированы в нескольких хроматографических экспериментах при одних и тех же условиях разделения: линейный по времени градиент от начальной точки 2 об. % компонента В до 60 об. % В в течение 60 мин со скоростью 0.5 мл/мин.
Модельные пептиды получали путем автоматизированного твердофазного синтеза на синтезаторе "Intavis ResPep Synthesizer" ("Intavis Bioana-lytical Instruments AG", Германия).
Разделение пептидов, образующихся в результате ферментативного гидролиза трипсином белков, выделенных из бактерии E. Coli, а также гид-ролизата белка альбумина (BSA) осуществляли на наносистеме Agilent 1100 с использованием в качестве детектора масс-спектрометра LTQ FT [11]. В наносистеме Agilent 1100 в качестве колонки использовали кварцевый капилляр размером 0.075 х 150 мм ("Proxeon Biosystems", Дания), заполненный фазой ReproSil Pur C18 AQ с размером частиц 3 мкм и размером пор 120 А ("Dr. Maisch GmbH", Германия). Хроматограммы получали по регистрации полного тока ионов после ионизации электрораспылением. Объем вводимой пробы 8 мкл, количество вещества для анализа - порядка 500 фемтомолей. Компонент А мобильной фазы представлял собой воду, содержащую 0.5 об. % уксусной кислоты (pH 3.0). Компонент В - смесь 89.5 об. % ацетонитрила, 10 об. % воды и 0.5 об. % уксусной кислоты. В экспериментах использовали следующие условия хроматографического разделения: изократическое элюирование со скоростью 500 нл/мин в течение 20 мин смесью, содержащей 4 об. % компонента В, за которым следует линейный градиент от 4 до 45 об. % В в течение 90 мин со скоростью 200 нл/мин.
Идентификацию триптических пептидов белков бактерии E. coli, взятых из 20 фракций электрофореза, проводили на основе анализа спек-
Таблица 1. Последовательности триптических пептидов белков E. coli в образцах I и II
Последовательность tR эксп, мин h теор> мин Последовательность tR эксп, мин h теор' мин
Образец I Образец II
TGVETR 31.910 31.875/30.144 REDVHR 27.520 30.875/29.132
FRDEGR 33.280 31.250/32.053 NDVSDSEK 30.850 32.125/29.571
GSGGGSSGGSIGGR 34.220 38.750/27.473 AREELRK 32.050 33.375/33.418
ENAANIK 34.510 34.375/40.959 SFSHQAGASSK 34.130 36.625/33.418
VIEPVKR 38.040 41.375/51.900 RVDQLK 34.940 33.750/36.714
VIEPVKR 38.040 41.375/51.900 GPAAIQK 35.240 35.750/37.484
VQLSDGR 39.770 35.250/44.903 AHVTAETPK 35.300 36.750/33.308
AGVEVDDR 39.870 38.625/45.666 PAVTAHPEQK 35.580 38.750/35.066
VLSGPQAQPAGDK 42.280 51.125/44.775 GSFEGR 37.040 32.375/33.418
GVNANHIIR 42.880 47.625/43.503 KSVAGFK 37.140 36.250/33.967
AQFLQK 44.050 39.875/59.534 NDEALNSQR 37.310 37.250/31.549
VHVTDYTNASR 45.170 45.125/37.014 QGIESATQK 37.880 36.125/30.670
AQYEDIAQK 45.230 44.250/36.887 AFAHYR 39.670 35.875/34.846
LSSPATLNSR 46.880 47.500/42.104 EVTQLR 40.440 36.125/35.176
SLLEGEGSSGGGGR 47.050 50.500/42.231 FSSSSGYGGGSSR 41.420 38.875/36.824
EHILLGR 47.160 53.125/47.320 FLEQQNK 41.600 36.875/40.121
EAFDTGVR 47.410 42.625/40.450 YSDEVVR 44.210 38.375/40.560
VAVDSEVTVR 49.840 55.125/49.737 STMQELNSR 44.540 41.375/39.571
SLVNLGGSK 52.160 47.625/42.104 LIAVNR 44.880 42.750/46.385
GVQSILQR 53.690 49.125/41.722 AEAESLYQSK 46.320 46.375/42.648
DHFAILK 53.930 54.500/43.630 SQILDEAK 46.530 44.250/40.341
TNLIGAVAR 55.090 58.250/49.737 FSAASQPAAPVTK 48.260 54.500/51.330
LDVLDER 55.520 47.875/49.483 TLLEGEESR 48.540 47.125/52.868
GPLTTPVGGGIR 55.740 59.875/51.773 TLNDAVEVK 49.070 48.000/53.088
VVASPGQGQQFEIQASK 56.170 67.875/59.661 EDLLASGR 49.580 45.625/49.901
FLEQQNQVLQTK 56.490 64.375/66.913 GELFGAK 49.970 42.500/47.374
NLALNIESR 58.520 59.750/60.424 VQAQIQGDEIR 50.080 51.625/48.692
SYYALAESVK 59.100 62.750/60.424 LANELSDAAENK 50.210 51.375/46.714
VSLVYGQMNEPPGNR 59.860 69.875/58.134 IVGDGIAIKPTGNK 52.210 59.125/55.066
GAFVSQVLPNSSAAK 60.960 73.250/58.007 VATVSLPR 52.550 48.375/47.264
VVEEAPAPGITPELR 61.800 77.375/68.058 YAIVANDVR 52.930 54.750/52.868
IVDLLTER 63.270 65.125/80.399 ATNLLYTR 53.480 53.625/49.791
GYTVSIFNR 64.770 59.750/73.147 EIADGLASAER 53.600 53.750/47.813
LINDAYDSEYFATK 66.130 75.375/63.732 ALEESNYELEGK 54.160 57.250/49.242
GNFDLEGLER 66.260 62.750/61.060 AEAQVIIEQANK 54.900 61.875/50.670
YDIPVVMDSAR 67.860 70.875/58.261 VQALEEANNDLENK 55.980 58.625/53.088
DWTIEQITR 70.690 60.125/53.045 SEFITVAR 56.220 55.375/58.253
SNTGLVIDPYFSGTK 71.570 81.250/60.933 IEISELNR 56.710 49.875/58.582
DVLEAMQADSGIR 72.110 69.375/55.844 SVEEILGK 56.810 49.500/54.736
AAPSYEELSNSQELLETGIK 74.480 84.250/77.473 FGSELLAK 57.150 53.375/59.901
AVEIGSFLLGR 78.470 84.500/101.65 FLEQQNQVLQTK 57.280 60.875/53.967
EEFGGELIDGGPWLK 81.780 87.500/85.361 LIYTASDLK 57.530 59.000/52.648
YLLVASAIGSLYK 82.340 93.000/97.956 YEELQITAGR 57.630 54.750/47.593
SLDLDSIIAEVK 85.570 81.750/82.562 DYQELMNTK 58.060 46.875/39.571
IATDPFVGNLTFFR 85.620 94.000/89.941 AAAQLQQGLADTSDENLK 58.800 65.750/60.231
DVIADAFLQQILLR 100.43 108.25/99.101 ALLENTELSAR 59.290 63.625/66.275
Таблица 1. Окончание
Последовательность tR эксп, мин h теор> мин Последовательность tR эксп, мин tR тео р > мин
DGYADGWAQAGTAR 59.430 55.625/56.165 IDVLDSDIPADTGVK 69.330 69.625/74.846
SPMVGTFYR 59.530 58.125/64.297 AVQLGGVALGTTQVINSK 69.910 75.500/77.484
SLEEIIR 60.030 53.500/68.143 ELLVGFGTQVR 70.400 72.625/72.319
SGGGFSSGSAGIINYQR 61.300 64.125/52.538 LGEHNIDVLEGNEQFINAAK 70.740 79.125/77.593
QVIGQVAADLR 61.550 63.250/75.176 DLSDVTLGQFAGK 74.000 65.500/75.505
YPEYNFYR 62.050 52.625/77.703 SILSELVR 74.180 63.125/76.824
EAGLSDLSLK 62.310 57.625/70.121 EQIIFPEIDYDK 75.720 80.125/84.407
SQTVHFQGNPVTVANSIPQAGSK 62.670 70.500/65.176 LLDNAAADLAAISGQK 76.520 73.250/82.978
LQLVGVGYR 62.960 60.875/86.165 TEIEDVLILEPR 78.930 86.375/70.121
QVAILAVAGAEK 63.970 71.875/86.165 NPLYEEIADVTIR 80.900 78.125/66.714
VSVSIFGR 64.020 52.875/80.670 VGLFQDTSAF 81.880 66.125/67.703
GVSADQISIVSYGK 64.420 65.750/72.758 VDLLNQEIEFLK 84.090 85.750/72.978
LNDLEDALQQAK 66.420 59.375/68.692 ALLNSMVIGVTEGFTK 87.390 85.500/80.231
VILAGEVTTPVTVR 66.730 77.125/64.736 QGISLSYLEQLFSR 95.070 86.750/73.967
DEVFALSNIQK 69.010 67.125/83.198
* Концевые группы последовательностей H2N- (~) -COOH. Здесь и в табл. 2 времена tR теор -дели BioLCCC (числитель) и по аддитивной модели [4] (знаменатель).
предсказываемые в рамках мо-
тров фрагментации с использованием поисковой системы Mascot [11]. Для настоящей работы из 20 фракций выбрали два образца, обозначенных в табл. 1 как образцы I и II. Основываясь на результатах поиска в системе Mascot, в этой таблице для сравнения предсказываемых теорией и экспериментально наблюдаемых времен удерживания оставили только те последовательности, достоверность идентификации которых превышала 95%.
Все хроматографические системы были стандартизованы с помощью пептидного стандарта S1-S5 ("Pierce Inc.", USA), который представляет собой смесь синтетических пептидов, четыре из которых имеют общую структуру Ac-RGxxGLGLGK-amide, где xx соответствует GG (S2), AG (S3), VG (S4) и VV (S5). Стандарт S1 имеет последовательность остатков, идентичную S3, однако отличается от последнего наличием свободной а-аминогруппы. Такая стандартизация позволяет определить активность поверхности адсорбента (масштабный фактор а в уравнении (1)) для разных колонок.
Для разделения пептидов использовали неподвижные фазы типа -С18 на основе силикагеля. Применение фаз разных производителей было
сделано осознанно, чтобы показать общность предсказательных свойств модели BioLCCC.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Начнем обсуждение c экспериментальных результатов разделения стандартов S^S5. На рис. 1 приведена хроматограмма для этих стандартов, полученная на колонке ReproSil Pur C18 AQ. На рис. 2а представлена корреляция между экспериментальными временами удерживания и предсказанными в рамках модели BioLCCC. Как видно, наблюдается хорошее соответствие между предсказанными и реальными временами удерживания. Для примера на рис. 26 приведена аналогичная корреляция между экспериментальными и расчетными временами удерживания, полученными в рамках аддитивной модели [4]. Даже для достаточно коротких цепей предсказания модели BioLCCC оказываются сопоставимыми по точности с предсказаниями аддитивной модели.
Вместе с тем стоит отметить, что стандарт S1 явно выпадает из линейной зависимости на рис. 2. Отличие этого стандарта от S3 заключается в том, что он имеет на конце ионизованную группу
H+N-. Очевидно, что указанная группа сильно гидрофильна и отталкивается от поверхности
100 h
57.81
60 -
20 -
35
55
75
tR, мин
I
отн
Рис. 1. Хроматограмма пептидного стандарта S1-S5 (1-5), полученная на наносистеме Agilent 1100. Условия разделения: колонка 0.075 х 150 мм, фаза ReproSil Pur C18 AQ, размер частиц 3 мкм, размер пор 120 À, объем вводимой пробы 8 мкл, изократическое элюирование 20 мин смесью, содержащей 4 об. % компонента В (89.5 об. % ацетонитрила, 10 об. % воды и 0.5 об. % уксусной кислоты), линейный градиент 4 -45 об. % В в течение 90 мин.
Рис. 2. Корреляционная зависимость между предсказанными в рамках модели ВюЬССС (а) и аддитивной модели [4] (б) и экспериментально наблюдаемыми временами удерживания последовательностей стандарта 31-Б5. Коэффициент корреляции Я2 = 0.974 (а) и 0.983 (б).
^отн 600 -
400 -
200 -
—г I _I_I_I_
10 14 18 22 26
tR, мин
Рис. 3. Разделение синтетических пептидов Н-ЯАААА1ААААЯ-ОН (1) и Н-ЯААААЬААААЯ-ОН (2), последовательности которых содержат изомеры лейцина. Расчетные в рамках модели ВюЬССС и экспериментально наблюдаемые времена удерживания соответственно 18.50 и 18.54 мин (1), 17.90 и 17.88 мин (2). Условия разделения: хроматографическая система НР1100, колонка 4.0 х 150 мм, фаза Диасфер 110-С18, размер частиц 5 мкм, размер пор 110 А, объем пробы 20 мкл, концентрация образца 0.1 мг/мл, линейный градиент от начальной точки 2 об. % В (ацетонитрил, содержащий 0.1 об. % ТФУК) до 30 об. % В в течение 30 мин.
(другими словами, отталкивание обусловлено тем, что "изображение" заряда на границе раздела полярной фазы (воды) и неполярной -С18 имеет тот же знак). Поэтому объем удерживания стандарта заметно меньше объема удерживания Б3, имеющего тот же "текст", но незаряженную концевую группу на Оконце. Модель ВюЬССС учитывает такое отталкивание (энергия взаимодействия группы И+К- принята равной -1.69 [1]). Однако, если предположить бесконечно сильное отталкивание концевого звена, это приводит при вычислении статсуммы к исключению лишь небольшого числа конфигураций цепи, а именно тех, которые начинаются на поверхности. По-видимому, этого недостаточно для наблюдаемого уменьшения объема удерживания стандарта Б1. Необходимо учитывать нелокальность взаимодействия заряженных концевых групп, что достаточно просто сделать в переходных матрицах уравнения (1). Отметим, что такой учет нелокальности идейно близок к поправкам для энергий адсорбции аминокислотных остатков, "привязанных" к Оконцу пептида в аддитивной модели [7]. Тем не менее правильный учет взаимодействия заряженных концевых групп
КИ+- (а также их взаимного влияния друг на дру-
га в цепи) в рамках модели BioLCCC пока остается открытым.
Рассмотрим далее разделение макромолекул, содержащих изомеры L и I. Интерес к хромато-графическому разделению и идентификации таких макромолекул состоит в том, что указанные последовательности не идентифицируются (или, по крайней мере, очень сложно идентифицируются) любыми методами масс-спектрометрии, в том числе и тандемной масс-спектрометрии по спектрам фрагментации. Вместе с тем хроматография позволяет легко разделить последовательности, что видно из хроматограммы, представленной на рис. 3. Согласие предсказанного времени выхода пептидов с экспериментальным оказывается очень хорошим. Такой пример подтверждает сформулированный выше тезис о том, что хроматографические сведения о последовательности, получаемых в рамках модели BioLCCC, дополняют данные масс-спектрометрии: для масс-спектрометрии пептидная пара из рассмотренного примера неразличима, в то время как для хроматографии - это два разных "текста".
Интересно отметить возможность разделения таких последовательностей не только по типу изомеров лейцина, но также и по их месту в цепи. Например, для последовательностей типа H-RAAAALAAAAR-OH и H-RALAAAAAAAR-OH
300
200
100
Ч^ЧлУ \А__^
400
200
35
45
55
мин
Рис. 4. Разделение "зеркальных" пептидов типа Н-ОАЬУ1УЬОВОЬВТАБАЕО-аш1<1е (1), Н-вЕАБАТ-ВЬОБОЬУ1УЬАО-аш1<1е (2) и Н-ОАЬУ1УЬОВОЬВТАБАЕО-ОН (3), Н-ОЕАВАТВЬОБОЬУ1УЬАО-ОН (4). Расчетные в рамках модели ВюЬССС и экспериментально наблюдаемые времена удерживания соответственно 42.04 и 45.34 мин (1), 43.92 и 48.22 мин (2), 41.99 и 45.70 мин (3), 43.83 и 48.31 мин (4). Условия разделения: хроматографическая система НР1100, колонка Ууёас 218ТР54 4.6 х 250 мм, фаза -С18, размер частиц 5 мкм, размер пор 300 А, объем пробы 20 мкл, концентрация образца 0.1 мг/мл, линейный градиент от 2 об. % В (90.0 об. % ацетонитрила, 9.9 об. % воды и 0.1 об. % ТФУК) до 60 об. % В в течение 60 мин.
I
отн
2
1
3
4
расчетные объемы удерживания различны для условий разделения, приведенных на рис. 3. Экспериментальная проверка этого факта будет служить прямым доказательством возможности использования модели ВюЬССС для определения места (номера остатка) модифицированных и(или) изомерных форм аминокислот в цепи, что является одной из наиболее трудных задач про-теомики. Исследование закономерностей разделения модифицированных пептидов и биомакромолекул будет предметом дальнейших экспериментальных исследований.
Следующий пример разделения пептидов идейно гораздо более сложен. Он относится к разделению перевернутых, "зеркальных" последовательностей. В первой части работы [1] была
предсказана возможность разделения таких последовательностей, имеющих асимметричный энергетический профиль. Последовательности имеют, очевидно, одинаковую массу, так что их "чтение" с помощью точного измерения массы макромолекулярного иона невозможно и требует использования методов тандемной масс-спектро-метрии (однако даже в этом случае возможны ситуации, когда спектры фрагментации не позволят различить пары зеркальных изомеров).
Для доказательства возможности разделения "зеркальных" пептидов были синтезированы последовательности типа Н-ОАЬУ1УЬОБОЬБ-ТАБАЕО-аш1ёе и Н-ОЕАВАТБЬОБОУ1УЬАО-аш1ёе, отличающиеся переворотом внутренней части. Также были синтезированы те же последо-
¿R теор' мин
100 80 60 40
100 80 60 40
fR теор' мин 100
II
40 60 80
¿r эксп
40 60 80 120
мин
tR э
мин
Рис. 5. Сравнение рассчитанных по модели BioLCCC (а) и аддитивной модели [4] (б), а также экспериментально наблюдаемых времен удерживания (мин) последовательностей пептидов белков E. coli, идентифицированных в образцах I и II (табл. 1). Коэффициент корреляции и дисперсия времен удерживания (мин) соответственно: R2 = 0.906 и а = 0.76 (Ia), 0.780 и 1.32 (I6), 0.879 и 0.69 (IIa), 0.762 и 0.93 (II6).
вательности, отличающиеся типом концевой группы на С-конце: Н-ОАЬУ1УЬОБОЬБ-ТАБАЕв-ОН и Н-ОЕАВАТБЬОБ1У1УЬАО-ОН. "Зеркальные" последовательности можно представить как перестановку концевых аминокислотных остатков. Как показано на рис. 4, эти последовательности действительно разделяются в полном соответствии с предсказаниями теории ВюЬССС. Естественно, что разделение таких структур не следует из аддитивной модели или ее аналогов. Здесь практически в чистом виде проявляется эффект связанности остатков в цепь и коллективный характер их взаимодействия с поверхностью. Учет влияния перестановки аминокислотных остатков в цепи на статистическую сумму гетерополимера вблизи поверхности несложно сделать в рамках подхода, развитого в работе [8]. Отметим существенную роль гетерогенности цепи: для макромолекул гомополимера перестановка разных концевых групп вырождена в смысле взаимодействия с поверхностью.
Наконец, рассмотрим возможность использования модели ВюЬССС для анализа хроматогра-фических данных, полученных в исследованиях
смесей триптических пептидов белков бактерии E. coli. Дайджесты белков E. coli изучены достаточно хорошо, встречающиеся в них последовательности приведены в табл. 1. Эти последовательности были идентифицированы программой Mascot с достоверностью, превышающей 95%. Вместе с тем следует сказать, что далеко не для всех из них были получены полные спектры фрагментации высокого качества, так что достоверность их первичной структуры не абсолютная.
Как следует из рис. 5 а, и для реальных систем наблюдается хорошая корреляция (коэффициент корреляции R2 ~ 0.9) между предсказанными и реальными временами удерживания со стандартной ошибкой предсказания менее 1 мин. Тем самым информация о возможном "тексте" последовательности, получаемая из времени удерживания, может быть использована для повышения достоверности идентификации пептидов, а значит, и белков протеома организма. Как следует из рис. 56, корреляция между предсказанным и наблюдаемым временем удерживания в модели BioLCCC заметно лучше, чем в аддитивной модели.
Рис. 6. Сравнение расчетных в рамках модели BioLCCC (а) и аддитивной модели [4] (б) и экспериментально наблюдаемых времен удерживания последовательностей пептидов белка BSA (табл. 2). R2 = 0.79 (а) и 0.66 (б).
Такой же анализ можно применить и к последовательностям триптических пептидов белка альбумина BSA. Для них корреляция между предсказанными и экспериментальными временами удерживания приведена на рис. 6. В целом, однако, степень корреляции в данном случае заметно хуже, чем для белков E. coli. Причина этого пока не вполне ясна. В отличие от белков E. coli для альбумина мы не ограничивались только последовательностями, достоверность которых более 95%. На рис. 6 и в табл. 2 представлены все последовательности, идентифицированные Mascot по массам именно как последовательности, присутствующие в альбумине. На наш взгляд, это лишний раз доказывает, что идентификация последовательностей пептидов только по массам (даже пептидов, полученных из белка с известной первичной структурой) обладает невысокой достоверностью.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основании приведенных экспериментальных исследований можно сделать следующий вывод: модель BioLCCC правильно схватывает основные черты хроматографического разделения пептидов и позволяет предсказать возможность разделения последовательностей, имеющих весьма тонкие различия в их первичной структуре. Масштаб различий в стандартных энергиях адсорбции аминокислотных остатков на обращенной фазе типа -С18 в паре вода-ацетонитрил с добавками кислоты (pH 2.0), по-видимому, соответствует действительности. Тем самым модель
ВюЬССС может быть использована для оценки возможностей разделения тех или иных последовательностей пептидов, определения "дефектности" этих последовательностей, их модификаций в реальных условиях хроматографического эксперимента.
Следует сказать, что эта модель требует уточнения в тех случаях, когда в цепи имеются заряженные аминокислотные остатки.
Наконец, "разрезание" длинных цепей белков путем ферментативного гидролиза трипсином, возможно, и не является необходимым с точки зрения их хроматографического разделения. Восприимчивость взаимодействия макромолекулы с поверхностью к слабым изменениям ее "текста" (например, к перестановкам двух остатков, замене или модификации одной аминокислоты) может оказаться заметно сильнее именно для длинных цепей, что следует из теоретического анализа адсорбции гетерополимеров [8]. Для хроматографического исследования первичной последовательности белков и применения модели ВюЬССС для поиска оптимальных условий разделения необходимо перевести белки из глобулярного в клубкообразное состояние (денатурировать). При нахождении белков в глобулярном состоянии во взаимодействии с поверхностью будут участвовать лишь аминокислотные остатки, находящиеся снаружи глобулы. В данном случае разделение скорее отражает вторичную или третичную структуру белка, нежели его последовательность. Особый интерес представляет воз-
Таблица 2. Последовательности триптических пептидов альбумина BSA, использовавшиеся при сопоставлении предсказанных и экспериментальных времен удерживания
Последовательность Score* Ir эксп ' мин ÏR теор' мин Последовательность Score* Ïr эксп ' мин ÏR теор' мин
SEIAHR 38 6.7 5.55/19.90 GACLLPK 34 22.18 26.40/32.30
TPVSEK 20 7.58 4.70/18.70 EYEATLEECCAK 80 22.36 38.65/34.90
SEIAHR 38 9.72 5.55/19.90 EYEATLEECCAK 62 22.39 38.65/34.90
TPVSEK 20 10.75 4.70/18.70 CCAADDKEACFAVEGPK 87 22.43 45.05/41.40
SEIAHR 45 11.77 5.55/19.90 AEFVEVTK 58 22.58 27.75/53.60
NYQEAK 22 11.88 4.15/17.20 NECFLSHKDDSPDLPK 29 22.61 42.35/35.50
TPVSEK 35 13.11 4.70/18.70 ECCHGDLLECADDR 51 22.64 42.30/36.00
ATEEQLK 57 13.22 9.15/23.10 EACFAVEGPK 67 22.9 32.35/33.50
AFDEK 22 13.71 4.75/27.60 EACFAVEGPK 57 22.93 32.35/33.50
ATEEQLK 46 13.85 9.15/23.10 YNGVFQECCQAEDK 57 23.14 38.50/34.40
TCVADESHAGCEK 48 14.01 22.60/24.90 YNGVFQECCQAEDK 33 23.17 38.50/34.40
TCVADESHAGCEK 67 14.15 22.60/24.90 DDPHACYSTVFDK 44 24.21 37.25/29.00
IETMR 22 15.21 6.90/28.50 DDPHACYSTVFDK 14 24.24 37.25/29.00
QNCDQFEK 41 15.9 10.95/25.00 KVPQVSTPTLVEVSR 71 24.28 49.80/39.40
QNCDQFEK 54 16.01 10.95/25.00 KVPQVSTPTLVEVSR 27 24.31 49.80/39.40
SHCIAEVEK 58 17.43 22.45/28.50 RHPEYAVSVLLR 88 24.59 56.70/44.60
SHCIAEVEK 64 17.47 22.45/28.50 YLYEIAR 55 24.82 34.80/59.70
LCVLHEK 41 19.6 22.40/33.40 LKPDPNTLCDEFK 56 24.87 40.30/35.50
LCVLHEK 40 19.63 22.40/33.40 LKPDPNTLCDEFK 8 25.1 40.30/35.50
LKECCDKPLLEK 87 19.84 39.85/37.80 KQTALVELLK 83 25.5 52.10/43.20
LKECCDKPLLEK 89 19.88 39.85/37.80 KQTALVELLK 32 25.56 52.10/43.20
NECFLSHK 44 19.94 20.60/40.30 RPCFSALTPDETYVPK 69 25.65 54.40/46.10
ECCDKPLLEK 56 20.04 32.20/30.80 VPQVSTPTLVEVSR 56 26.14 48.85/43.50
KFWGK 29 20.31 8.20/38.90 SLHTLFGDELCK 21 27.06 50.50/41.60
CCTESLVNR 63 20.56 23.90/25.70 LVNELTEFAK 57 27.12 44.15/41.20
CCTESLVNR 63 20.6 23.90/25.70 LVNELTEFAK 21 27.16 44.15/41.20
YICDNQDTISSK 83 21.15 28.20/30.00 QTALVELLK 54 28.46 51.80/38.60
DLGEEHFK 42 21.31 15.15/29.30 LGEYGFQNALIVR 20 29.42 60.65/52.20
FKDLGEEHFK 82 21.66 25.25/28.10
* Параметр Score, определяемый в программе Mascot, характеризует достоверность идентификации последовательности (чем больше, тем выше достоверность).
можность разделения модифицированных белков, для которых можно поставить в том числе и задачу разделения таких белков по месту модификации. Этот вопрос требует дальнейшего экспериментально исследования. Модель ВюЬССС позволяет решать задачу в общем виде и дать оценку возможностям хроматографии на обращенной фазе для "чтения текстов" таких белков.
Что касается других вариантов хроматографи-ческого разделения белков (ионнообменной или афинной), то модель ВюЬССС не специфична к конкретному типу взаимодействий. Для ее применимости важно, чтобы взаимодействие было короткодействующим. В других вариантах хроматографии необходимо переопределить стандартные энергии адсорбции остатков с помощью модель-
ных пептидов, как было сделано для хроматографии на обращенной фазе.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Горшков А.В., Тарасова И.А., Евреинов В В., Горшков М.В. // Высокомолек. соед. Б. 2007. Т. 49. № 4. С. 732.
2. Gorshkov A.V., Tarasova I.A., Evreinov V.V., Savits-ki M.M., Nielsen ML, Zubarev R.A., Gorshkov M.V. // Analyt. Chem. 2006. V. 78. P. 7770.
3. Guo D, Mant C.T, Taneja A.K, Parker J.M.R., Hodges R. // J. Chromatogr. 1986. V. 359. P. 499.
4. Guo D, Mant C.T., Taneja A.K, Hodges R. // J. Chromatogr. 1986. V. 359. P. 519.
5. Mant C.T,. Burke L.T.W., Black J.A., Hodges R. // J. Chromatogr. 1988. V. 458. P. 193.
6. Mant CT, Burke L.TW, Zhou NE, Parker R.J.M., Hodges R. // J. Chromatogr. 1990. V. 485. P. 365.
7. Krokhin O.V., Craig R., V. Spicer V., Ens W., Standing KG, Beavis R.C, Wilkins J.A. // Mol. Cell. Pro-teomics. 2004. V. 3. № 9. P. 908.
8. Обухов С П. // Журн. эксперим. и теорет. физики. 1987. Т. 93. № 6. С. 1973.
9. Spengler B. // J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2004. V. 15. P. 703.
10. Marshall A G., Verdun F.R. Fourier Transforms in NMR, Optical, and Mass Spectrometry: A User's Handbook. Amsterdam: Elsevier, 1990.
11. Nielsen M.L., Savitski MM, Zubarev R.A. // Mol. Cell. Proteomics. 2005. V. 4. № 6. P. 835.
Applicability of the Critical Chromatography Concept to Proteomics Problems: Experimental Study of the Dependence of Peptide Retention Time on the Sequence of Amino Acids in the Chain
I. A. Tarasova3, A. V. Gorshkovb, V. V. Evreinovb, K. Adamsc, R. A. Zubarevc, and M. V. Gorshkova
a Institute of Energy Problems of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, Leninskii pr. 38/2, Moscow, 119334 Russia b Semenov Institute of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, ul. Kosygina 4, Moscow, 119991 Russia c Laboratory for Biological and Medical Mass Spectrometry, Biological and Medical Center, Uppsala University, Box 583, S-75 123 Uppsala, Sweden e-mail: evreinov@polymer.chph.ras.ru)@
Abstract—Experimental data on the separation of synthetic and natural peptides are presented as treated in terms of the separation model proposed by the authors that allows for the chain connectivity of amino acid residues and the cooperative character of their interaction with the surface. It was shown that the model accurately predicts the separation of peptides with identical amino acid contents and different sequences of units in the chain. The differences in the sequence may be permutation of amino acid residues and the presence of terminal groups, amino acid isomers, or mirror sequences in the chain. The separation model was used to predict the retention times of peptides prepared via the enzymatic hydrolysis of E. coli proteins and bovine serum albumin with trypsin. It was shown that the model in general accurately explains the array of experimental data on the separation of such peptides, thus being the first successful attempt to relate the chain sequence to the retention volume.
