CC BY
310
Биомедицина • № 3, 2014, C. 4—22
е НОВЫЕ БИОМЕДИЦИНСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Создание гуманизированных мышей для фармакотоксикологических исследований (успехи, неудачи и перспективы)
Н.Н. Каркищенко1, В.П. Рябых2, В.Н. Каркищенко1, Е.М. Колоскова2
1 - ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», Московская область
2 - ФГБУН Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных, г. Боровск
Контактная информация: академик Каркищенко Николай Николаевич, scbmt@yandex.ru
На основе литературных данных и результатов собственных исследований проведен анализ успехов и неудач при получении трансгенных мышей с интегрированными генами Nat и Cyp3A4 человека, для использования их в качестве биомоделей при испытании фармакологической эффективности и токсичности лекарственных веществ. Дан анализ возможных причин неудач при получении трансгенных мышей, обладающих повышенной экспрессией человеческих генов Nat1, Nat2 и Cyp3A4, передающих трансген по наследству. Обсуждается важность роли промотора при создании генно-инженерных конструкций и гуманизированных мышей. Приводятся собственные данные о том, что для получения трансгенных животных методом микроинъекции генных конструкций в пронуклеусы зигот малопригодны разные варианты цитомегаловирусного промотора (cmv). Этот cmv-промотор начинает включать неконтролируемую экспрессию трансгена на очень ранних стадиях развития эмбриона, что зачастую приводит к гибели зародыша. Показаны пути получения гуманизированных мышей с интегрированными генами CYP3A4, а также генами Nat1 и Nat2 человека, с пониженным уровнем активности эндогенной Nat2, без использования мышей с нокаутом собственных генов Nat1 и Nat2 для скрещивания с трансгенными мышами. Анализ собственных результатов и причин неудач в создании трансгенных животных позволил получить нам гуманизированных мышей с интегрированными генами NAT1 и NAT2, обеспечивающими специфическую экспрессию трансгенов, а также создать ДНК-конструкции для животных, несущих ген CYP3A4.
Ключевые слова: трансгенные мыши с интегрированными генами человека, гуманизированные мыши, химерные животные, N-ацетилтрансфераза (Natl и Nat2), цитохром Р450, гены CYP3A4, экспрессия генов Nat1, Nat2 и CYP3A4, выбор и конструирование промоторов, биологические модели, экстраполяция на человека.
Введение
Генетический полиморфизм предопределяет индивидуальную чувствительность человека к лекарствам и ксенобиотикам. Информация о гене-
тических особенностях пациента позволяет персонифицировать препарат, его дозировку. Фармакогенетические исследования в популяционной фармакологии получили новый стимул с ис-
пользованием новых биомоделей [7], развитием фармакомоделирования [3] и альтернативных фармакотоксикологических подходов [5].
Использование принципов GLP в фармакологических исследованиях [7] и новых принципов в фундаментальных биомедицинских исследованиях открыло новый путь к познанию механизмов действия и создания инновационных таргетных лекарств. Безусловный прорыв в изучении биотрансформации лекарств наметился в использовании генно-модифицированных животных, наиболее удобными моделями из которых являются гибридные, инбредные, конгенные и другие мыши.
Геном мыши на 95% совпадает с человеческим. Мыши являются наиболее оптимизированным объектом для межвидовой ксенотрансплантации. Наибольший научный интерес представляют гуманизированные мыши, т.е. трансгенные животные, содержащие функционирующие гены, клетки, ткани или иные органоиды человеческого организма.
В процессе эволюции в организме человека и животных возникли ферментативные системы биотрансформации ксенобиотиков. Эти системы принимают участие в метаболизме как экзогенных, так и эндогенных субстратов. В реакциях биотрансформации условно подразделяют на три фазы, из которых особая роль во второй фазе принадлежит цитохром-Р450-зависимым реакциям и реакциям конъюгации, осуществляемыми целой группой ферментов, среди которых значительную роль играет N-ацетилтрансфераза (NAT).
Обобщая имеющуюся информацию, можно прийти к заключению, что все
семейство цитохромов Р450 (CYP450),
отвечающих за метаболизм большинства лекарств и ксенобиотиков, регулируемое генами CYP, произошло два миллиарда лет назад от одного предшественника - гена, участвующего в утилизации энергии. CYP-гены (CYP1, CYP2, CYP3, CYP4) регулируют два конкурентных пути: метаболической детоксикации или активации. Полиморфизм генов CYP определяет различия (медленный, средний или быстрый) в метаболизме лекарств у разных индивидуумов. CYP3A4 - основной цитохром печени и кишечника, где его количество более 60% от всех цитохромов, на его долю приходится около 60% всех мета-болизируемых лекарств.
N-ацетилтрансфераза, один из ферментов второй фазы системы де-токсикации, которая осуществляет N-ацетилирование (обычно дезактивация) ароматических и O-ацетилирова-ние (обычно активация) гетероциклических аминов, к которым относятся многие канцерогены и некоторые лекарственные препараты. NAT является ферментом, которому принадлежит важная роль в метаболизме эндогенных и чужеродных соединений ариламидной природы, включая лекарственные препараты. Среди загрязнителей окружающей среды, являющихся субстратами NAT, широко распространены арила-мины выхлопных газов двигателей, лакокрасочных производств, компоненты табачного дыма, компоненты пищи и некоторые другие промышленные загрязнители. NAT участвует также в катаболизме биогенных аминов.
В НЦБМТ ФМБА России активно исследуются особенности генетического регулирования NAT-системы [2, 4, 5, 6].
Однако до последнего времени механизмы нарушения и даже особенностей NAT-ацетилирования изучены относительно слабо, что связано, в первую очередь, с отсутствием соответствующих биологических моделей. Отсутствие реальных биологических моделей серьёзно тормозит дальнейший прогресс в распознавании интимных процессов, протекающих при развитии онкологических заболеваний и других социально-значимых болезней.
Предпосылки создания
гуманизированных животных
В настоящее время большая часть исследований по испытанию влияния лекарственных средств на человека проводится на животных. Несмотря на развитие компьютерного моделирования, субклеточных и клеточных технологий, отказаться от экспериментов на многоклеточных организмах вряд ли удастся. Организм млекопитающего чрезвычайно сложен, и надежно прогнозировать ответные реакции на воздействия различных веществ без экспериментальной проверки на животных пока невозможно.
Ферменты окислительного метаболизма работают практически у всех живых организмов. Наиболее универсальной является СУР (цитохром Р450) - система, которую за ее мультигенные функции называют биологической «паяльной лампой». Важно, что пути метаболических превращений, как лекарств, так и токсикантов. носят однонаправленный характер, поэтому на путях метаболизма лекарственных средств и ксенобиотиков возможны реакции взаимодействия.
Открытие PXR (прегнан Х рецептор) как первичного регулятора индук-
ции экспрессии CYP3A, а также SXR-рецептора [62] в печени и кишечнике обнаружило, что его ненамеренная активация у людей приводит к нежелательной интеракции лекарств и увеличению уровней токсических метаболитов.
У человека идентифицированы четыре формы CYP3A (3A4, 3A5, 3A7, 3A43), у кроликов - одна, тогда как в печени мышей присутствуют множественные его формы. Преобладающей формой у человека является CYP3A4, что нельзя сказать о таковой у мышей. Поэтому создание гуманизированных мышей по гену CYP3A4 человека [48] является важной и актуальной для фармакогене-тики и фармакокинетики задачей.
Различные группы химических веществ иначе влияют на животных, чем на людей. Различия на уровне клеточного метаболизма существуют не только между животными и людьми, но и между полами и возрастными группами внутри видов. В настоящее время составление прогнозов для людей на основе данных, полученных на животных, всё больше вызывает вопросов и сомнений. Из-за межвидовых различий метаболизма существует значительная степень риска при экстраполяции результатов, полученных в экспериментах на животных, на физиолого-биохимиче-ские процессы, происходящие в организме человека.
Существуют явные видовые различия в NAT субстратной селективности и функциях у человека и разных животных [6, 22]. Даже модели дважды нокаутированных Natl/2 мышей имеют ограничения в интерпретации результатов по отношению к человеку [56]. Например, сульфаметазин (SMZ) - специфический субстрат для Nat2 человека у мышей
метаболизируется плохо [19]. У мышей 4-аминобифенол (ABP) метаболизируется исключительно Nat2 [35], тогда как у человека в N-ацетилировании ABP и O-ацетилировании N-hydroxy-ABP в печени, главным образом, участвует Nat2 и, в меньшей степени, Natl, который принято считать аналогом Nat2 мыши
[15].
В последнее время все большее значение при испытаниях фармакологической эффективности и токсичности новых лекарственных средств отводится трансгенным животным, в геноме которых интегрированы соответствующие гены человека - так называемые гуманизированные животные (рис. 1). Однако при получении гуманизированных
трансгенных животных возникает целый ряд проблем, без решения которых невозможно получение полноценных животных биомоделей.
Ключевые моменты получения
гуманизированных мышей
При получении трансгенных животных любой направленности необходимо иметь ответы на шесть ключевых вопросов:
В каких органах и тканях в норме экспрессирует собственный ген животного-хозяина, аналогом которого будет являться трансген человека?
На какой стадии развития организма начинает экспрессировать этот ген животного?
Рис. 1. Принципиальная схема получения трансгенных мышей с интегрированными генами человека.
В каких физиолого-биохимических процессах принимает участие продукт экспрессии собственного гена животного-хозяина, аналогом которого будет являться трансген человека?
В каких органах и тканях планируется вызывать экспрессию трансгена?
Как может повлиять повышенный уровень продукта экспрессии трансгена человека, попавшего в организм животного, на физиолого-биохимические процессы, происходящие в нём?
Насколько повлияет повышение уровня экспрессии трансгена на жизнеспособность гуманизированных мышей?
Приступая к работе по получению трансгенных мышей с интеграцией в их геном нуклеотидных последовательностей генов Natl и Nat2 человека, мы учитывали следующие моменты, дающие в определённой степени ответы на выше поставленные вопросы.
Исходя из современных представлений, Nat2 человека, который является типичным ферментом, метаболи-зирующим ксенобиотики и лекарства, синтезируется в клетках печени и в кишечном эпителии [23, 24, 25, 61]. Небольшой уровень экспрессии Nat2 был обнаружен у человека в молочной железе, в эпителии мочевого пузыря и предстательной железе [29, 34, 49]. Тогда как экспрессия гена Natl у человека обнаружена почти во всех тканях, включая лейкоциты и эритроциты [14, 23, 43, 47]. Было отмечено, что ген Natl начинает экспрессировать в ранний период развития человека [44]. В человеческой плаценте на ранних стадиях развития уровень экспрессии Natl в 1000 выше уровня Nat2 [53]. Позднее было показано, что этот ген
начинает экспрессировать уже в эмбрионах, находящихся на стадии бла-стоцисты, т.е. ещё до момента имплантации и нейруляции [52], что является самым неприятным моментом при получении трансгенных мышей с интегрированным геном Natl человека.
Natl имеет оригинальный субстрат-носпецифичный профиль и в дополнение к метаболизму ксенобиотиков может участвовать в ацетилировании эндогенных метаболитов таких как п-аминосалицилата [19] и п-аминобен-зойной кислоты(р-АВА) [60]. Потенциальный эндогенный субстрат был идентифицирован как фолатный катабо-лит п-аминобензоилглутамат (p-ABGlu) [39, 59], который выделяется с мочой как N-ацетильная форма [37, 38]. Фо-лат имеет протективный эффект в развитии нервной трубки у зародышей, и является чувствительным к изменению экспрессии генов Nat, ответственных за ацетилирование п-аминобензоилглута-мата у мышей.
Также было установлено, что мышиный Nat2 является гомологом человеческого Natl в отношении субстратной специфичности и тканевого распределения в организме и кодируется полиморфным локусом, который обуславливает быструю или медленную активность. Мышиный Nat2, подобно человеческому Natl, метаболизирует р-ABGlu и экспрессирует во многих тканях [18, 27, 36, 45, 54]. Во время раннего развития мышей ген Nat2 экспрессирует в эмбриональных стволовых клетках предым-плантационных эмбрионов, также как и ген Natl у человека [45]. В то время как другие гены Nat мыши и человека не экс-прессируют на этой ранней стадии развития организма [9, 52]. Было показано,
что у мышей Nat2 (гомолог человеческого Natl) экспрессирует раньше, чем на 9-й день развития плода [54]. Изучение различных тканей от неонатальных мышей методом ПЦР в реальном времени показало, что в них преимущественно экспрессирует мышиный Nat2 [40]. На 9,5; 11,5 и 13,5 дни беременности распределение мышиного Nat2 в тканях было неравномерным. Он концентрировался преимущественно в развивающейся нервной трубке, что может быть важным фактором ввиду защитного эффекта фолата в предотвращении дефектов в процессе развития нервной трубки [41]. У взрослых мышей [54] и других грызунов [28] эквивалент человеческой Natl экспрессирует в клетках Пуркинье мозжечка [54]. Исследования, проведенные на мозжечке взрослых людей, также показали аналогичную экспрессию Natl в клетках Пуркинье [26].
Сравнение мышиного Nat2 и человеческого Natl в раннем развитии правомерно позволяет использовать мышь в качестве модели для изучения экспрессии этого гена у человека.
Проблемы, лимитирующие
получение гуманизированных
мышей
Получение трансгенных животных, продуцирующих биологически активные вещества (БАВ), у которых продукты экспрессии трансгена попадают в кровь, является весьма сложным мероприятием, т.к. обладая высокой активностью, эти вещества, попадая в кровь, чаще всего вызывают изменения в регуляции физиолого-биохимических процессов, что приводит к нарушению го-меостаза и существенным отклонениям в функционировании организма.
Первое краткое сообщение о получении трансгенных мышей с интегрированным геном Nat2 человека, продуцирующим NAT2-активность в кровь, было сделано группой исследователей из Оксфордского университета в 2000 г. на II Международном симпозиуме по NAT [16]. По сообщению авторов, им удалось получить мышей в результате случайной интеграции трансгена, которых можно было скрещивать между собой. Однако уровень экспрессии человеческого Nat2 в организме трансгенных мышей оказался невысоким. После этого никаких сообщений от этой группы авторов по данной проблеме не поступало.
В последние годы существенно активизировались исследования по изучению генетической регуляции системы CYP3A4 [30, 31, 50], которые привели к созданию трансгенных и гуманизированных мышей, несущих этот ген человека. В то же время уровень экспрессии человеческого гена CYP3A4 в организме трансгенных животных также оказался достаточно низким.
Наиболее надёжным направлением является получение трансгенных животных, продуцирующих БАВ белковой природы автономно отдельными органами на экспорт (молочная железа, мочевой пузырь, предстательная железа и др.), минуя попадание их в кровь. Принципиальная возможность получения трансгенных животных, продуцирующих биологически активные вещества белковой природы автономно в отдельных органах, обусловлена механизмом тканеспецифической экспрессии трансгенов, определяемой регуляторными последовательностями генов, используемых в качестве промоторов при создании генно-инженерных конструкций.
Например, при получении трансгенных животных, продуцирующих с молоком БАВ фармакологического назначения, в качестве промоторов в генно-инженерных конструкциях используют регуляторные участки генов основных белков молока, которые обеспечивают тканеспецифическую экспрессию трансгена только в клетках молочной железы. В связи с этим, синтезированный целевой белок выводится из организма животного с молоком, не попадая в кровоток и не оказывая влияния на организм животного, т.к. молочная железа является уникальной изолированной системой, производящей продукт на экспорт [1, 13, 46]. Аналогичным образом с использованием конструкции, содержащей проба-зиновый промотор, тканеспецифичный для предстательной железы, были получены трансгенные мыши, у которых в 15 раз была увеличена активность Nat2 человека (тест с сульфаметази-ном) в предстательной железе, тогда как другие Nat2-активности (N-, O-, или N,O-ацетилтрансферазы) не были увеличены [34].
Таким образом, к настоящему времени известны следующие факты, которые мы учитывали при получении трансгенных мышей с интегрированными генами Natl и Nat2 человека:
• Nat2 у человека синтезируется, главным образом, в клетках печени и в кишечном эпителии, и небольшой уровень экспрессии Nat2 был обнаружен у человека в молочной железе, в эпителии мочевого пузыря и предстательной железе;
• экспрессия гена Natl у человека обнаружена почти во всех тканях, включая лейкоциты и эритроциты;
• ген Natl у человека начинает экспрессировать уже в эмбрионах, находящихся на стадии бластоцисты, т.е. ещё до момента имплантации и нейру-ляции, что является самым неприятным моментом при получении трансгенных животных с интегрированным геном Natl человека;
• мышиный Nat2 является гомологом человеческого Natl в отношении субстратной специфичности и тканевого распределения в организме;
• ген Nat2 у мышей экспрессиру-ет в эмбриональных стволовых клетках предымплантационных эмбрионов, также как и ген Natl у человека.
Неудачи получения трансгенных мышей с интегрированными в их геном нуклеотидными последовательностями генов человека
В 2003 г. группа исследователей из Оксфордского университета [51] также сообщила о получении трансгенных мышей методом трансплантации в бласто-цисты эмбриональных стволовых клеток, генетически трансформированных с использованием генно-инженерной конструкции, состоящей из кДНК гена Natl человека под сильным многоцелевым цитомегаловирусным промотором (cmv), которая была целенаправленно интегрирована внутрь локуса мышиного гена Nat2.
Как и следовало ожидать, все первичные трансгенные мыши в этом эксперименте были химерами, но их было очень мало, т.к. наблюдалась резорбция многих эмбрионов и ненормальное развитие большей части плодов. Из небольшого числа химерных мышей, полученных в этом эксперименте, не-
которые особи имели узловатые хвосты. Ненормальности подобного типа наблюдались у животных, которые использовались в качестве моделей для изучения дефектов развития нервной трубки у плодов [42].
Авторам не удалось скрестить немногочисленное потомство живых химерных мышей, с целью получения гомозиготных линий трансгенных мышей, обладающих повышенной экспрессией человеческого Natl и передающих трансген по наследству [51]. В связи с этим, было выдвинуто предположение, что повышенный уровень экспрессии трансгенов Nat человека приводит к продукции NAT изофермен-тов, которые метаболизируют p-ABGlu у мышей, что является вредным фактором в раннем развитии, и в результате этого происходит резорбция эмбрионов или рождение дефектных детёнышей [51]. Это предположение авторов базировалось на более ранних работах, которыми было установлено, что одним из эндогенных субстратов Natl является фолатный катаболит р-ABGlu [39, 59], а сам фолат обладает протектив-ным эффектом при развитии нервной трубки у зародышей и является чувствительным к изменению экспрессии генов Nat, ответственных за ацетилиро-вание р-ABGlu у мышей.
Результаты всех этих исследований привели авторов работы к заключению, что высокий уровень экспрессии Natl человека у трансгенных мышей в период эмбрионального развития приводит к нарушению механизма защитного действия фолата на развитие нервной трубки и гибели большей части эмбрионов или к ненормальному развитию плодов [51]. После неудачных экспериментов
по получению трансгенных мышей с интегрированными в их геном генами Nat человека эта группа исследователей прекратила работы в данном направлении.
Позднее группа исследователей из университета штата Аризона [10] на основе анализа результатов оксфордской группы [51] предприняла попытку получить трансгенных мышей с интегрированными в их геном генами Natl и Nat2 человека методом микроинъекции в пронуклеусы зигот генно-инженерных конструкций, включающих кДНК генов Nat человека под цитомегалови-русным промотором (cmv). На основании результатов своих исследований эта группа в 2005 г. опубликовала статью под названием «Только низкий уровень экзогенной N-ацетилтрансферазы может быть достигнут у трансгенных мышей» [10].
Авторами было получено 5 первичных (F0) трансгенных мышей-основателей линий с интегрированной конструкцией cmv-hNatl. Число копий трансгена варьировало от 1 до 17. Человеческая мРНК Natl была определена в печени, лёгких, почках и мозге трансгенных мышей. Наличие функционального белка было определено при измерении NAT с и-аминобензой-ной кислотой (РАВА) как селективным субстратом для Natl человека и Nat2 мыши [17, 21, 45].
Несмотря на наличие большого числа копий трансгена у некоторых линий трансгенных мышей, у них было обнаружено только умеренное увеличение уровня ферментной активности в разных тканях или вообще не отмечено никакого её увеличения. Статистически значимые различия уровня фермент-
ной активности были отмечены только в печени, при увеличении в пределах 10-50%, по сравнению с контролем [10].
С конструкцией, в которой к cmv-промотору был добавлен промотор НААТ тканеспецифический для печени, были получены две первичные (F0) трансгенные мыши-основатели линий с 5-ю и 24-мя копиями трансгена. Однако, несмотря на большое число копий трансгена, увеличение активности Nat2 в печени не произошло, по сравнению с контролем.
С конструкцией cmv-Nat2 были получены 3 первичные (F0) трансгенные мыши-основатели линий, у которых число копий трансгена варьировало от 1 до 5. В печени этих мышей было найдено умеренное количество мРНК Nat2 человека. Активность фермента в печени, измеренная с изониазидом (INH) - селективным субстратом для Nat2 человека и Natl мыши, была в 2 раза выше, по сравнению с контролем [10].
Попытки получения трансгенных мышей гомозиготных по гену Natl оказались безуспешными. Авторы сделали предположение, что это обусловлено восприимчивостью трансгенных мышей к повышенному уровню продуктов экспрессии трансгена.
В этом исследовании [10] был обнаружен интересный факт. Присутствие трансгена Natl человека вызывало в печени мышей увеличение Natl мРНК в 2-3 раза, тогда как у трансгенных мышей с интегрированным геном Nat2 человека количество эндогенной мРНК Natl незначительно изменялось в печени, лёгких, почках и мозге. В противоположность этому, у трансгенных мышей с интегрированным геном Nat2 человека синтез эндогенной мРНК Nat2 в печени
и других тканях мышей был сильно подавлен (уменьшение в 6 раз).
Авторы этого исследования также приходят к выводу о трудности достижения значительного повышения уровня экспрессии трансгена у мышей трансгенных по генам Nat. Только животные с относительно низким уровнем экспрессии трансгена выживают. Однако в этом исследовании количество живых мышей с интегрированным геном Natl человека и передающих трансген по наследству было выше, чем в исследованиях группы из Оксфордского университета [51]. Этот факт авторы [10] попытались объяснить различием линий мышей, используемых в работе этих двух групп.
На наш взгляд, различия в результатах исследований в этих группах связаны со способом получения трансгенных животных. Оксфордская группа [51] получала трансгенных животных методом введения генетически трансформированных клеток в бластоцисты, что изначально предполагает получение химерных животных, последовательное скрещивание которых в конечном итоге может привести к созданию животных, передающих трансген по наследству. Однако при таком способе получения химерных животных интеграция трансгена будет в высшей степени мозаичной, и только незначительная часть генетически трансформированных клеток может принять участие в формировании популяции гоноцитов, являющихся источниками генеративных клеток. В результате этого родившиеся живыми трансгенные животные в очень редких случаях будут передавать трансген по наследству.
Исследователи из Аризонского университета [10] получали трансгенных
животных методом микроинъекции генно-инженерных конструкций в про-нуклеусы зигот, при использовании которого мозаичность встраивания трансгена в геном хозяина значительно ниже, чем при использовании метода введения генетически трансформированных клеток в бластоцисты. Поэтому и передача трансгена потомству первичными трансгенными мышами, полученными этой группой, была выше.
Но самым неудачным моментом в исследовании аризонской группы, на наш взгляд, является использование при создании конструкций цитомегалови-русного промотора, который является мощным многоцелевым промотором, вызывающим экспрессию трансгена во многих клетках и тканях, включая бла-стомеры ранних эмбрионов. Этот промотор хорош для генетической трансформации культур клеток, которые содержат несколько сотен тысяч клеток, и поэтому гибель определённой части клеток с повышенной экспрессией трансгена не окажет существенного влияния на общие показатели эффективности трансформации клеток. Однако при введении конструкций с cmv-промотором в единичные одноклеточные зиготы в дальнейшем, чаще всего, будет приводить к гибели этих эмбрионов.
Необходим ли предварительный
нокаут генов мышей?
Группой исследователей были получены мыши с нокаутом генов Natl и Nat2, с целью изучения роли этих генов в жизнедеятельности организма [56]. Первичные исследования показали, что фенотипически эти мыши были меньше размером, но отсутствие у них экспрессии генов Natl и Nat2 не оказалось
критическим для развития и физиологического гомеостаза [56], несмотря на то, что мыши с отсутствующим геном Nat2 не экскретировали ^-ABGlu, который определяется в моче потомков мышей дикого типа [57].
Однако последующие дополнительные исследования показали, что у потомков этих мышей имеются врождённые пороки воспроизводительной системы и нарушение соотношения в половой принадлежности [57, 58]. Кроме того, по крайней мере, у потомков одного из прародителей с нокаутом гена Nat2 наблюдались дефекты со зрением. Эти дефекты, по мнению авторов, могли быть связаны с изменением метаболизма фо-лиевой кислоты [58]. Известно, что недостаток фолиевой кислоты может быть тератогенной причиной миеломенинго-целе [33] и рассечения верхней губы с рассечением или без рассечения твёрдого нёба [32].
Позднее потомки трансгенной мыши с интегрированной конструкцией, состоящей из кДНК гена Nat2 человека и энхансор/промоторной области гена альбумина мыши, были скрещены с мышами, имеющими двойной нокаут обоих генов Natl и Nat2. Целью этого скрещивания являлось исключение влияния мышиной эндогенной NAT-активности на процессы, происходящие в организме мышей под действием интегрированного чужеродного гена Nat2 человека, чтобы использовать полученных мышей в качестве модели для предсказания ответа человеком на действие ариламинов или гетероциклических аминов.
Принимая во внимание результаты исследований группы из Аризонского университета [10], которые свидетельствуют о том, что экспрессия трансгена
