CC BY
16МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТО ЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
УДК 636.9:575.16:615.9+615
О ПЕРСПЕКТИВАХ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ -
БИОМОДЕЛЕЙ ДЛЯ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ И ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
Рябых В.П., Колоскова Е.М., Езерский В.А., Трубицина Т.П., Максименко С.В.
ВНИИ физиологии, биохимии и питания животных, Боровск Калужской обл., Российская Федерация
На основе литературных данных и результатов собственных исследований по трансгенным животным проведен анализ работ, направленных на получение трансгенных мышей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы (Nat1 и Nat2) человека, для использования их в качестве биомоделей при испытании фармакологической эффективности и токсичности лекарственных веществ. Дан анализ возможных причин неудач при получении трансгенных мышей, обладающих повышенной экспрессией человеческих генов Natl и Nat2 и передающих трансген по наследству. Обсуждается важность роли промотора при создании генно-инженерных конструкций. Приводятся данные о том, что для получения трансгенных животных методом микроинъекции генных конструкций в пронуклеусы зигот малопригодны разные варианты цитомегаловирусного промотора, т.к. этот промотор начинает включать неконтролируемую экспрессию трансгена на очень ранних стадиях развития эмбриона, что чаще всего приводит к гибели эмбриона. Выдвинуто предположение о возможности получения линий гуманизированных мышей с интегрированными генами Nat1 и Nat2 человека с пониженным уровнем активности эндогенной Nat2 без использования мышей с нокаутом собственных генов Nat1 и Nat2 для скрещивания с трансгенными мышами.
Ключевые слова: фармакология, токсикология, биотрансформация ксенобиотиков, трансгенные мыши, биомодели
Проблемы биологии продуктивных животных, 2015, 2: 5-23
Введение
В настоящее время в клинической практике применяются терапевтические стандарты, основанные на обобщенных данных, полученных на группах пациентов. Однако индивидуальную чувствительность человека к лекарствам и ксенобиотикам в значительной степени предопределяет генетический полиморфизм. Персонализированная медицина предполагает лечение заболевания с учетом генотипа пациента и индивидуальных особенностей экспрессии генов. Генетические особенности человека могут обуславливать существенные различия в реакции даже на одну и ту же дозу разрабатываемого препарата. Получение информации о генетических особенностях пациента позволит точнее подбирать препарат и дозу для достижения наилучшего эффекта при лечений болезней.
Организм человека постоянно сталкивается с большим количеством чужеродных соединений. В процессе эволюции в организме человека и животных возникли ферментативные системы биотрансформации ксенобиотиков, которые принимают участие в метаболизме большого количества как экзогенных (включая лекарства), так и эндогенных субстратов. Реакции биотрансформации условно подразделяют на три фазы, из которых первая представле-
на цитохром-Р450-зависимыми реакциями, а вторая - реакциями конъюгации, осуществляемыми группой ферментов, среди которых значительную роль играет N-ацетилтрансфераза.
N-ацетилтрансфераза (Nat) - один из ферментов второй фазы детоксикации, которая осуществляет N-ацетилирование (обычно - дезактивацию) ароматических и O-ацетилирование (обычно - активацию) гетероциклических аминов, к которым относятся многие канцерогены и некоторые лекарственные препараты. Этот фермент играет важную роль в метаболизме эндогенных и чужеродных соединений ариламидной природы, включая лекарственные препараты. Среди загрязнителей окружающей среды, являющихся субстратами Nat, широко распространены ариламины выхлопных газов двигателей, лакокрасочных производств и некоторые другие промышленные загрязнители, а также биогенные амины, компоненты табачного дыма и пищи.
Однако до последнего времени особенности и механизмы Nat-ацетилирования изучены относительно слабо, что связано, в первую очередь, с отсутствием соответствующих биологических моделей. Отсутствие адекватных биологических моделей тормозит дальнейший прогресс в распознавании интимных процессов, протекающих при развитии онкологических заболеваний, гепатотоксичности, ревматоидных болезней, заболеваний дыхательной и гаст-родуоденальной системы (Каркищенко и др., 2014).
В настоящее время большая часть исследований по изучению воздействия различных веществ на человека (в том числе и лекарственных) проводится на животных. Несмотря на развитие компьютерного моделирования, субклеточных и клеточных технологий, отказаться от экспериментов на многоклеточных организмах вряд ли удастся. Организм млекопитающего чрезвычайно сложен, и надежно прогнозировать ответные реакции на воздействия различных веществ без экспериментальной проверки на животных пока невозможно.
Во всём мире при разработке новых лекарственных средств и оценки их эффективности или токсичности для носителей разных аллелей генов биотрансформации используются чаще всего мыши, как наиболее дешёвый материал. У мыши не менее 95% генов и 80% продуктов их экспрессии имеют большое сходство с таковыми человека. Геном мыши расшифрован и хорошо изучен.
Однако известно, что некоторые группы химических веществ влияют на животных иначе, чем на людей. Различия на уровне клеточного метаболизма существуют не только между животными и людьми, но и между полами и возрастными группами внутри видов. В настоящее время составление прогнозов для людей на основе данных, полученных на животных, вызывает всё больше вопросов и сомнений.
Например, сульфаметазин (SMZ) - специфический субстрат для Nat2 человека у мышей метаболизируется плохо (Glowinski, Weber, 1982). У мышей 4-аминобифенол (ABP) метабо-лизируется исключительно Nat2 (Loehle et al., 1991), тогда как у человека в N-ацетилировании ABP и O-ацетилировании N-hydroxy-ABP в печени участвует, главным образом, Nat2 и в меньшей степени - Nat1, которую принято считать аналогом Nat2 мыши (Doll et al., 2010). Существуют явные видовые различия в Nat-субстратной селективности и функциях. Даже модели дважды нокаутированных по генам Natl/2 мышей имеют определённые ограничения в смысле правомерности переноса результатов на человека (Sugamori et al., 2003).
Различия на уровне клеточного метаболизма существуют не только между человеком и мышью, но и между человеком и другими видами животных. При этом некоторые лекарственные препараты, которые хорошо переносятся лабораторными животными, отрицательно действуют на человека.
В 50-60-х гг. беременным женщинам прописывали успокоительное средство талидомид. Препарат прошел испытания на животных, в которых не было обнаружено токсичности. Как выяснилось позднее, опасные тератогенные свойства талидомида появились только при введении его человеку и отдельным редко используемым видам лабораторных животных. В 60-х гг. в Великобритании погибло несколько тысяч больных астмой, использовавших изопрена-линовые аэрозольные ингаляторы. Доза препарата также отрабатывалась на животных, одна-
ко даже большие дозы препарата лишь незначительно ускоряли сердцебиение у животных. Например, кошки могли переносить дозу в 175 раз большую, чем человек. В 80-х гг. широко применялся противоартритный препарат опрен, который оказался токсичным для человека. Только в Великобритании было зафиксировано несколько тысяч случаев отравления этим препаратом, часть из которых имела летальный исход.
Имеется много случаев и обратного характера, когда препараты, хорошо переносимые человеком, отрицательно действуют на лабораторных животных. Например, аспирин настолько ядовит для животных, что вызывает врожденные пороки у мышей и крыс, а гибель кошек вызывает доза, равная примерно одной десятой процента человеческой дозы, полученная один раз в три дня. Ибупрофен вызывает почечную недостаточность у собак при малых дозах. Кортизон хорошо переносится человеком, но у мышей вызывает пороки развития. Пенициллин также хорошо переносится человеком, но оказывает отрицательное действие на морских свинок и хомяков. Фенобарбитал и сахарин относительно хорошо переносится человеком, а у крыс соответственно вызывают рак печени и рак мочевого пузыря.
Также хорошо известна история с открытием пенициллина, к которому вначале относились скептически потому, что он убивал бактерий в чашке Петри, но не работал на подопытных кроликах. И лишь, когда Флемминг от безысходности ввел пенициллин больному пациенту, выяснилось, что он эффективно уничтожает бактериальные инфекции в организме человека.
В настоящее время в ряде исследований систематически и критично оценивают вклад разных видов животных в продвижение биомедицинских исследований. Например, у шимпанзе, инфицированных ВИЧ, не развиваются симптомы СПИДа, как у людей. Мыши вообще не болеют СПИДом, поэтому для изучения действия различных препаратов на ВИЧ специально была получена линия трансгенных мышей, восприимчивых к этому вирусу (^акига Й а1., 1992).
Ежегодно с рынка отзывают лекарственные препараты, которые были сертифицированы как безвредные по результатам испытаний на животных, но вызвали тяжелые побочные явления и даже смерть у людей. В развитых странах неблагоприятные реакции на лекарственные препараты занимают четвертое место среди причин смерти. Только в США ежегодно умирает свыше 100 тыс. человек, а около 2 млн. пациентов получают тяжелые заболевания в результате приема лекарств, которые были проверены на животных. В Великобритании каждый год умирают или тяжело заболевают из-за побочных эффектов от медицинских препаратов свыше 70 тыс. человек. Талидомид, опрен, FIAU и эралдин - все эти лекарственные препараты вызвали у людей серьезные побочные явления, которые не были выявлены во время испытания на животных. Так, спустя лишь три месяца после начала продаж, с рынка был отозван троглитазон - лекарственный препарат для больных диабетом. Он стал причиной многих случаев почечной недостаточности и нескольких смертей, хотя прошел все испытания на животных. Лекарственные средства некоторых известных фармацевтических компаний вызывали такие серьезные побочные явления, что эти компании вынуждены были удовлетворять судебные иски на очень крупные суммы.
Таким образом, существенным ограничением в использовании животных моделей для изучения метаболизма лекарств и оценки риска их применения для человека является экстраполяция результатов, полученных в экспериментах на животных, на физиолого-биохимические процессы, происходящие в организме человека, если имеются заметные межвидовые различия в ферментах метаболизма ксенобиотиков. К настоящему времени уже ни у кого не вызывает сомнения, что для снятия этого ограничения необходимо получать трансгенных животных с человеческими генами, чтобы создать более прогнозируемые модели изучения ферментов биотрансформации ксенобиотиков. Такие трансгенные биомодели будут иметь каталитическую активность ферментов, в большей степени сравнимую с таковой в клетках человека, и могут дать более точный прогноз реакции организма человека на тот или иной ксенобиотик. В последнее время все большее место при испытаниях фар-
макологической эффективности и токсичности новых лекарственных средств отводится трансгенным животным, в геноме которых интегрированы соответствующие гены человека -так называемые гуманизированные животные. Однако при получении гуманизированных трансгенных животных возникает целый ряд проблем, без решения которых невозможно получение полноценных животных-биомоделей.
Цель данного сообщения — систематизация литературных данных и результатов собственных исследований для обоснования стратегии получения трансгенных мышей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы (Natl и Nat2) человека для использования их в качестве биомоделей, в том числе, при испытании фармакологической эффективности и токсичности новых лекарственных средств.
Какие факты необходимо учитывать при получении трансгенных мышей с интегрированными генами Natl и Nat2 человека
При получении трансгенных животных любой направленности необходимо иметь хотя бы ориентировочные ответы на следующие основные вопросы:
• В каких органах и тканях в норме экспрессируется собственный ген животного-хозяина, аналогом которого будет являться трансген?
• На какой стадии развития организма начинает экспрессировать этот ген у животного?
• В каких физиолого-биохимических процессах принимает участие продукт экспрессии собственного гена животного-хозяина, аналогом которого будет являться трансген?
• В каких органах и тканях планируется вызывать экспрессию трансгена?
• Как может повлиять повышенный уровень продукта экспрессии трансгена, попавшего в кровь, на физиолого-биохимические процессы, происходящие в организме животного, и на его жизнеспособность?
Приступая к работе по получению трансгенных мышей с интеграцией в их геном нуклеотидных последовательностей генов Natl и Nat2 человека, следует учитывать следующие моменты, дающие в определённой степени ответы на выше поставленные вопросы.
Согласно современным представлениям, Nat2 человека, как типичный фермент, ме-таболизирующий ксенобиотики (в том числе и лекарства), синтезируется в клетках печени и в кишечном эпителии (Ilett et al., 1994; Windmill et al., 1997; Hickman et al., 1998; Jenne, 2002). Небольшой уровень экспрессии гена Nat2 обнаружен у человека в молочной железе, в эпителии мочевого пузыря и предстательной железе (Kloth, 1994; Sadrieh et al., 1996; Leff et al., 1999), тогда как экспрессия гена Natl у человека обнаружена почти во всех тканях, включая лейкоциты и эритроциты (Ohsako, Deguchi, 1990; Cribb et al., 1991; Risch et al., 1996; Hickman et al., 1998). Было отмечено, что ген Natl начинает экспрессироваться у человека в ранний эмбриональный период (Payton et al., 1999). В человеческой плаценте на ранних стадиях развития уровень экспрессии гена Natl в 1000 выше, чем Nat2 (Hickman et al., 1975; Smelt et al., 1999). Позднее было показано, что этот ген начинает экспрессироваться уже в эмбрионах на стадии бластоцисты, т.е. ещё до момента имплантации и нейруляции (Smelt et al., 2000), что является самым неприятным моментом при получении трансгенных мышей с интегрированным геном Natl человека.
Nat1 имеет оригинальный профиль субстратной специфичности и, в дополнение к метаболизму ксенобиотиков, может участвовать в ацетилировании эндогенных метаболитов, таких как производные и-аминосалицилата (Hughes et al., 1994) и и-аминобензойной кислоты (р-АВА) (Weber, Vatsis, 1993). Потенциальный эндогенный субстрат был идентифицирован как фолатный катаболит и-аминобензоилглутамат (р-ABGlu) (Minchin, 1995; Ward, 1995), который выделяется с мочой в N-ацетильной форме (McNulty, 1993; McPartlin et al., 1993). Фолат имеет протективный эффект в развитии нервной трубки у зародышей и обладает чувствительностью к изменениям экспрессии генов Nat, ответственных за ацетилирование и-аминобензоилглутамата у мышей.
Также было установлено, что мышиный фермент Nat2 является гомологом человеческого Natl в отношении субстратной специфичности и тканевого распределения в организме, и он кодируется полиморфным локусом, который обуславливает быструю или медленную активность ацетилирования. Мышиный Nat 2, подобно человеческому Natl, метаболизирует ^-ABGlu и экспрессируется во многих тканях (Martell et al., 1991; Fretland et al., 1997; Stanley et al., 1997; Payton et al., 1999; Kawamura et al., 2008). У мышей ген Nat2 экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках предымплантационных эмбрионов, т.е. так же, как ген Natl у человека (Payton et al., 1999), тогда как другие гены Nat у мыши и человека не экспрессиру-ются на этой ранней стадии (Smelt et al., 2000; Boukouvala, Sim, 2000). Было показано, что у мышей Nat2 (гомолог человеческого Natl) экспрессируется ранее 9-го дня беременности (Stanley et al., 1997). Изучение различных тканей от неонатальных мышей методом ПЦР в реальном времени показало, что в них преимущественно экспрессируется мышиный Nat2 (Mitchell et al., 1999). На 9,5; 11,5 и 13,5 дни беременности распределение мышиного Nat2 в тканях было неравномерным; он концентрировался преимущественно в развивающейся нервной трубке, что может быть важным фактором ввиду защитного эффекта фолата в предотвращении дефектов развития нервной трубки (MRC, 1991). У взрослых мышей (Stanley et al., 1997) и других грызунов (Kawamura et al., 2008) эквивалент человеческого Natl экспрессируется в клетках Пуркинье мозжечка (Stanley et al., 1997). Исследования, проведенные на мозжечке взрослых людей, также показали аналогичную экспрессию Natl в клетках Пуркинье (Johnson et al., 2000).
Результаты сравнительного исследования экспрессии мышиного Nat2 и человеческого Natl в раннем развитии позволяют использовать мышь в качестве модели для изучения экспрессии этого гена у человека.
Получение трансгенных животных, продуцирующих биологически активные вещества (БАВ), у которых продукты экспрессии трансгена поступают в кровь, является весьма сложным мероприятием, т.к. эти вещества, обладая высокой активностью, при попадании в кровь чаще всего вызывают изменения в системах регуляции физиолого-биохимических процессов, что приводит к нарушению гомеостаза и существенным отклонениям в функционировании организма.
Наиболее надёжным направлением является получение трансгенных животных, у которых БАВ белковой природы продуцируются отдельными органами «на экспорт» (молочная железа, мочевой пузырь, предстательная железа и др.), минуя попадание их в кровь. Принципиальная возможность получения таких трансгенных животных обусловлена механизмом тканеспецифической экспрессии, определяемой регуляторными последовательностями генов, которые используются в качестве промоторов при создании генно-инженерных конструкций. Например, при получении трансгенных животных, продуцирующих с молоком БАВ фармакологического назначения, в качестве промоторов в генно-инженерных конструкциях используют регуляторные участки генов основных белков молока, которые обеспечивают тканеспе-цифическую экспрессию трансгена только в клетках молочной железы. Синтезированный целевой белок выводится из организма животного с молоком, не попадая в кровоток и не оказывая влияния на организм животного, т.к. молочная железа является уникальной изолированной системой, производящей продукт «на экспорт» (Clark et al., 1987; Pursel et al., 1989; Езерский и др., 2013). Аналогичным образом, с использованием конструкции, содержащей пробазиновый промотор, тканеспецифичный для предстательной железы, были получены трансгенные мыши, у которых была в 15 раз увеличена активность Nat2 человека в предстательной железе (тест с сульфаметазином), тогда как активность других Nat2 (N-, O-, или N,O-ацетилтрансферазы) не была увеличена (Leff et al., 1999).
Таким образом, к настоящему времени известны следующие факты, которые необходимо учитывать при получении трансгенных мышей с интегрированными генами Natl и Nat2 человека:
• Nat2 у человека синтезируется, главным образом, в клетках печени и в кишечном эпителии и небольшой уровень экспрессии гена Nat2 был обнаружен у человека в молочной железе, в эпителии мочевого пузыря и в предстательной железе;
• экспрессия гена Natl у человека обнаружена почти во всех тканях, включая лейкоциты и эритроциты;
• ген Natl у человека начинает экспрессироваться уже на стадии бластоцисты что является самым неприятным моментом при получении трансгенных животных с интегрированным геном Natl человека;
• мышиный Nat2 является гомологом человеческого Nat1 в отношении субстратной специфичности и тканевого распределения в организме;
• ген Nat2 у мышей экспрессируется в эмбриональных стволовых клетках предымпланта-ционных эмбрионов, так же, как и ген Natl у человека.
Анализ работ по получению трансгенных мышей с интегрированными в их геном нуклеотидными последовательностями генов Natl и Nat2 человека
Первое краткое сообщение о получении трансгенных мышей с интегрированным геном Nat2 человека, продуцирующим фермент в кровь, было сделано группой исследователей из Оксфордского университета в 2000 г. на II Международном симпозиуме по Nat (Erickson et al., 2000). По сообщению авторов, в результате случайной интеграции трансгена, им удалось получить мышей, которых можно было скрещивать между собой. Однако уровень экспрессии человеческого Nat2 в организме полученных мышей оказался невысоким. После этого никаких сообщений от этой группы авторов по данной проблеме не поступало.
В 2003 г. вторая группа исследователей из Оксфордского университета (Sim et al., 2003) также сообщила о получении трансгенных мышей методом трансплантации в бласто-цисты эмбриональных стволовых клеток, генетически трансформированных с использованием генно-инженерной конструкции, состоящей из кДНК гена Natl человека под сильным многоцелевым цитомегаловирусным промотором (cmv), которая была целенаправленно интегрирована внутрь локуса мышиного гена Nat2.
Как и следовало ожидать, все рождённые первичные трансгенные мыши в этом эксперименте оказались химерами, но их было очень мало, т.к. наблюдалась резорбция многих эмбрионов и ненормальное развитие большей части плодов. Из небольшого числа химерных мышей, полученных в этом эксперименте, некоторые особи имели узловатые хвосты. Ненормальности подобного типа наблюдались у животных, которые использовались в качестве моделей для изучения дефектов развития нервной трубки у плодов (Murdoch et al., 2003).
Авторам не удалось скрестить немногочисленное потомство живых химерных мышей для получения гомозиготных линий трансгенных мышей, обладающих повышенной экспрессией человеческого Natl и способностью передавать трансген потомству (Sim et al., 2003). В связи с этим было выдвинуто предположение, что повышенный уровень экспрессии трансгенов Nat человека приводит к продукции изоферментов Nat, которые метаболизируют р-ABGlu у мышей, что является вредным фактором в раннем развитии и в результате этого происходит резорбция эмбрионов или рождение дефектных детёнышей (Sim et al., 2003). Это предположение авторов базировалось на более ранних работах, в которых было установлено, что одним из эндогенных субстратов для Nat1 является фолатный катаболит р-ABGlu (Minchin et al., 1995; Ward et al., 1995), а сам фолат обладает протективным эффектом при развитии нервной трубки у зародышей и является чувствительным к изменению экспрессии генов Nat, ответственных за ацетилирование р-ABGlu у мышей.
Результаты всех этих исследований привели авторов работы к заключению, что высокий уровень экспрессии Natl человека у трансгенных мышей в период эмбрионального развития приводит к нарушению механизма защитного действия фолата на развитие нервной трубки и гибели большей части эмбрионов или к ненормальному развитию плодов (Sim et
al., 2003). После неудачных экспериментов по получению трансгенных мышей с интегрированными в их геном генами Nat человека эта группа исследователей прекратила работы в данном направлении.
Позднее группа исследователей из университета штата Аризона (Cao et al., 2005) на основе анализа результатов оксфордской группы (Sim et al., 2003) предприняла попытку получить трансгенных мышей с интегрированными в их геном генами Natl и Nat2 человека методом микроинъекции в пронуклеусы зигот генно-инженерных конструкций, включающих кДНК генов Nat человека под цитомегаловирусным промотором (cmv). На основании результатов своих исследований эта группа в 2005 г. опубликовала статью под названием: «У трансгенных мышей может быть достигнут только низкий уровень экзогенной N-ацетилтрансферазы » (Cao et al., 2005).
Авторами было получено 5 первичных (F0) трансгенных мышей — основателей линий с интегрированной конструкцией cmv-hNatl. Число копий трансгена варьировало от 1 до 17. Человеческая мРНК Natl была определена в печени, лёгких, почках и мозге трансгенных мышей. Наличие функционального белка было определено при измерении активности Nat с использованием и-аминобензойной кислоты (РАВА) как селективного субстрата для Natl человека и Nat2 мыши (Estrada-Rodgers et al., 1998; Payton et al., 1999; Hein et al., 2000). Несмотря на наличие большого числа копий трансгена у некоторых линий трансгенных мышей, у них было обнаружено только умеренное увеличение уровня ферментной активности в разных тканях или вообще не было отмечено никакого её увеличения. Статистически значимое увеличение ферментной активности было выявлено только в печени на 10-50% при сравнении с контролем (Cao et al., 2005).
С конструкцией, в которой к cmv-промотору был добавлен промотор НААТ, тканес-пецифический для печени, были получены две первичные (F0) трансгенные мыши основатели линий с 5 и 24 копиями трансгена. Однако, несмотря на большое число копий трансгена, увеличения активности Nat 2 в печени трансгенных мышей не произошло, по сравнению с контролем.
С конструкцией cmv-Nat 2 были получены 3 первичные (F0) трансгенные мыши основатели линий, у которых число копий трансгена варьировало от 1 до 5. В печени этих мышей было найдено умеренное количество мРНК Nat2 человека. Активность фермента в печени, измеренная с изониазидом (INH) — селективным субстратом для Nat2 человека и Nat1 мыши, была в 2 раза выше, по сравнению с контролем (Cao et al., 2005).
Попытки получения трансгенных мышей, гомозиготных по гену Natl, оказались безуспешными. Авторы сделали предположение, что это обусловлено восприимчивостью трансгенных мышей к повышенному уровню продуктов экспрессии трансгена.
В этом исследовании был обнаружен интересный факт: присутствие трансгена Natl человека вызывало в печени мышей увеличение количества Nat1 мРНК в 2-3 раза, тогда как у трансгенных мышей с интегрированным геном Nat2 человека количество эндогенной мРНК Nat1 изменялось незначительно в печени, лёгких, почках и мозге. В противоположность этому, у трансгенных мышей с интегрированным геном Nat2 человека синтез эндогенной мРНК Nat2 в печени и других тканях мышей был сильно подавлен (уменьшение в 6 раз).
Авторы этого исследования также приходят к выводу о трудности достижения значительного повышения уровня экспрессии трансгена у мышей, трансгенных по генам Nat. Выживают только животные с относительно низким уровнем экспрессии трансгена. Однако в этом исследовании количество живых мышей с интегрированным геном Natl человека и передающих трансген потомству было выше, чем в исследованиях группы из Оксфордского университета (Sim et al., 2003). Этот факт авторы (Cao et al., 2005) попытались объяснить различиями в линиях мышей, используемых в работе этих двух групп.
На наш взгляд, различия в результатах исследований этих групп связаны со способом получения трансгенных животных. Оксфордская группа (Sim et al., 2003) получала трансгенных животных методом введения генетически трансформированных клеток в бластоцисты,
что изначально предполагает получение химерных животных, последовательное скрещивание которых в конечном итоге может привести к созданию животных, передающих трансген потомству. Однако при таком способе получении химерных животных интеграция трансгена будет в высшей степени мозаичной и только незначительная часть генетически трансформированных клеток может принять участие в формировании популяции гоноцитов, являющихся источниками генеративных клеток. В результате этого трансгенные животные, родившиеся живыми, в очень редких случаях будут передавать трансген потомству.
Исследователи из Аризонского университета (Cao et al., 2005) получали трансгенных животных методом микроинъекции генно-инженерных конструкций в пронуклеусы зигот; при использовании этого метода мозаичность встраивания трансгена в геном хозяина значительно ниже, чем при введении генетически трансформированных клеток в бластоцисты. Поэтому и передача трансгена потомству первичными трансгенными мышами, полученными этой группой, была выше.
Но неудачным моментом в исследовании аризонской группы, на наш взгляд, является использование при создании конструкций цитомегаловирусного промотора, который является мощным многоцелевым промотором, вызывающим экспрессию трансгена во многих клетках и тканях, включая бластомеры ранних эмбрионов. Этот промотор хорош для генетической трансформации культур клеток, которые содержат несколько сотен тысяч клеток, и поэтому гибель определённой части клеток с повышенной экспрессией трансгена не оказывает существенного влияния на общие показатели эффективности трансформации клеток. Однако при введении конструкций с цитомегаловирусным промотором в единичные одноклеточные зиготы в дальнейшем чаще всего будет приводить к гибели этих эмбрионов.
Наши исследования, проведенные с использованием генно-инженерной конструкции, включающей ген гранулоцит-колониестимулирующего фактора под промотором гена aSl-казеина крупного рогатого скота и репортёрный ген зелёного белка под цитомегаловирусным промотором (cmv) показали (рис. 1-3), что cmv-промотор включал экспрессию гена зелёного белка уже на стадии двух бластомеров, а в эмбрионах, погибших на ранних стадиях развития, наблюдалась сильная экспрессия гена зелёного белка (Езерский и др., 2013). Эти данные наводят на мысль, что чрезмерная экспрессия гена зелёного белка, обусловленная действием cmv-промотора, приводит к резкому смещению синтетических процессов в сторону синтеза чужеродного зелёного белка, что приводит к гибели эмбриона. По-видимому, при использовании для получения трансгенных животных конструкций, включающих ген Natl человека под мощным cmv-промотором, на ранних стадиях развития эмбриона начинают действовать сразу два процесса, неблагоприятных для развития эмбриона. Во-первых, при высоком уровне экспрессии трансгена происходит усиленное отвлечение аминокислот на синтез чужеродного белка под действием cmv-промотора, что само по себе может приводить к гибели эмбрионов (рис.1-3). Во-вторых, повышенный синтез фермента Nat1 человека, который вызывает снижение уровня фолиевой кислоты, и тем самым может провоцировать нарушения в процессе формирования нервной трубки и ненормальное развитие плодов.
Таким образом, анализ результатов исследования группы из Аризонского университета (Cao et al., 2005) наводит на мысль, что неудачи в получении трансгенных животных с интегрированными генами Nat человека обусловлены неудачным выбором cmv- промотора при создании генно-инженерных конструкций, использованных в этом эксперименте. Это предположение подтвердилось и в последующих исследованиях этой группы.
Принимая во внимание тот факт, что ген Natl человека начинает экспрессироваться уже на стадии эмбриона, а повышенный синтез фермента Nat1 человека может провоцировать ненормальное развитие плода, исследователи из Аризонского университета (Cao et al., 2010) попытались при получении трансгенных мышей с интегрированным геном Natl человека использовать конструкцию с индуцибельным промотором. В качестве такого промотора был использован минимальный cmv-промотор с тетрациклиновой регуляторной системой. Предполагалось, что эта конструкция не будет экспрессироваться во время развития плода до
его рождения и оказывать на него вредного влияния, а экспрессия начнётся только после рождения в результате индукции доксициклином, который можно давать животному с кормом или водой. Были получены 4 первичные (F0) трансгенные мыши — основатели линий с интегрированной конструкцией cmv-hNatl. Однако и в этом эксперименте при индукции экспрессии трансгена наблюдалось лишь небольшое увеличение активности Natl человека в почках трансгенных мышей.
А Б
Рис. 1. Умеренная экспрессия маркерного гена зелёного белка под сту-промотором в развивающемся эмбрионе (А - микроскопия в обычном свете, Б - в синем свете).
А Б
Рис. 2. Мощная экспрессия маркерного гена зелёного белка под сту-промотором в одном из бластомеров (указан стрелкой) эмбриона, погибшего на стадии двух бластомеров
(А - в синем свете, Б - в обычном свете).
Рис. 3. Эмбрионы, погибшие на ранних стадиях развития. Наблюдается сильная экспрессия маркерного гена зелёного белка под cmv- промотором
в бластомерах.
Авторы не приводят данные по эмбриональной смертности и нарушениям в развитии плодов, но в заключении вновь возвращаются к положению, выдвинутому ими ранее, что повышенный уровень экспрессии трансгена (Natl человека) в организме мышей вызывает критическое нарушение баланса в регуляции фолата с вытекающими из этого отрицательными последствиями (Cao et al., 2010). Исходя из этого заключения авторов, можно сделать вывод, что индуцибельный cmv-промотор по каким-то невыясненным причинам не сработал и не дал ожидаемых результатов.
После этих неудачных попыток получения полноценных трансгенных мышей c высоким уровнем экспрессии Natl и Nat2 человека и передающих трансген потомству, в 2011 г. группа канадских исследователей из университета г. Торонто опубликовала статью, в которой сообщалось о получении одной первичной (F0) трансгенной мыши - основательницы линии с интегрированным геном Nat2 человека (Sugamori et al., 2011). Эта мышь была получена методом микроинъекции в пронуклеус зиготы конструкции, состоящей из кДНК гена Nat2 человека и энхансер/промоторной области гена альбумина мыши, которая была использована с целью вызывания экспрессии трансгена целенаправленно в печени. В геном этой мыши встроилась только одна копия трансгена.
О частоте интеграции трансгена в геном хозяина и об общей эффективности технологии трансгеноза авторы этой работы не сообщают, поэтому трудно судить о влиянии экспрессии трансгена на развитие эмбрионов, эмбриональную смертность, жизнеспособность рождённого потомства и частоту нарушений постнатального развития. Судя по тому, что была получена только одна мышь, отрицательное влияние повышенной экспрессии трансгена было значительным. В обсуждении результатов авторы также придерживаются версии исследователей из Аризонского университета (Cao et al., 2005) об отрицательном влиянии повышенного уровня экспрессии Nat человека в организме трансгенных мышей на эмбриональное развитие и жизнеспособность потомства (Sugamori et al., 2011).
В этом исследовании (Sugamori et al., 2011) основателем линии послужила только одна мышь, в геном которой интегрировалась только одна копия трансгена, которая создавала не очень высокий уровень продукта экспрессии трансгена и, как полагают авторы, благодаря этому мышь родилась живой и способной передавать трансген потомству.
Если признать эту версию об одной копии трансгена корректной, то можно предположить, что для получения трансгенных животных (мышей) с генами Natl и Nat2 человека целесообразно использовать генно-инженерные конструкции, созданные на основе ретрови-русных векторов, потому что эти конструкции интегрируются в геном хозяина только в количестве одной копии (Haskell, Bowen, 1995; Chan et al., 1998; Рябых и др., 2007).
В дальнейшем мышь, полученная канадской группой исследователей, была скрещена с мышами дикого типа В6, и она передавала трансген потомству. Трансмиссия трансгена потомкам составляла около 50%, что свидетельствует о встраивании трансгена во всю популяцию гоноцитов. Эта мышь послужила основателем трансгенной линии, которая была получена в результате скрещивания на протяжении 10-ти генераций.
Активность фермента Nat2 человека в печёночном цитозоле трансгенных мышей этой линии, измеренная с использованием сульфаметазина (SMZ) — селективного субстрата для Nat2 человека — была в 40-80 раз выше, чем у мышей В6 дикого типа. При этом активность фермента у самцов была в 2 раза выше, чем у самок. В плазме крови у трансгенных мышей также был повышен уровень активности Nat2 человека.
Ещё ранее этой группой исследователей были получены мыши с нокаутом генов Natl и Nat2 для изучения роли этих генов в жизнедеятельности организма (Sugamori et al., 2003). Первичные исследования показали, что фенотипически эти мыши были меньше по размерам тела, но отсутствие у них экспрессии генов Natl и Nat2 не оказалось критическим для развития и физиологического гомеостаза (Sugamori et al., 2003), несмотря на то, что мыши с отсутствующим геном Nat2 не экскретировали р-ABGlu, который определяется в моче потомков мышей дикого типа (Wakefield et al., 2007). Однако последующие дополнительные исследования показали, что у потомков этих мышей имеются врождённые пороки воспроизводительной системы и нарушение соотношения в половой принадлежности (Wakefield et al., 2007; Wakefield et al., 2007). Кроме того, у потомков, по крайней мере, одного из прародителей с нокаутом гена Nat2 наблюдались дефекты со зрением. Эти дефекты, по мнению авторов, могли быть связаны с изменением метаболизма фолиевой кислоты (Wakefield et al., 2007). Известно, что недостаток фолиевой кислоты может быть тератогенной причиной миеломе-нингоцеле (Laurence et al., 1981) и рассечения верхней губы с рассечением или без рассечения твёрдого нёба (Lammer et al., 2004).
Позднее потомки трансгенной мыши с интегрированной конструкцией, состоящей из кДНК гена Nat2 человека и энхансер/промоторной области гена альбумина мыши, были скрещены с мышами, имеющими двойной нокаут обоих генов Natl и Nat2. Целью этого скрещивания было исключить влияние мышиной эндогенной Nat-активности на процессы, происходящие в организме мышей под действием интегрированного чужеродного гена Nat2 человека, чтобы использовать полученных мышей в качестве модели для прогноза реакции на действие ариламинов или гетероциклических аминов у человека.
Принимая во внимание результаты исследований группы из Аризонского университета (Cao et al., 2005), которые свидетельствуют о том, что экспрессия трансгена Nat2 человека значительно подавляет синтез эндогенной мышиной мРНК Nat2 (аналог Nat1 человека) в печени и других тканях трансгенных мышей, можно предположить, что путём скрещивания между собой мышей, трансгенных по Natl и Nat2 человека, можно получить линии мышей, у которых будут экспрессироваться одновременно трансгены Natl и Nat2 человека на фоне пониженного уровня мышиного эндогенного Nat2, т.е они будут иметь более «человеческий» профиль ацетилирования. Эти линии гуманизированных мышей могут быть в определённой степени схожи с линиями, полученными от скрещивания трансгенных мышей по Nat2 человека с линией мышей с двойным нокаутом обоих генов Natl, Nat2 (Sugamori et al., 2011). Если же учесть, что у мышей, нокаутных по генам Nat, наблюдаются определённые физиолого-биохимические и морфологические нарушения, то вариант получения гуманизированных мышей путём скрещивания между собой линий мышей, трансгенных по Natl и Nat2 человека, без использования нокаутных животных может оказаться вполне приемле-
мым. Таким образом, для получения гуманизированных трансгенных мышей с генами Nat человека и с минимальным влиянием эндогенных Nat мыши на процессы ацетилирования, можно обойтись без использования нокаутных животных. Можно предположить, что в результате такого скрещивания будут получены линии гуманизированных мышей, которые могут служить хорошими моделями для прогнозирования реакции на воздействие арилами-нов или гетероциклических аминов у человека.
Заключение
Анализ литературных данных свидетельствует, что при получении полноценных трансгенных мышей с высоким уровнем экспрессии генов Natl и Nat2 человека и передающих трансген потомству, возникают определённые трудности. Эти трудности связаны с тем, что экспрессия гена Natl человека начинается в эмбрионах ещё до момента имплантации и нейруляции. Повышенный уровень экспрессии трансгенов Nat человека в этот период приводит к снижению уровня фолиевой кислоты в эмбрионах и плодах мышей, что вызывает резорбцию эмбрионов или рождение детёнышей со значительными дефектами. По мнению исследователей, занимавшихся получением трансгенных мышей с генами Natl и Nat2 человека, выживают только потомки с невысоким уровнем экспрессии трансгена, имеющие чаще всего одну копию трансгена. Если признать версию об одной копии трансгена корректной, то можно предположить, что для получения трансгенных мышей с генами Natl и Nat2 человека целесообразно использовать генно-инженерные конструкции, созданные на основе ретрови-русных векторов, потому что эти конструкции интегрируются в геном хозяина только в количестве одной копии.
Существенным моментом, на который следует обратить внимание при получении трансгенных животных, в частности, мышей с интегрированными генами Natl и Nat2 человека, является подбор промоторов для генно-инженерных конструкций. Как показали наши исследования, для получения трансгенных животных малопригодны конструкции с разными вариантами цитомегаловирусного промотора, т.к. этот промотор начинает включать экспрессию трансгена на очень ранних стадиях развития эмбриона, что чаще всего приводит к гибели эмбриона или плода. По нашим данным, чрезмерная экспрессия трансгена на ранних стадиях развития эмбриона, обусловленная действием cmv-промотора, приводит к резкому смещению синтетических процессов в сторону синтеза чужеродного белка, что вызывает усиленное использование аминокислот на синтез этого белка и гибель эмбриона.
Для исключения влияния мышиной эндогенной Nat-активности на процессы, происходящие в организме трансгенных мышей под действием интегрированного чужеродного гена Natl человека, этих мышей скрещивают с мышами, имеющими двойной нокаут обоих генов Natl и Nat2. Если учесть, что экспрессия трансгена Nat2 человека значительно подавляет синтез эндогенной мышиной мРНК Nat2 (аналог Nat1 человека) в печени и других тканях трансгенных мышей, можно предположить, что путём скрещивания между собой мышей, трансгенных по Natl и Nat2 человека, можно получить линии мышей, у которых будут экс-прессироваться одновременно трансгены Natl и Nat2 человека на фоне пониженного уровня мышиного эндогенного Nat2. В результате такого скрещивания могут быть получены линии гуманизированных мышей, которые могут служить хорошими моделями для прогнозирования реакции на воздействие ариламинов или гетероциклических аминов у человека
Таким образом, для получения гуманизированных трансгенных мышей с генами Nat человека и с минимальным влиянием эндогенных ферментов Nat мыши на процессы ацети-лирования можно, по-видимому, обойтись без использования нокаутных животных, у которых наблюдаются определённые физиолого-биохимические и морфологические нарушения. Второй этап наших исследований будет посвящён экспериментальной проверке этого предположения.
ЛИТЕРАТУРА
1. Езерский В.А., Тевкин С.И., Трубицина Т.П., Колоскова Е.М., Шишиморова М.С., Безбородова О. А., Якубовская Р.И., Рябых В.П. Интеграция и тканеспецифическая экспрессия гена лактоферрина человека в молочной железе трансгенных кроликов // Проблемы биологии продуктивных животных. — 2013. — № 4. - С. 33-52.
2. Каркищенко Н.Н., Петрова Н.В., Слободенюк В.В. Высокоспецифичные видовые праймеры к генам Natl и Nat2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных // Биомедицина. — 2014. — № 2. - С. 4-16.
3. Рябых В.П., Шишиморова М.С., Трубицина Т.П., Фаткулина О.Б., Тевкин С.И., Сметанина И.Г. Исследование физиолого-эмбриологических и молекулярно-биологических процессов, лежащих в основе трансгеноза у сельскохозяйственных животных // Труды регионального конкурса научных проектов РФФИ в области естественных наук, Калуга. — 2007. — Вып. 11. - С. 451 -471.
4. Boukouvala S., Sim E. Expression of murine NAT genes in early development // IUBS Birmingham. -2000. - Vol. 7. — P. 36-44.
5. Cao W., Chau B., Hunter R., Strnatka D., McQueen C.A., Erickson R.P. Only low levels of exogenous Nacetyltransferase can be achieved in transgenic mice // Pharmacogen. J. - 2005. - Vol. 5. - P. 255-261.
6. Cao W., Strnatka D., McQueen C.A., Hunter R.J., Erickson R.P. N-Acetyltransferase 2 activity and folate levels // Life Sci. — 2010. - Vol. 86. - P. 103-106.
7. Chan A.W.S., Homan E.J., Ballou L.U., Burns J.C., Bremel R.D. Transgenic cattle produced by reverse-transcribed gene transfer in oocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1998. - Vol. 95. - P. 14028-14033.
8. Clark A.J., Simons J.P., Wilmut I., Lathe R. Pharmaceuticals from transgenic livestock // Trends Biotech. — 1987. — Vol. 5. - Р. 20-24.
9. Cribb A.E., Grant D.M., Millar M.A., Speilberg S.P. Expression of monomorphic arylamine N-acetyltransferase (NAT1) in human leukocytes // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 1991. — Vol. 259. - P.1241-1246.
10. Doll M.A., Zang Y., Moeller T., Hein D.W. Codominant expression of N-acetylation and O-acetylation activities catalyzed by N-acetyltransferase 2 in human hepatocytes // J. Pharmacol. Exp. Ther. — 2010. -Vol. 334. - P. 540-544.
11. Erickson R., Morgan C., McQueen C.A. // 2nd International NAT Workshop. — Eynsham, Oxford, 2000. — Abstract No. 1.
12. Estrada-Rodgers L., Levy G.N., Weber W.W. Substrate selectivity of mouse N-acetyltransferases 1, 2 and 3 expressed in COS-1 cell // Drug Metab Dispo. — 1998. - Vol. 26. - P. 502-505.
13. Fretland A.J., Doll M.A., Gray K., Feng Y., Hein, D.W. Cloning, sequencing, and recombinant expression of Natl, Nat2, und NatS derived from the C3H/HeJ (rapid) and A/HeJ (slow) acetylator inbred mouse: functional characterisation of the activation and deactivation of aromatic amine carcinogens // Toxicol. Appl. Pharmacol. — 1997. — Vol. 142. - P. 360-366.
14. Glowinski I.B., Weber W.W. Genetic regulation of aromatic amine N-acetylation in inbred mice // J. Biol. Chem. — 1982. - Vol. 257. - P. 1424-1430.
15. Haskell R.E., Bowen R.A. Efficient production of transgenic cattle by retroviral infection of early embryos // Mol. Reprod. Dev. — 1995. - Vol. 40. - P. 386-390.
16. Hein D.W., Doll M.A., Fretland A.J., Leff M.A., Webb S.J., Xio G.H. Molecular genetics and epidemiology of the NAT1 and NAT2 acetylation polymorphisms // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. — 2000. — Vol. 9. — P. 29-42.
17. Hickman D., Pope J., Juchau M.R., Namkung M.J., Berry D.L., Zachariah P.K. Oxidative biotransformations of 2-acetylaminofluorenein fetal and placental tissues of humans and monkeys: correlation with arylhydro-carbon hydroxylase activities // Drug Metab. Dispos. — 1975. - Vol. 3. - P. 494-501.
18. Hickman D., Pope J., Patil S.D., Fakis G., Smelt V.M., Stanley L.A., Payton M.A., Unadkat J.D., Sim E. Expression of arylamine N-acetyltransferase in human intestine // Gut. — 1998. - Vol. 42. - P. 402-409.
19. Hughes N.C., Janezic S.A., McQueen K.L., Jewett M.A.S., Castranio T., Bell D.A., Grant D.M. Identification and characterization of variant alleles of human acetyltransferase NAT1 with defective function using p-aminosalicylate as an in-vivo and in-vitro probe // Pharmacogenetics. — 1998. — Vol. 8. - P. 55-66.
20. Ilett K.F., Ingram D.M., Carpenter D.S., Teitel C.H., Lang N.P., Kadlubar F.F., Minchin R.F. Expression of monomorphic and polymorphic N-acetyltransferases in human colon // Biochem. Pharmacol. — 1994. -Vol. 47. - P. 914-917.
21. Iwakura Y., Shioda T., Tosu M. et al. The induction of cataracts byHIV-1 in transgenic mice // AIDS. -1992. - Vol. 6. - No. 10. - P. 1069-1075.
22. Jenne J.W. Partial purification and properties of the isoniazid transacetylase in human liver: its relationship to the acetylation ofp-amino-salicylic acid // Clin. Invest. - 1965. - Vol. 44. - P. 1992-2002.
23. Johnson N., Troen A., Fernando S., Warren D., Nagy Z., Smith A.D., Sim E. Investigation of W-acetyltransferase (NAT1) in Alzheimer's disease: identification of a novel NAT1 allelic variant // Eurotox.
- 2000. - Vol. 9.- P. 59-68.
24. Kawamura A., Westwood I., Wakefield L., Long H., Zhang N., Redfield C., Sim E. Mouse N-acetyltransferase type 2, the homologue of human N-acetyltransferase type 1 // Biochem. Pharmacol. -2008. - Vol. 75. - P. 1550-1560.
25. King C.M., Land S.J., Jones R.F., Debiec-Rychter M., Lee M.S., Wang C.Y. Role of acetyltransferases in the metabolism and carcinogenicity of aromatic amines // Mutat. Res. - 1997. - Vol. 376. - P. 123-128.
26. Kloth M.T., Gee R.L., Messing E.M., Swaminathan S. Expression of N-acetyltransferase (NAT) in cultured human uroepithelial cells // Carcinogenesis. - 1994. - Vol. 15. - P. 2781-2787.
27. Lammer E.J., Shaw G.M., Iovannisci D.M., Finnell R.H. Periconceptional multivitamin intake during early pregnancy, genetic variation of acetyl-N- transferase 1 (NAT1), and risk for orofacial clefts // Birth Defects Res. A Clin. Mol. Teratol. - 2004. - Vol.70. - P. 846-852.
28. Laurence K.M., James N., Miller M.H., Tennant G.B., Campbell H. Double-blind randomized controlled trial of folate treatment before conception to prevent recurrence of neural-tube defects // Br. Med. J. -1981. - Vol. 282. - P. 1509-1511.
29. Leff M.A., Fretland A.J., Doll M.A., Hein D.W. Novel N-acetyltransferase 2 alleles that differ in mechanism for slow acetylator phenotype // Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274. - P. 34519-34522.
30. Loehle J.A., Cornish V., Wakefield L., Doll M.A., Neale J.R., Zang Y., Sim E., Hein D.W., Martell K.J., Vatsis K.P., Weber W.W. Molecular genetic basis of rapid and slow acetylation in mice // Mol. Pharmacol.
- 1991. - Vol. 40. - P. 218-227.
31. McNulty H., McPartlin J., Weir D., Scott J. Folate catabolism is increased during pregnancy in rats // Nutr.
- 1993. - Vol. 123. - P. 1089-1093.
32. McPartlin J., Halligan A., Scott J.M., Darling M., Weir D.G. Accelerated folate breakdown in pregnancy // Lancet. - 1993. - Vol. 341. - P. 148-149.
33. Minchin R.F. Acetylation of p-aminobenzoylglutamate, a folic acid catabolite, by recombinant human ar-ylamine N-acetyltransferase and U937 cells // Biochemistry. - 1995. - Vol. 307. - P. 1-3.
34. Mitchell M.K., Futsche, B.W., McQueen C.A. Developmental expression of JV-acetyltransferases in C57BI/6 mice // Drug Metab. Disp. - 1999. - Vol. 27. - P. 261-264.
35. MRC Vitamin Study Research Group. Prevention of neural tube defects: results of the MRC vitamin study // Lancet. - 1991. - Vol. 338. - P. 131-137.
36. Murdoch J.N., Henderson D.J., Doudney, K., Gaston-Massuet C., Phillips H.M., Paternotte C., Arkell, R., Stanier P., Copp A.J. Disruption of scribble (Scrb1) causes severe neural tube defects in the circletail mouse // Hum. Mol. Genet. - 2003. - Vol. 12. - No. 3. - P. 87-98.
37. Ohsako S. and Deguchi T. Cloning and expression of cDNAs for polymorphic and monomorphic aryla-mine N-acetyltransferases of human liver // J. Biol. Chem. - 1990. - Vol. 265. - P. 4630-4634.
38. Pacific I.G.M., Benicini C., Rane A. Acetyltransferases in humans: development and tissue distribution // Pharmacology. - 1986. - Vol. 32. - P. 283-291.
39. Payton M., Smelt V., Upton A., Sim E. A method for genotyping murine arylamine /V-acetyltransferase type 2 (NAT2): a gene expressed in preimplantation embryonic stem cells encoding an enzyme acetylating the folate catabolite p-aminobenzoylglutamate // Biochem. Pharmacol. - 1999. - Vol. 58. - P. 779-785.
40. Pursel V.G., Pinkert C., Miller K., Campbell R.G., Palmiter R.D., Brinster R.L., Hammer R.E. Genetic engeneering of livestock // Science. - 1989. - Vol. 244. - P. 1281-1288.
41. Risch A., Smelt V., Lane D., Stanley L.A., Van der Slot W., Ward A., Sim E. Arylamine N-acetyltransferase in erythrocytes of cystic fibrosis patients // Pharmacol. Toxicol. - 1996. - Vol. 78. - P. 235-240.
42. Sadrieh N., Davis C.D., Snyderwine E.G. N-acetyltransferase expression and metabolic activation of the food-derived heterocyclic amines in the human mammary gland // Cancer Res. - 1996. - Vol. 56. - P. 26832687.
43. Sim E., Pinter K., Mushtaq A., Upton A., Sandy J., Bhakta S. Arylamine N-acetyltransferases: a phar-macogenomics approach to drug metabolism and endogenous function // Biochem. Soc. Trans. - 2003. -Vol. 31. - P. 615-619.
44. Smelt V.A., Upton A., Adjaye J., Payton M.A., Boukouvala S., Johnson S., Mardon H.J., Sim E. Expression of arylamine /N-acetyltransferases in pre-term placentas and in human pre-implantation embryos // Hum. Mol. Genet. - 2000. - Vol. 9. - P. 1101-1107.
45. Smelt V.A., Mardon H.J., Sim E. Placental expression of arylamine N-acetyltransferases: evidence for linkage disequilibrium between NAT1*10 and NAT2*4 alleles of the two human arylamine N-acetyltransferase loci NAT1 and NAT2 // Pharmacol. Toxicol. - 1999. - Vol.83. - P 149-157.
46. Stanley L.A., Mills I.G., Sim E. Localization of polymorphic A'-acetyltransferase (NAT2) in tissues of inbred mice // Pharmacogenetics. - 1997. - Vol. 7. - P. 121-130.
47. Sugamori K., BrennemanD., Grant D.M. Liver-Selective expression of human arylamine N-acetyltransferase NAT2 in transgenic mice // Drug Metab. Disp. - 2011. - Vol. 39. - P. 882-890.
48. Sugamori K., Wong S., Gaednigk A., Yu V., Abramovici H., Rozmahel R., Grant D. Generation and functional characterization of arylamine N-acetyltransferase Nat1/Nat2 double knockout mice // Mol. Pharmacol. - 2003. - Vol. 64. -P. 170-179.
49. Wakefield L., Cornish V., Long H., Griffiths W.J., Sim E. Deletion of a xenobiotic metabolizing gene in mice affects folate metabolism // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2007. - Vol. 364. -P. 556-560.
50. Wakefield L., Long H., Lack N., Sim E. Ocular defects associated with a null mutation in the mouse arylamine N-acetyltransferase 2 gene // Mamm. Genome. - 2007. - Vol. 18. - P. 270-277.
51. Ward A., Summers M.E., Sim E. Purification of recombinant human N-acetyltransferase type 1 expressed in E.coli and characterisation of its potential role in folate metabolism // Biochem. Pharmacol. - 1995. -Vol. 49. - P. 1759-1767.
52. Weber W.W., Vatsis K.P. Individual variability in p-amino-benzoic acid acetylation by human N-acetyltransferase (NAT1) of peripheral blood // Pharmacogenetics. - 1993. - Vol. 3. - P. 209-212.
53. Windmill K.F., McKinnon R.A., Zhu X.Y., Gaedigk A., Grant D.M., McManus M.E. The role of xenobiotic metabolizing enzymes in arylamine toxicity and carcinogenesis: functional and localization studies // Mutat. Res. - 1997. - Vol. 376. - P. 153-160.
REFERENCES
1. Boukouvala S., Sim E. Expression of murine NAT genes in early development. In: IUBS Birmingham, 7, 2000.
2. Cao W., Chau B., Hunter R., Strnatka D., McQueen C.A., Erickson R.P. Only low levels of exogenous Nacetyltransferase can be achieved in transgenic mice. Pharmacogen. J. 2005, 5: 255-261.
3. Cao W., Strnatka D., McQueen C.A., Hunter R.J., Erickson R.P. N-Acetyltransferase 2 activity and folate levels. Life Sci. 2010, 86: 103-106.
4. Chan A.W.S., Homan E.J., Ballou L.U., Burns J.C., Bremel R.D. Transgenic cattle produced by reverse-transcribed gene transfer in oocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. 95: 14028-14033.
5. Clark A.J., Simons J.P., Wilmut I., Lathe R. Pharmaceuticals from transgenic livestock. Trends Biotech. 1987, 5: 20-24.
6. Cribb A.E., Grant D.M., Millar M.A., Speilberg S.P. Expression of monomorphic arylamine N-acetyltransferase (NAT1) in human leukocytes. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991. 259: 1241-1246.
7. Doll M.A., Zang Y., Moeller T., and Hein D.W. Codominant expression of N-acetylation and O-acetylation activities catalyzed by N-acetyltransferase 2 in human hepatocytes. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2010, 334: 540-544.
8. Erickson R., Morgan C., McQueen C.A. In: 2nd International NAT Workshop. Eynsham, Oxford, 2000, Abstract No. 1.
9. Estrada-Rodgers L., Levy G.N., Weber W.W. Substrate selectivity of mouse N-acetyltransferases 1, 2 and 3 expressed in COS-1 cell. Drug Metab Disp. 1998, 26: P. 502-505.
10. Ezerskii V.A., Tevkin S.I., Trubitsina T.P., Koloskova E.M., Shishimorova M.S., Bezborodova O.A., Yakubovskaya R.I., Ryabykh V.P. [Integration and expression of tissue specific human lactoferrin gene in mammary gland of transgenic rabbits]. Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology. 2013, 4: P. 33-52.
11. Fretland A.J., Doll M.A., Gray K., Feng Y., Hein, D.W. Cloning, sequencing, and recombinant expression of Natl, Nat2, und NatS derived from the C3H/HeJ (rapid) and A/HeJ (slow) acetylator inbred mouse: functional characterisation of the activation and deactivation of aromatic amine carcinogens. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1997, 142: P. 360-366.
12. Glowinski I.B., Weber W.W. Genetic regulation of aromatic amine N-acetylation in inbred mice. J. Biol. Chem. 1982, 257: 1424-1430.
13. Haskell R.E., Bowen R.A. Efficient production of transgenic cattle by retroviral infection of early embryos. Mol. Reprod. Dev. 1995, 40: 386-390.
14. Hein D.W., Doll M.A., Fretland A.J., Leff M.A., Webb S.J., Xio G.H. Molecular genetics and epidemiology of the NAT1 and NAT2 acetylation polymorphisms. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2000, 9: 29-42.
15. Hickman D., Pope J., Juchau M.R., Namkung M.J., Berry D.L., Zachariah P.K. Oxidative biotransformations of 2-acetylaminofluorenein fetal and placental tissues of humans and monkeys: correlation with arylhydro-carbon hydroxylase activities. DrugMetab. Dispos. 1975, 3: 494-501.
16. Hickman D., Pope J., Patil S.D., Fakis G., Smelt V.M., Stanley L.A., Payton M.A., Unadkat J.D., Sim E. Expression of arylamine N-acetyltransferase in human intestine. Gut. 1998, 42: 402-409.
17. Hughes N.C., Janezic S.A., McQueen K.L., Jewett M.A.S., Castranio T., Bell D.A., Grant D.M. Identification and characterization of variant alleles of human acetyltransferase NAT1 with defective function using p-aminosalicylate as an in-vivo and in-vitro probe. Pharmacogenetics. 1998, 8: 55-66.
18. Ilett K.F., Ingram D.M., Carpenter D.S., Teitel C.H., Lang N.P., Kadlubar F.F., Minchin R.F. Expression of monomorphic and polymorphic N-acetyltransferases in human colon. Biochem. Pharmacol. 1994, 47: 914-917.
19. Iwakura Y., Shioda T., Tosu M. et al. The induction of cataracts byHIV-1 in transgenic mice // AIDS, 1992, 6(10): 1069-1075.
20. Jenne J.W. Partial purification and properties of the isoniazid transacetylase in human liver: its relationship to the acetylation of p-amino-salicylic acid. Clin. Invest. 1965, 44: 992-2002.
21. Johnson N., Troen A., Fernando S., Warren D., Nagy Z., Smith A.D., Sim E. Investigation of W-acetyltransferase (NAT1) in Alzheimer's disease: identification of a novel NAT1 allelic variant. Eurotox. 2000, 9: 59-68.
22. Karkishchenko N.N., Petrova N.V., Slobodenyuk V.V. Biomeditsina - Biomedicine. 2014, 2: 4-16.
23. Kawamura A., Westwood I., Wakefield L., Long H., Zhang N., Redfield C., Sim E. Mouse N-acetyltransferase type 2, the homologue of human N-acetyltransferase type 1. Biochem. Pharmacol. 2008, 75: 1550-1560.
24. King C.M., Land S.J., Jones R.F., Debiec-Rychter M., Lee M.S., Wang C.Y. Role of acetyltransferases in the metabolism and carcinogenicity of aromatic amines. Mutat. Res. 1997, 376: 123-128.
25. Kloth M.T., Gee R.L., Messing E.M., Swaminathan S. Expression of N-acetyltransferase (NAT) in cultured human uroepithelial cells. Carcinogenesis. 1994, 15: 2781-2787.
26. Lammer E.J., Shaw G.M., Iovannisci D.M., Finnell R.H. Periconceptional multivitamin intake during early pregnancy, genetic variation of acetyl-N- transferase 1 (NAT1), and risk for orofacial clefts. Birth Defects Res. A Clin. Mol. Teratol. 2004, 70: 846-852.
27. Laurence K.M., James N., Miller M.H., Tennant G.B., Campbell H. Double-blind randomized controlled trial of folate treatment before conception to prevent recurrence of neural-tube defects. Br. Med. J. 1981, 282: 1509-1511.
28. Leff M.A., Fretland A.J., Doll M.A., Hein D.W. Novel N-acetyltransferase 2 alleles that differ in mechanism for slow acetylator phenotype. Biol. Chem. 1999, 274: 34519-34522.
29. Loehle J.A., Cornish V., Wakefield L., Doll M.A., Neale J.R., Zang Y., Sim E., Hein D.W., Martell K.J., Vatsis K.P., Weber W.W. Molecular genetic basis of rapid and slow acetylation in mice. Mol. Pharmacol. - 1991. - Vol. 40. - P. 218-227.
30. McNulty H., McPartlin J., Weir D., Scott J. Folate catabolism is increased during pregnancy in rats. Nutr. 1993, 123: 1089-1093.
31. McPartlin J., Halligan A., Scott J.M., Darling M., Weir, D.G. Accelerated folate breakdown in pregnancy. Lancet. 1993, 341: P. 148-149.
32. Minchin R.F. Acetylation of p-aminobenzoylglutamate, a folic acid catabolite, by recombinant human arylamine N-acetyltransferase and U937 cells. Biochemistry. 1995, 307: 1-3.
33. Mitchell M.K., Futsche, B.W., McQueen C.A. Developmental expression of JV-acetyltransferases in C57BI/6 mice. Drug Metab. Disp. 1999, 27: 261-264.
34. MRC. Vitamin Study Research Group. Prevention of neural tube defects: results of the MRC vitamin study. Lancet. 1991, 338: 131-137.
35. Murdoch J.N., Henderson D.J., Doudney, K., Gaston-Massuet C., Phillips H.M., Paternotte C., Arkell, R., Stanier P., Copp A.J. Disruption of scribble (Scrb1) causes severe neural tube defects in the circletail mouse // Hum. Mol. Genet. 2003, 12(2): 87-98.
36. Ohsako S. and Deguchi T. Cloning and expression ofcDNAs for polymorphic and monomorphic arylamine N-acetyltransferases of human liver. J. Biol. Chem. 1990, 265: 4630-4634.
37. Pacific I.G.M., Benicini C., Rane A. Acetyltransferases in humans: development and tissue distribution. Pharmacology. 1986, 32: 283-291.
38. Payton M., Smelt V., Upton A., Sim E. A method for genotyping murine arylamine /V-acetyltransferase type 2 (NAT2): a gene expressed in preimplantation embryonic stem cells encoding an enzyme acetylating the folate catabolite p-aminobenzoylglutamate. Biochem. Pharmacol. 1999, 58: 779-785.
39. Pursel V.G., Pinkert C., Miller K., Campbell R.G., Palmiter R.D., Brinster R.L., Hammer R.E. Genetic engeneering of livestock. Science. 1989, 244: 1281-1288.
40. Risch A., Smelt V., Lane D., Stanley L.A., Van der Slot W., Ward A., Sim E. Arylamine N-acetyltransferase in erythrocytes of cystic fibrosis patients. Pharmacol. Toxicol. 1996, 78: 235-240.
41. Ryabykh V.P., Shishimorova M.S., Trubitsina T.P., Fatkulina O.B., Tevkin S.I., Smetanina I.G. Trudy regional'nogo konkursa nauchnykh proektov RFFI v oblasti estestvennykh nauk (Proc. regional competition of scientific project of Russ. Fond Basic Res. on natural sciences). Kaluga, 2007, 11: 451-471.
42. Sadrieh N., Davis C.D., Snyderwine E.G. N-acetyltransferase expression and metabolic activation of the food-derived heterocyclic amines in the human mammary gland. Cancer Res. 1996, 56: 2683-2687.
43. Sim E., Pinter K., Mushtaq A., Upton A., Sandy J., Bhakta S. Arylamine N-acetyltransferases: a phar-macogenomics approach to drug metabolism and endogenous function. Biochem. Soc. Trans. 2003, 31: 615-619.
44. Smelt V.A., Upton A., Adjaye J., Payton M.A., Boukouvala S., Johnson S., Mardon H.J., Sim E. Expression of arylamine /N-acetyltransferases in pre-term placentas and in human pre-implantation embryos. Hum. Mol Genet. 2000, 9: 1101-1107.
45. Smelt V.A., Mardon H.J., Sim E. Placental expression of arylamine N-acetyltransferases: evidence for linkage disequilibrium between NAT1*10 and NAT2*4 alleles of the two human arylamine N-acetyltransferase loci NAT1 and NAT2. Pharmacol. Toxicol. 1999, 83: 149-157.
46. Stanley L.A., Mills I.G., Sim E. Localization of polymorphic A'-acetyltransferase (NAT2) in tissues of inbred mice. Pharmacogenetics. 1997, 7: 121-130.
47. Sugamori K., BrennemanD., Grant D.M. Liver-Selective expression of human arylamine N-acetyltransferase NAT2 in transgenic mice. DrugMetab. Disp. 2011, 39: 882-890.
48. Sugamori K., Wong S., Gaednigk A., Yu V., Abramovici H., Rozmahel R., Grant D. Generation and functional characterization of arylamine N-acetyltransferase Nat1/Nat2 double knockout mice. Mol. Pharmacol. 2003, 64: 170-179.
49. Wakefield L., Cornish V., Long H., Griffiths W.J., Sim E. Deletion of a xenobiotic metabolizing gene in mice affects folate metabolism. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007, 364: 556-560.
50. Wakefield L., Long H., Lack N., Sim E. Ocular defects associated with a null mutation in the mouse arylamine N-acetyltransferase 2 gene. Mamm. Genome. 2007, 18: 270-277.
51. Ward A., Summers M.E., Sim E. Purification of recombinant human N-acetyltransferase type 1 expressed in E.coli and characterisation of its potential role in folate metabolism. Biochem. Pharmacol. 1995, 49: 1759-1767.
52. Weber W.W., Vatsis K.P. Individual variability in p-amino-benzoic acid acetylation by human N-acetyltransferase (NAT1) of peripheral blood. Pharmacogenetics. 1993, 3: 209-212.
53. Windmill K.F., McKinnon R.A., Zhu X.Y., Gaedigk A., Grant D.M., McManus M.E. The role of xenobiotic metabolizing enzymes in arylamine toxicity and carcinogenesis: functional and localization studies. Mutat. Res. 1997, 376: 153-160.
To perspectives of producing transgenic mice - biomodel for pharmacological and toxicological research
Ryabykh V.P., Koloskova E.M., Yezerskyy V.A., Trubitsina T.P., Maksimenko S.V.
Institute of Animal Physiology, Biochemistry and Nutrition, Borovsk Kaluga oblast, Russian Federation
ABSTRACT. On the basis of literature data and the results of their own research in production of transgene animals, the works were analyzed made in the field of obtaining transgenic mice with integrated human genes of N-acetyltransferase (Nat1 and Nat2) for using as the biomodels in the pharmacological and toxicological research. The analysis was performed of the possible causes of failures in the producing transgenic mice with increased expression of human genes Nat1 and Nat2 and with ability to transfer the transgenes to offspring. The importance of the role of promoters in creating genetically engineered constructs is discussed. The data are presented that for generating transgenic animals by microinjection of gene constructs into pronuclei, different variants of cyto-megalovirus promoter are ineffective, since this promoters begin to initiate uncontrolled expression of the transgene during very early stages of embryonic development, which often leads to death of the embryo. The possibility is suggested of obtaining lines of humanized mice with integrated human genes Nat1 and Nat2 and reduced activity of endogenous Nat2 without the use of mice knockout own genes Nat1 and Nat2 for crossing with transgenic mice.
Keywords: pharmacology, toxicology, biotransformation of xenobiotics, transgenic mice, biomodels Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology, 2015, 2: 5-22
Поступило в редакцию: 10.02.2015 Получено после доработки: 30.03.2015
Рябых Владимир Павлович, д.б.н., зав. лаб., проф. т. 8 48438 661 34, ylt03@kaluga.ru; Колоскова Елена Михайловна, к.б.н., с.н.с.; Езерский Вадим Аркадьевич, н.с.; Трубицина Татьяна Петровна, к.б.н., с.н.с.; Максименко Сергей Васильевич, к.б.н., с.н.с.
