CC BY
35МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ И КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ
УДК 636.2.034:591.147.6:612.664:612.146
ФИЗИОЛОГО-ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ МЕТОДОМ МИКРОИНЪЕКЦИИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ В ПРОНУКЛЕУСЫ ЗИГОТ
Рябых В.П., Трубицина Т.П., Максименко С.В., Жукова О.Б., Столярова В.Н.,
Езерский В.А., Колоскова Е.М.
ВНИИ физиологии, биохимии и питания животных, г. Боровск, Калужская обл.,
Российская Федерация
Цель сообщения - изложение основных этапов применяемой авторами модифицированной технологии получения трансгенных мышей на примере создания гуманизированных биомоделей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы человека (Nat1 и Nat2). Усовершенствован способ вызывания суперовуляции у мышей-доноров за счёт синхронизации половых циклов у самок-доноров к моменту обработки их гонадотропином СЖК, который позволяет получать к определённому времени по 17 зигот на одного донора с хорошо видимыми пронуклеусами, пригодными для введения в них генно-инженерных конструкций. Линейные фрагменты плазмидных генно-инженерных конструкций, включающих нуклеотидные последовательности генов Nat1 и Nat2 человека под промотором гена альбумина мыши (hNat1и hNat2), микроинъецировали в мужские пронуклеусы зигот, полученных от самок Fj гибридных мышей (CBA/lac*C57BL/6). При подготовке самок-реципиентов также был использован приём предварительной подсадки самок-реципиентов к вазэктомированным самцам через перегородку, который способствовал стимуляции фолликулогенеза и синхронизации половых циклов у самок-реципиентов. Это позволило получать большее количество псевдобеременных самок-реципиентов с копуляционными пробками к определённому времени, что является одним из критериев полноценности животного-реципиента и возможности успешной трансплантации ему эмбрионов, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями. На основе этих приёмов разработан вариант модифицированной технологии получения трансгенных мышей. Получены трансгенные мыши (F0) с интегрированными в их геном конструкциями, включающими нуклеотидные последовательности генов Nat1 и Nat2 человека под промотором гена альбумина мыши. Анализ интеграции трансгенов в различных органах и тканях у потомков (Fj) первичных трансгенных мышей (F0) показал, что встраивание генов Nat1 и Nat2 человека произошло во все три зародышевых листка.
Ключевые слова: генно-инженерные конструкции, N-ацетилтрансфераза человека, мыши, суперовуляция, синхронизация половых циклов, интеграция трансгенов
Проблемы биологии продуктивных животных, 2016, 2: 5-19
Введение
В течение жизни организм человека и животных подвергается воздействию многочисленных чужеродных соединений. Ферментативные системы их биотрансформации, возникшие в процессе эволюции, принимают участие в метаболизме потенциально опасных экзогенных (включая лекарства) и эндогенных соединений. Одним из ферментов системы детоксикации ксенобиотиков является N-ацетилтрансфераза (Nat), осуществляющая N-ацетилирование ароматических и O-ацетилирование гетероциклических аминов, к которым относятся многие кан-
церогены и значительная часть лекарственных препаратов. Среди загрязнителей окружающей среды, являющихся субстратами для Nat, широко распространены ариламины выхлопных газов двигателей, лакокрасочных производств, компоненты табачного дыма и пищи, а также вещества, выделяющиеся из разных пластмасс, используемых в быту.
В настоящее время большая часть исследований по предварительному испытанию действия различных веществ в организме человека (в том числе и лекарственных) проводится на животных. Во всём мире при разработке новых лекарственных средств и оценки их эффективности или токсичности для носителей разных аллелей генов биотрансформации используются чаще всего мыши, как наиболее дешёвые модельные животные. У мыши не менее 95% генов и 80% продуктов их экспрессии имеют большое сходство с таковыми человека. Геном мыши полностью расшифрован, однако известно, что некоторые группы химических веществ иначе влияют на животных, чем на человека. В настоящее время составление прогнозов для людей на основе данных, полученных на животных, всё больше вызывает вопросов и сомнений. Поскольку многие процессы клеточного метаболизма у человека и животных протекают по-разному, некоторые лекарственные препараты, которые хорошо переносятся лабораторными животными, отрицательно действуют на человека. Имеется много случаев и обратного характера, когда препараты хорошо переносимые человеком отрицательно действуют на лабораторных животных.
В этом отношении показательна история с открытием пенициллина, к которому вначале многие исследователи отнеслись скептически потому, что он убивал бактерий в чашке Петри, но не оказывал действия на инфицированных подопытных кроликов. И лишь когда А. Флем-минг на свой страх и риск ввёл пенициллин больному пациенту, выяснилось, что препарат эффективно уничтожает бактериальные инфекции в организме человека. Позднее также было установлено, что для определения эффективности действия пенициллина не подходят морские свинки и хомячки.
Ежегодно с рынка отзывают лекарственные препараты, которые были сертифицированы как безвредные по результатам испытаний на животных, но вызывали тяжелые побочные явления и даже смерть у людей. В развитых странах неблагоприятные реакции на лекарственные препараты у пациентов занимают четвертое место среди причин смерти.
В последнее время при испытаниях фармакологической эффективности и токсичности новых лекарственных средств всё большее внимание уделяется использованию трансгенных животных, в геном которых встроены соответствующие гены человека - так называемые гуманизированные животные. Такие трансгенные биомодели в перспективе будут иметь характеристики ферментных систем, в большей степени сравнимые с таковыми в клетках человека, поэтому они могут дать более точный прогноз ответа организма человека на тот или иной ксенобиотик. Однако при получении гуманизированных трансгенных мышей возникает целый ряд проблем, без решения которых невозможно получение полноценных животных-биомоделей (Рябых, 2015).
Основным способом введения чужеродных генов в геном животных в настоящее время является метод микроинъекции генно-инженерных конструкций в пронуклеусы зигот. В связи с этим технология получения трансгенных животных, основанная на микроинъекционном методе, включает в себя этапы двух видов: генно-инженерные и физиолого-эмбриологические.
К генно-инженерным этапам относятся:
- получение нуклеотидных последовательностей структурного гена, кодирующего тот или иной признак;
- получение нуклеотидных последовательностей регуляторных участков гена (промоторов, энхансеров, и др.);
- создание генно-инженерных конструкций;
- анализ интеграции трансгена у эмбрионов и животных, полученных из зигот, микро-инъецированных генно-инженерными конструкциями.
Физиолого-эмбриологические этапы включают в себя:
- вызывание высоко синхронизированной суперовуляции у животных-доноров с целью получения к определённому сроку большого числа эмбрионов на стадии зиготы;
- хирургическое получение зигот из яйцеводов;
- визуализация пронуклеусов в зиготах;
- микроинъекция генно-инженерных конструкций в пронуклеусы зигот;
- кратковременное культивирование микроинъецированных эмбрионов in vitro;
- подготовка самок-реципиентов с половым циклом, синхронным стадии полового цикла самок-доноров;
-трансплантация инъецированных эмбрионов синхронизированным самкам-реципиентам.
Цель данного сообщения — изложение основных этапов применяемой авторами модифицированной технологии получения трансгенных мышей на примере создания гуманизированных биомоделей с интегрированными генами .N-ацетилтрансферазы человека.
Материал и методы
Получение мышиных зигот. Эксперименты были проведены на самках гибридных мышей линии СВАxС57ВL (Fi) в возрасте 4-7 недель, полученных из питомника «Столбовая» (Чеховский р-н Московской обл.). Животные содержались при следующем световом режиме:
о00 тп00 " тп00 о 00 тт
световой период с 8 до 20 и темновой —с 20 до 8 ч. Для вызывания суперовуляции и синхронизации спаривания был использован метод гормональной стимуляции. Самкам мышей вводили по 7-8 ИЕ гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК), а через 48-56 часов внутрибрюшинно 5-7 ИЕ хорионического гонадотропина человека (ХГч). После введения ХГч самок подсаживали к плодовитым самцам на ночь из расчета 1:1. Оплодотворение определяли по наличию копуляционной пробки. День обнаружения копуляционной пробки считали первым днем беременности.
Извлечение эмбрионов и манипуляции, связанные с микроинъекцией в них генно-инженерных конструкций, проводили в среде М2, содержащей HEPES-буфер. Культивирование эмбрионов проводили в среде М16 под газовой фазой, содержащей 5% СО2 в воздухе, при температуре 37°С. Среды М2 и М16 обогащали бычьим сывороточным альбумином (БСА).
Микроинъекцию генно-инженерных конструкций в зиготы проводили на установке, включающей инвертированный микроскоп с оптикой Номарского (Nikon, Япония) и комплект манипуляторов и микроинъекторов (Narishiga, Япония).
Линейные фрагменты плазмидной генно-инженерной конструкции размером от 5 до 7 тыс. пар нуклеотидов инъецировали в мужской пронуклеус зигот через микроиглу с внешним диаметром 1,5-2 мкм, в объеме 1-2 пкл, с концентрацией 7-8 мкг/мл.
Трансплантация микроинъецированных эмбрионов псевдобеременным самкам, полученным в результате гормональной обработки и спаривания с вазэктомированными самцами, была проведена через 1 -2 ч после микроинъекции или после культивирования в течение 24 ч.
Зиготы, не разрушившиеся в течение 1 ч после микроинъекции генно-инженерной конструкции, были поставлены на культивирование на 16-22 ч до следующего утра. Эмбрионы, которые за время культивирования достигали стадии двух бластомеров, трансплантировали синхронизированным самкам-реципиентам по 8-12 в один яйцевод с помощью стеклянной микропипетки. Часть микроинъецированных зигот была поставлена на культивирование до стадии бластоцисты.
На начальном этапе исследований получения трансгенных мышей проводили по классической схеме (Мерфи, Хенсон, 1989; Аллен и др., 1990) (табл. 1).
Таблица 1. Классическая схема технологии получения трансгенных мышей
(Мерфи и др., 1989; Аллен и др., 1990)
Дни Этапы
Время
Доноры Реципиенты
ТО"
Введение ГСЖК (7-8 И.Е.) 15-16'
I Введение ХГч (5-7 И.Е.). 16-17°
II Подсадка самок-доноров к самцу. 16-17'
III Подсадка самок-реципиентов к вазэктомированным самцам. -
I Получение зигот. 11-13'
II Микроинъекция зигот генно-инженерной конструкцией и крат- 14-16' косрочное культивирование.
III Трансплантация зигот самкам-реципиентам_-
-00
16-17"'
16-18°'
4
ПЦР-анализ интеграции трансгенов в геном животных. Анализ интеграции трансгена у потомства мышей, полученного из зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией, проводили с использованием ПЦР-амплификации. Выделение геномной ДНК из тканей проводили по методу (Blin, Stafford, 1976) с некоторыми модификациями. ДНК из лизата выделяли гуанидиновым методом — сорбцией на стекле в концентрированном солевом растворе с последующими несколькими промывками Трис-спиртовым (80%) буфером, испарением спирта и растворением ДНК, сорбированной на стекле, в ТЕ-буфере.
В процессе анализа интеграции генно-инженерной конструкции в геном мыши использовали метод ПЦР с применением следующих пар праймеров:
Для конструкции Alb-Natl использовали пару prAl-F (прямой) и Natl-Not (обратный); для Alb-Nat2 использовали пару prAl-F (прямой) и Nat2-Not (обратный).
В обоих случаях величина амплификата составляла 1504 пар нуклеотидов.
Нуклеотидные последовательности используемых праймеров: prAl-F: GAC CCA TGG GGC ATG CTT CCA TGC CAA G - 5'-концевой на промотор (28 п.н.); Nat1-Not : GAA GCG GCC GCC TAA ATA GTA AAA AAT CTA TCA CCA 3'-концевой на Nat1 (36 п.н.);
Nat2-Not: GAA GCG GCC GCC TAA ATA GTA AGG GAA CCA TCA C - 3'-концевой на Nat2 (34 п.н.).
Электрофорез проводили в 0,8% агарозном геле в 0,5*ТВЕ. В каждую лунку вносили по 18-20 мкл ПЦР-смеси (окрашенная водная фаза) для ДНК из образцов тканей мышей или 6-10 мкл положительного контроля. Для оценки размера амплификата одну из дорожек агарозного геля выделяли для ДНК-маркера (100-10000 п.н., Fermentas).
Результаты и обсуждение
Вызывание суперовуляции у мышей-доноров по классической схеме
При получении трансгенных мышей путём введения генно-инженерных конструкций в пронуклеусы зигот необходимо к определённому времени иметь достаточное количество зигот с хорошо видимыми пронуклеусами. С целью получения большого количества зигот от самок-доноров, у них вызывают суперовуляцию с помощью различных гонадотропных препаратов сыворотки жерёбых кобыл (ГСЖК). На начальном этапе исследований нами для вызывания суперовуляции у самок-доноров двух групп были испытаны два препарата ГСЖК:
I гр. - Фоллигон (1^егуе^ Голландия); II гр. - Фоллимаг (Мосагроген, Россия).
Гормональную обработку самок-доноров на этом этапе исследования проводили по классической схеме, представленной в разделе «Материал и методы». В соответствии с этой схемой, самок-доноров подсаживают в клетку к самцу через 46-48 ч после введения им ГСЖК и
одновременно с введением хорионического гормона человека (ХГч), который должен вызывать овуляцию фолликулов, развившихся под действием ГСЖК.
При использовании этой схемы вызывания суперовуляции (табл. 2) количество яйцеклеток с видимыми пронуклеусами, извлечённых через 19-20 ч после подсадки самок к самцу, было очень низким (27-31%), тогда как принято считать, что этого времени достаточно для того, чтобы произошла овуляция фолликулов, осеменение самок и развитие оплодотворённых яйцеклеток до стадии двух пронуклеусов. Из яйцеклеток, извлечённых без видимых пронукле-усов, после дополнительного культивирования в течение 6-7 ч только у 9-14% появились про-нуклеусы.
Таблица 2. Результаты вызывания суперовуляции у мышей-доноров по классической схеме
Количе- Количество извлечённых яйцеклеток Количество зигот с про-
№ ство са- нуклеусами
гР- мок- с видимыми без видимых с пронуклеусами по- всего на одного
д°н°р°в пронуклеу- пронуклеусов сле культивирования донора
сами_
п % п % п % п %
I 51 241 31,1 533 68,9 48 9,0 289 37,3 5,6
I I_33_134 26,6 370 73,4 51_14,0_185 36,7 5,6
Таким образом, количество яйцеклеток с пронуклеусами в общей сложности составило только 37% от общего количества полученных яйцеклеток. На одну самку-донора было получено только по 5,6 зигот с видимыми пронуклеусами, т.е. пригодных для микроинъекции в них генно-инженерной конструкции. При этом при использовании фоллигона и фоллимага были получены одинаковые результаты.
Результаты вызывания суперовуляции у мышей-доноров с синхронизацией половых циклов (модифицированная схема)
Одной из основных причин низкого выхода яйцеклеток с видимыми пронуклеусами к определённому времени, на наш взгляд, является разное состояние яичников у самок-доноров в момент введения им препарата ГСЖК. Если принять во внимание тот факт, что продолжительность полового цикла у самок мышей составляет 4-5 дней, то ежедневно в фолликулярной фазе цикла, т.е. наиболее подходящей для вызывания суперовуляции, будет находиться одна из 4-5 самок, взятых произвольно для вызывания суперовуляции. С учётом этого мы предположили, что для эффективного вызывания суперовуляции у мышей-доноров необходимо синхронизировать половой цикл у группы самок, взятых для вызывания суперовуляции, таким образом, чтобы на момент введения им гонадотропного препарата ГСЖК яичники у них должны находиться в фолликулярной фазе полового цикла. Ранее при обычном размножении мышей было замечено, что если самок на несколько часов подсаживать к самцу в клетку, разделённую перегородкой, то после снятие перегородки и покрытия самцом потомство у них рождается с разницей в несколько часов или в течение 1-2 дней, т.е. более уплотнённо.
Принимая это во внимание, мы решили применить принцип предварительной подсадки самок к самцу через перегородку при вызывании суперовуляции у мышей-доноров. Были испытаны два варианта подсадки самок к самцу: а) одновременно с началом гормональной обработки, т.е. с введением ГСЖК (II гр.); б) за 24 ч до начала гормональной обработки ГСЖК (III гр.). Контролем служили самки, взятые для вызывания суперовуляции произвольно, т.е. без учёта полового цикла и без предварительной подсадки к самцам (I гр.).
Результаты этого эксперимента показали (табл. 3), что предварительная подсадка самок к самцу через перегородку оказывает положительное влияние на степень синхронизации половых циклов у самок-доноров. В результате этого большая часть самок-доноров к моменту вве-
дения им препарата ГСЖК находилась в фолликулярной фазе полового цикла. Это привело к увеличению количества яйцеклеток с видимыми пронуклеусами у самок-доноров через 19-20 ч после введения ХГч (53,2 и 61,9% во II и III группах соответственно, против 31,2% в I (контрольной) группе.
Таблица 3. Результаты вызывания суперовуляции по модифицированной схеме
Количество извлечённых яйцеклеток: Количество зигот с про-
№ Количе- нуклеусами:
гр. ство с видимыми без видимых с пронуклеу всего на
самок- пронуклеусами пронуклеу сами после куль- одного
доноров сов тивирования донора
п % п % п % п % п
I 51 241 31,2 533 68,8 48 8,7 289 37,3 5,6
II 265 2430 53,2 2138 46,8 979 45,8 3409 74,6 12,8
III 100 1192 61,9 733 38,1 582 80,0 1774 92,2 17,7
Ещё более отчётливо это положительное влияние проявилось на яйцеклетках, в которых через 19-20 ч после введения ХГч не было обнаружено видимых пронуклеусов. При последующем культивировании этих яйцеклеток в течение 6 ч в них появились пронуклеусы (у 45,8% во II группе, у 80,0% - в III группе, против 8,7% в контрольной группе). Таким образом, общее количество яйцеклеток с видимыми пронуклеусами, полученных на одну самку-донора, составило 12,8 во II группе, 17,7 в III группе и 5,6 в I (контрольной) (74,6 и 92,2% соответственно против 37,3% в контроле) от общего количества извлечённых яйцеклеток. При этом лучшие результаты вызывания суперовуляции у самок-доноров были получены в варианте с предварительной подсадкой самок к самцу через перегородку за 24 ч до ведения препарата ГСЖК. В этом варианте введение ХГч производится через 72 ч после подсадки самок-доноров к самцу через перегородку. Можно предположить, что за это время происходит синхронизация половых циклов у большинства самок, и яичники к моменту введения ГСЖК у них находились в фолликулярной фазе полового цикла, которая наиболее благоприятна для вызывания суперовуляции.
Испытание разных вариантов подготовки мышей-реципиентов
Одним из важнейших этапов технологии получения трансгенных мышей является подготовка самок-реципиентов. Приживляемость трансплантированных эмбрионов зависит от синхронности половых циклов самок-доноров и самок-реципиентов и от количества фолликулов, овулировавших в яичниках самок-реципиентов. Если фолликулов овулирует очень мало, то количество развившихся из них жёлтых тел может оказаться недостаточным для поддержания беременности и развития трансплантированных эмбрионов. Кроме того, при малом числе фолликулов в яичниках охота у самок может проявляться слабо, и самцы могут не реагировать на этих самок. В результате этого мы наблюдаем самок без копуляционных пробок, хотя овуляция небольшого числа фолликулов у них произошла, о чём свидетельствует наличие яйцеклеток и кровяных сгустков в яйцеводах. В качестве животных-реципиентов обычно используют псевдобеременных самок с половым циклом, синхронным половому циклу животных-доноров. Псевдобеременность индуцируется путём спаривания самок, находящихся в фолликулярной стадии естественного цикла, с вазэктомированным самцом. Если спаривание прошло нормально, то у самок во влагалище образуется копуляционная пробка, по наличию которой их и отбирают самок для использования в качестве реципиентов.
Для индукции псевдобеременности нами были испытаны разные варианты подготовки животных с целью получения самок-реципиентов. Эта серия экспериментов показала (табл. 4),
что большее число самок с копуляционными пробками наблюдалось в группах с предварительной подсадкой самок к вазэктомированным самцам через перегородку (II и III гр.).
Таблица 4. Эффективность разных вариантов подготовки мышей-реципиентов
Коли- Количество самок-реципиенов с овуляцией
№ чество Время предварительной подсадки самцов (от всего с копуляцион- без копуляцион-
гр. самок момента обработки самок-доноров ГСЖК) ными пробками ных пробок
n % n % n %
I 83 Без предварительной подсадки 32 40,0 9 28,0 23 72,0
II 334 Через 24 часа после обработки доноров ГСЖК 182 54,5 92 50,6 90 49,4
III 136 Одновременно с обработкой доноров ГСЖК 93 68,4 57 61,3 36 38,7
При этом самый хороший результат отмечен у самок III группы, которых предварительно подсаживали к вазэктомированным самцам через перегородку в тот же день, когда самкам-донорам вводили ГСЖК, и они находились с самцами в течение 72 ч (68,4% с признаками овуляции и 61,3% из них с копуляционными пробками).
Несколько более низкий результат наблюдали у самок II группы, которые находились с самцами через перегородку в течение 48 ч (54,5% с признаками овуляции и 50,6% из них с ко-пуляционными пробками), тогда как среди самок-реципиентов, которых предварительно не подсаживали к самцам, только у 40,0% произошла овуляция и 9,0% были с копуляционными пробками.
Таким образом, результаты этой серии экспериментов показали, что предварительная подсадка самок-реципиентов в клетку к вазэктомированным самцам через перегородку способствует синхронизации половых циклов у этих самок и успешному покрытию их самцами с образованием копуляционных пробок, что является одним из критериев полноценности животного-реципиента и возможности успешной трансплантации ему эмбрионов, микроинъецирован-ных генно-инженерными конструкциями.
Развитие in vitro мышиных зигот, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями
При получении трансгенных мышей существуют две стратегии трансплантации эмбрионов, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями:
а) трансплантировать зиготы самкам-реципиентам через 1 -2 ч после микроинъекции в пронуклеусы генной конструкции (на одноклеточной стадии);
б) культивировать микроинъецированные зиготы в течение ночи и трансплантировать на другой день эмбрионы, достигшие стадии двух бластомеров.
Нами был выбран второй вариант стратегии трансплантации. Мы культивировали мик-роинъецированные зиготы в течение ночи до стадии двух бластомеров, а затем трансплантировали в яйцевод самкам-реципиентам. На наш взгляд, этот вариант имеет определённые преимущества, т.к. позволяет отбраковать эмбрионы, не вступившие в деление дробления, т.е. оставшиеся на одноклеточной стадии, и кроме того, это значительно снижает нагрузку на оператора микроинъекции и трансплантации, т.к. выполнение этих двух процессов в один день неблагоприятно влияет на качество работ.
Результаты культивирования зигот после микроинъекции генно-инженерными конструкциями hNatl и hNat2 (табл. 5) показали, что около 18-19% зигот, инъецированных этими конструкциями, останавливаются в развитии на одноклеточной стадии. При этом на данном этапе технологии не наблюдалось разницы в жизнеспособности зигот, инъецированных конструкциями hNatl и hNat2.
Таблица 5. Развитие in vitro мышиных зигот, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями
№ Конструкция Количество зигот, инъекци- Развилось до стадии 2-х бластомеров гр. рованных конструкцией п %
I hNat1 1824 1488 81,6
I I_hNat2_3714_2987_80,5
Примечание: длительность культивирования - 12-22 ч.
Приживляемость 2-клеточных мышиных эмбрионов, инъецированных генно-инженерными конструкциями Natl и Nat2 человека, в организме самок-реципиентов
После культивирования зигот, инъецированных конструкциями hNat1 и hNat2 в течение 12-22 ч, эмбрионы, достигшие 2-клеточной стадии, были трансплантированы по 8-12 в один из яйцеводов самок-реципиентов. Результаты этой серии экспериментов (табл. 6) показали, что приживляемость, в пересчёте как на беременных, так и на всех реципиентов, была выше у эмбрионов, развившихся из зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией hNat2 (62,6 и 24,2%, соответственно), по сравнению с приживляемостью эмбрионов, развившихся из зигот, микроинъецированных конструкцией hNat1 (42,3 и 15,2% соответственно).
Таблица 6. Приживляемость 2-клеточных мышиных эмбрионов, инъецированных генно-инженерными конструкциями Natl и Nat2 человека, в организме самок-реципиентов
Число Беременных Родилось Приживляемость эмбрионов
№ Конст- реци- Трансплан- реципиентов потомков (%)
гр. рукция пиен- тировано п % на беремен- на всех
тов эмбрионов ных реципиентов
I hNat 1 43 434 15 35,0 66 42,3 15,2
II hNat 2 47 488 19 40,4 118 62,6 24,2
В результате проведенных исследований улучшены основные этапы технологии получения трансгенных мышей: а) вызывание суперовуляции у мышей-доноров; б) подготовка псевдобеременных самок-реципиентов. Синхронизация половых циклов самок-доноров позволяет получать большее количество зигот на стадии хорошо видимых пронуклеусов, а синхронизация половых циклов самок-реципиентов - большее количество псевдобеременных самок с копуляционными пробками. Вариант модифицированной нами технологии получения трансгенных мышей представлен в табл. 7.
Таблица 7. Этапы получения трансгенных мышей по модифицированной схеме
Время
Дни Этапы Доноры Реципиенты
1 Подсадка самок-доноров к самцам через перегородку 15-1600
2 I Введение самкам-донорам ГСЖК (7-8 ИЕ). 15-1600 -
II Подсадка самок-реципиентов к вазэктомированным самцам через - 15-1600
перегородку
3 - - -
4 I Введение самкам-донорам ХГч (5-7 ИЕ) 16-1700 -_II Подсадка к самцам (снятие перегородки)_16-1700_-_
Продолжение таблицы 7
Время
Дни Этапы Доноры Реципиенты
5 I Получение оплодотворённых яйцеклеток II Микроинъекция зигот конструкцией и постановка на культиви- 11-1300 14-1600 -
рование 13-1900
III Культивирование яйцеклеток без пронуклеусов до стадии зиго- -
ты (до появления пронуклеусов) 19-2100
IV Микроинъекция этих развившихся зигот и постановка на -
культивирование 16-1700
V Подсадка самок-реципиентов к вазэктомированным самцам
(снятие перегородки) 9-1000 10 -1300
6 I Отбор реципиентов с копуляционными пробками II Трансплантация 2-клеточных эмбрионов самкам-реципиентам -
ПЦР-анализ интеграции трансгенов в органах и тканях потомков трансгенных мышей показал, что встраивание трансгенов у потомков (Б^ первичных трансгенных мышей (Б0) произошло во все исследуемые органы (рис. 1-3), и, следовательно, интеграция трансгенов у первичных животных (Р0) произошла во все три зародышевых листка.
3000 пн
1500 пн
1000 пн
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
+
3000 пн
--1500 пн
1000 пн
Рис. 1. Электрофореграммы продуктов ПЦР-амплификации ДНК, выделенной из хвостов мышей (F0), полученных в результате микроинъекции конструкций Alb-Nat2 (А) и Alb-Natl(E). Алтлификатыразмером 1500 п.н. ограничены праймерами prAl-F- Nat2 и prAl-F- Natl. 0,8% агарозный гель с 0,5*ТБЕ. А. 16 - образцы №1-6, Б. 1-13 - образцы № 7-19, 7(A), 14(Б) - вода (отрицательный контроль), 8(A), 15(Б) - маркер размеров ДНК. 9(A), 16(Б) - положительный контроль (К+, конструкция Alb-Nat2(l), 0,001пг/мкл) . 10(A) — контроль ингибирования (К+ и образец ДНК кролика). Мыши №2 и №17 (дор. 2А и 11Б) трансгенные.
Рис. 2. Электрофореграммы продуктов ПЦР-амплификации ДНК, выделенной из хвостов мышей - потомков (Ж]) трансгенных основа-телей линий с генами человека: Nat1 (А) и Nat2(Б). Амплификаты раз-мером 1500 п.н. ограничены прай-ерами ргА1-Б- та и рШ-Б- Nat3. 0,8% агарозный гель с 0,5*ТБЕ. А. 1-12 -образцы № 1-12, Б. 1-14 - образцы № 13-25, (А) - вода (отри-цательный контроль), 14(А),15(Б) - маркер размеров ДНК. 15(А), 16(Б) — положительный контроль (К+, мышь №17(А), мышь №49(Б) - Б0). Мыши №.2 и №17 (дор. 2А и 11Б) трансгенные. Дорожки А 1-3; 5; 7; 10-12 и Б 6, 10 - трансгенные.
Рис.3. Электрофореграммы продуктов ПЦР-амплификации ДНК, выделенной из органов и тканей мышей, трансгенных по N-ацетилтрансферазе 1 (Natl,) и N-ацетилтрансферазе 2 (Nat2) человека (фото А и Б соответственно). Амплификаты ограничены праймерами Alb-Nat 1(2) (содержат фрагменты последовательности промотора гена альбумина мыши и гена N-ацетилтрансферазы человека, общий размер амплификата 1500 п.н.). 0,8% агарозный гель с 0,5*ТБЕ.
1, 2 - левый и правый яичники,
3 - матка,
4 - мышцы,
5 - кишечник,
6 - почка,
7 - печень,
8 - селезенка,
9 - желудок,
10 - К- (нетрансгенная мышь, хвост),
11 - сердце,
12 - тимус,
13 - Н2О,
14 - маркер размеров ДНК,
15 - К+ (хвост трансгенной по ЫАТ1(2) мыши, ранее тестированной как содержащей транс-ген);
16 - Кинг (К+ и один из образцов 1-9)
Эффективность получения гуманизированных трансгенных мышей с интегрированными конструкциями НЫаИ и НЫаИ человека
Анализ интеграции трансгена в геном рождённого потомства методом ПЦР (табл. 8) показал, что из 66 мышат, полученных из зигот, микроинъецированных конструкцией НЫМ^ у пяти была обнаружена интеграция трансгена, что составило 7,6% от числа рождённых животных, тогда как из зигот, микроинъецированных конструкцией НЫм2, из 118 рождённых мышат интеграция трансгена была обнаружена только у трёх потомков, что составило 2,5% от числа рождённых животных. Причина сравнительно низкого выхода трансгенных мышей с интегрированной конструкцией ИЫм2 требует дальнейшего выяснения.
Таблица 8. Эффективность получения гуманизированных трансгенных мышей с интегрированными конструкциями к^аИ и hNat2 человека
№ Конструкция Число Родилось потомков: Общая
гр. эмбрионов всего: из них трансгенных: эффективность
трансплантиро- п п % от числа трансгеноза
вано рождённых (%)
I h Nat1 434 66 5 7,6 1,1
II h Nat2 488 118 3 2,5 0,6
Общая эффективность технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами НЫАТ1 и НЫАТ2, т.е. отношение количества полученных трансгенных животных к числу трансплантированных эмбрионов, микроинъецированных генной конструкцией, составила 1,1 и 0,6%.
В связи с тем, что при вызывании суперовуляции у самок-доноров по классической схеме, получение к определённому часу достаточного количества мышиных зигот не всегда бывает удачным, то ведётся поиск новых схем вызывания суперовуляции. Для того, чтобы получить к определённому сроку достаточное количество мышиных зигот, пригодных для микроинъекции в них генно-инженерных конструкций (ГИК), некоторые группы исследователей пошли по пути искусственного оплодотворения ооцитов in vitro (Sakurai et al., 2005, 2014), что является достаточно сложной и громоздкой процедурой, связанной с дополнительными этапами технологии - получением семени от самцов, её капацитацией и оплодотворением ооцитов in vitro. Кроме того считается, что зиготы, полученные в результате оплодотворения яйцеклеток in vitro, чаще всего имеют более низкое качество, по сравнению с эмбрионами, полученными в результате оплодотворения яйцеклеток in vivo. Однако несмотря на это, исследователи вынужены идти на дополнительные усложнения технологии, чтобы получить к определённому сроку достаточное количество зигот, пригодных для микроинъекции генно-инженерных конструкций.
Предложенный нами способ вызывания суперовуляции, включающий синхронизацию половых циклов у самок-доноров путём предварительной подсадки их к самцам через перегородку, позволяет получать на одного донора в среднем по 17,7 зигот с хорошо видимыми про-нуклеусами, что составляет 92,2% от общего количества извлечённых яйцеклеток. При этом у 61,9% зигот пронуклеусы были видны сразу после извлечения из яйцевода, которое производилось через 19-20 ч после введения ХГч, и у 30,3% зигот пронуклеусы появлялись после культивирования извлечённых яйцеклеток в течение последующих 6 ч.
При этом лучшие результаты вызывания суперовуляции у самок-доноров были получены в варианте с предварительной подсадкой самок к самцу через перегородку за 24 ч до ведения им препарата ГСЖК. Можно предположить, что за это время происходит синхронизация половых циклов у большей части самок, и к моменту введения им ГСЖК яичники у них находятся в фолликулярной фазе полового цикла. В этом варианте гормональной обработки введение ХГч производится через 72 ч после подсадки самок-доноров к самцу через перегородку. Предложенная нами схема вызывания суперовуляции у мышей - доноров зигот, не вносит никаких дополнительных этапов, усложняющих эту технологию, кроме установки временной перегородки в клетках у самцов.
При подготовке самок-реципиентов нами также был использован приём предварительной подсадки самок к самцам через перегородку, который позволяет стимулировать процесс фолликулогенеза и синхронизировать половые циклы самок-реципиентов. В результате этого у самок-реципиентов в яичниках развивается большее число фолликулов, поэтому охота у них проявляется более выражено, и вазэктомированные самцы покрывают их с образованием чётко видимых копуляционных пробок, что является показателем хорошего состояния самки-реципиента и возможности успешной трансплантации эмбрионов, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями.
Первое полноценное сообщение о получении трансгенных мышей методом трансплантации в бластоцисты эмбриональных стволовых клеток, генетически трансформированных с использованием генно-инженерной конструкции, состоящей из кДНК гена Natl человека под цитомегаловирусным промотором (cmv) было сделано в 2003 г группой исследователей из Оксфордского университета (Sim et al., 2003). Как и следовало ожидать, все рождённые первичные трансгенные мыши в этом эксперименте оказались химерами, но их было очень мало, т.к. наблюдалась резорбция многих эмбрионов и ненормальное развитие большей части плодов. Авторам не удалось скрестить немногочисленное потомство живых химерных мышей с целью получения гомозиготных линий трансгенных мышей, обладающих повышенной экспрессией человеческого Natl и способностью передавать трансген по наследству (Sim et al., 2003). Результаты этого исследования привели авторов работы к заключению, что высокий уровень экспрессии Natl человека у трансгенных мышей в период эмбрионального развития
приводит к нарушению механизма защитного действия фолата на развитие нервной трубки и гибели большей части эмбрионов или к ненормальному развитию плодов (Sim et al., 2003). После неудачных экспериментов по получению трансгенных мышей с интегрированными генами Nat человека эта группа исследователей прекратила работы в данном направлении.
Позднее группа исследователей из университета штата Аризона (Cao et al., 2005) на основе анализа результатов оксфордской группы (Sim et al., 2003) предприняла попытку получить трансгенных мышей с интегрированными генами Natl и Nat2 человека методом микроинъекции в пронуклеусы зигот генно-инженерных конструкций, включающих кДНК генов Nat человека под cmv-промотором. Авторами было получено пять первичных (F0) трансгенных мышей с интегрированной конструкцией cmv-hNatl. С конструкцией cmv-Nat2 были получены три первичные (F0) трансгенные мыши, у которых число копий трансгена варьировало от 1 до 5. Попытки получения трансгенных мышей, гомозиготных по гену Natl, оказались безуспешными. Авторы этого исследования также пришли к выводу о трудности достижения значительного повышения уровня экспрессии трансгена у мышей, трансгенных по генам Nat. Выживали только животные с относительно низким уровнем экспрессии трансгена (Cao et al., 2005).
Самым неудачным моментом в исследовании аризонской группы, на наш взгляд, является использование при создании конструкций цитомегаловирусного промотора, который является мощным многоцелевым промотором, вызывающим экспрессию трансгена во многих клетках и тканях, включая бластомеры ранних эмбрионов.
Наши исследования, проведенные с использованием генно-инженерной конструкции, включающей репортёрный ген зелёного белка под cmv-промотором, показали, что cmv-промотор включал экспрессию гена зелёного белка уже на стадии двух бластомеров, а в эмбрионах, погибших на ранних стадиях развития, наблюдалась сильная экспрессия гена зелёного белка (Езерский и др., 2013). Эти исследования наводят на мысль, что чрезмерная экспрессия гена зелёного белка, обусловленная действием cmv-промотора, приводит к резкому смещению синтетических процессов в сторону синтеза чужеродного зелёного белка, что приводит к гибели эмбриона. По-видимому, при использовании для получения трансгенных животных конструкций, включающих ген Natl человека под мощным cmv-промотором, на ранних стадиях развития эмбриона начинают действовать сразу два процесса, неблагоприятных для развития эмбриона. Во-первых, при высоком уровне экспрессии трансгена происходит усиленное использование аминокислот на синтез чужеродного белка под действием cmv-промотора, что само по себе может приводить к гибели эмбрионов. Во-вторых, повышенный синтез фермента Natl человека, который вызывает снижение уровня фолиевой кислоты, может приводить к нарушениям формирования нервной трубки и ненормальному развитию плодов.
После этих неудачных попыток получения полноценных трансгенных мышей, экспрес-сирующих высокий уровень Nat1 и Nat2 человека и передающих трансген по наследству, в 2011 г группа канадских исследователей из университета г. Торонто опубликовала статью, в которой сообщалось о получении одной первичной (F0) трансгенной мыши - основательницы линии с интегрированным геном Nat2 человека (Sugamori et al., 2011). Эта мышь была получена методом микроинъекции в пронуклеус зиготы конструкции, состоящей из кДНК гена Nat2 человека и энхансер/промоторной области гена альбумина мыши, которая была использована с целью вызывания экспрессии трансгена целенаправленно в печени. В геном этой мыши встроилась только одна копия трансгена. О частоте интеграции трансгена в геном хозяина и общей эффективности технологии трансгеноза авторы этой работы не сообщают, поэтому сложно судить о влиянии экспрессии трансгена на развитие эмбрионов, эмбриональную смертность, жизнеспособность рождённого потомства и о нарушении постнатального развития. Эта мышь послужила основателем трансгенной линии, которая была получена в результате скрещивания на протяжении 10 генераций.
Учитывая результаты наших исследований об отрицательном влиянии слишком ранней экспрессии генно-инженерных конструкций под cmv-промотором на жизнеспособность пре-
дымплантационных эмбрионов млекопитающих (Езерский и др., 2013), нами при создании конструкций с нуклеотидными последовательностями генов Natl и Nat2 человека в качестве про-моторно/энхансорной области была выбрана регуляторная область гена альбумина мыши. Этот выбор обусловлен тем, что ген альбумина в предымплантационных эмбрионах ещё не активен и, по всей вероятности, альбуминовый промотер не должен запускать экспрессию чужеродных генов Natl и Nat2 и оказывать отрицательного влияния на их жизнеспособность.
Результаты наших исследований по приживляемости в организме самок-реципиентов двух-клеточных мышиных эмбрионов, инъецированных генно-инженерными конструкциями Nat1 и Nat2 человека, которые свидетельствуют о достаточно высоком проценте приживляе-мости этих эмбрионов, в пересчёте как на всех реципиентов, так и на беременных, подтверждают это предположение.
Анализ интеграции трансгенов в органах и тканях потомков мышей, трансгенных как по гену Natl, так и по Nat2, показал, что встраивание трансгенов у первичных трансгенных мышей (F0) произошло во все три зародышевых листка - эктодерму, энтодерму и мезодерму. Особенно важно, что встраивание трансгенов у самок произошло в оба яичника, что может ускорить этапы размножения и создания линии трансгенных животных.
В нашей работе, так же, как и у исследователей из Аризонского университета (Cao et al., 2005), было получено 5 первичных (F0) трансгенных мышей с интегрированной конструкцией hNatl и 3 - с hNat2. Однако в указанной статье авторы не приводят данные о частоте интеграции трансгена в геном хозяина и об общей эффективности технологии трансгеноза. Поэтому сложно судить о влиянии экспрессии трансгена на развитие эмбрионов, эмбриональную смертность, жизнеспособность рождённого потомства и риск нарушения постнатального развития.
В проведенных нами исследованиях общая эффективность технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами hNATl и hNAT2, т.е. отношение количества полученных трансгенных животных к числу трансплантированных эмбрионов, микроинъеци-рованных генной конструкцией, составила 1,1 и 0,6% соответственно.
Исходя из имеющихся данных об экспрессии генов hNATl и hNAT2 в организме человека, следовало ожидать обратного эффекта, т.е. меньшего количества потомков с интегрированным геном hNATl, по сравнению с интегрированным геном hNAT2, так как ген Natl у человека начинает экспрессировать уже в эмбрионах, находящихся на стадии бластоцисты, т.е. ещё до момента имплантации и нейруляции, что является самым неприятным моментом при получении трансгенных животных с интегрированным геном Natl человека. Ген Nat2 у человека экспрессирует, главным образом, в клетках печени и в кишечном эпителии, т.е. этот ген, начинает экспрессировать в более поздние сроки, и сам по себе этот факт не должен вызывать эмбриональную смертность и оказывать существенного отрицательного влияния на развитие плода. Поэтому причина относительно более низкого выхода трансгенных мышей с интегрированной конструкцией hNat2 требует своего дальнейшего выяснения.
В целом, основные элементы модифицированной авторами технологии получения трансгенных мышей состоят в следующем. Усовершенствован способ вызывания суперовуляции у мышей-доноров за счёт синхронизации половых циклов у самок-доноров к моменту обработки их гонадотропином СЖК. При подготовке самок-реципиентов использован приём предварительной подсадки самок-реципиентов к вазэктомированным самцам через перегородку, который способствует стимуляции фолликулогенеза и синхронизации половых циклов у самок-реципиентов. Это позволяет получать большее количество псевдобеременных самок-реципиентов с копуляционными пробками к определённому времени, что является одним из критериев полноценности животного-реципиента и возможности успешной трансплантации ему эмбрионов, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями. С использованной модифицированной технологии получены трансгенные мыши (F0) с интегрированными конструкциями, включающими нуклеотидные последовательности генов Natl и Nat2 человека под промотором гена альбумина мыши. Анализ интеграции трансгенов в различных органах и тка-
нях у потомков (Fj) первичных трансгенных мышей показал, что встраивание генов Natl и
Nat2 человека произошло во все три зародышевых листка.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аллен Н., Бартон Ш., Сурани А., Рейк В. Получение трансгенных мышей // Биология развития млекопитающих. Методы (Ред. М. Манк). - М.: Мир. 1990.- С. 278-298.
2. Езерский В.А., Тевкин С.И., Трубицина Т.П., Колоскова Е.М., Шишиморова М.С., Безбородова О. А., Якубовская Р.И., Рябых В.П. Интеграция и тканеспецифическая экспрессия гена лактоферрина человека в молочной железе трансгенных кроликов // Проблемы биологии продуктивных животных. -2013. - № 4. - С. 33-52.
3. Каркищенко Н.Н., Рябых В.П., Каркищенко В.Н., Колоскова Е.М. Создание гуманизированных мышей для фармакотоксикологических исследований (успехи, неудачи и перспективы). // Биомедицина. - 2014. - № 3. - С. 4-22.
4. Мерфи Д., Хенсон Дж. Получение трансгенных мышей путём микроинъекции клонированной ДНК в оплодотворённые яйцеклетки // Новое в клонировании ДНК. Методы (Ред. Д. Гловер). -М.: Мир,1989. - С. 308-353.
5. Рябых В.П., Колоскова Е.М., Езерский В.А., Трубицина Т.П., Максименко С.В. О перспективах получения трансгенных мышей-биомоделей для фармакологических и токсикологических исследований // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2015. - № 2. - С. 5-23.
6. Blin N., Stafford D.V. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes // Acids Res. - 1976. - Vol. 3. - P. 2303-2308.
7. Cao W., Chau B., Hunter R., Strnatka D., McQueen C.A., Erickson R.P. Only low levels of exogenous N-acetyltransferase can be achieved in transgenic mice // Pharmacogen J. - 2005. - Vol. 5. - C. 255-261.
8. Sakurai T., Kimura M., Sato M. Temporary developmental arrest after storage of fertilized mouse oocytes at 4C: effects on embryonic development, maternal mRNA processing and cell cycle // Molecular Human Reproduction. - 2005. - Vol. 11. - No. 5. - P. 325-333.
9. Sakurai T., Watanabe S., Kamiyoshi A., Sato M., ShindoT. A single blastocyst assay optimized for detecting CRISPR/Cas9 system-induced indel mutations in mice // BMC Biotechnology. - 2014. - Vol. 14. - P. 69-79.
10. Sim E., Pinter K., Mushtaq A., Upton A., Sandy J., Bhakta S. Arylamine N-acetyltransferases: a phar-macogenomics approach to drug metabolism and endogenous function // Biochem. Soc. Trans. - 2003. -Vol. 31. - P. 615-619.
11. Sugamori K., Brenneman D., Grant D.M. Liver-selective expression of human arylamine N-acetyltransferase NAT2 in transgenic mice // Drug Metab. Disp. - 2011. - Vol. 39. - P. 882-890.
REFERENCES
1. Allen N., Barton Sh., Surani A., Reik V. [Production of transgenic mouse]. In: Developmental biology of mammals. Methods (Ed. М. Маш). Мoscow: Mir Publ., 1990, P. 278-298.
2. Blin N., Stafford D.V. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes. Nucl. Acids Res. 1976, 3: 2303-2308.
3. Cao W., Chau B., Hunter R., Strnatka D., McQueen C.A., Erickson R.P. Only low levels of exogenous N-acetyltransferase can be achieved in transgenic mice. Pharmacogen. J. 2005, 5: 255-261.
4. Ezerskii V.A., Tevkin S.I., Trubitsina T.P., Koloskova E.M., Shishimorova M.S., Bezborodova O. A., Yakubovskaya R.I., Ryabykh V.P. [Integration and tissue-specific gene expression of human lactoferrin in the mammary gland of transgenic rabbits]. Problemy biologiiproductivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology. 2013, 4: 33-52.
5. Karkishchenko N.N., Ryabykh V.P., Karkishchenko V.N., Koloskova E.M. [Creating humanized mice for pharmaco toxicological studies (successes, failures and prospects). Biomeditsina - Biomedicine. 2014, 3: 4-22.
6. Merfi D., Khenson Dzh. Production of transgenic mice by microinjection of cloned DNA into fertilized ovules. In: New in DNA cloning. Methods (Ed. D. Glover). Мoscow; Mir Publ., 1989, 386 p.
7. Ryabykh V.P., Koloskova E.M., Ezerskii V.A., Trubitsina T.P., Maksimenko S.V. [On the prospects of producing transgenic mice biomodels for the pharmacological and toxicological studies]. Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology. 2015, 2: 5-23.
8. kurai T., Kimura M., Sato M. Temporary developmental arrest after storage of fertilized mouse oocytes at 4C: effects on embryonic development, maternal mRNA processing and cell cycle. Molecular Human Reproduction. 2005, 11(5): 325-333.
9. Sakurai T., Watanabe S., Kamiyoshi A., Sato M., ShindoT. A single blastocyst assay optimized for detecting CRISPR/Cas9 system-induced indel mutations in mice. BMC Biotechnology. 2014, 14: 69-79.
10. Sim E., Pinter K., Mushtaq A., Upton A., Sandy J., Bhakta S. Arylamine N-acetyltransferases: a phar-macogenomics approach to drug metabolism and endogenous function. Biochem. Soc. Trans. 2003, 31: 615619.
11. Sugamori K., BrennemanD., Grant D.M. Liver-Selective expression of human arylamine N-acetyltransferase NAT2 in transgenic mice. DrugMetab. Disp. 2011, 39: 882-890.
Physiological and embryological aspects of the technology for producing transgenic mice by microinjection of gene-engineered constructions into pronuclei of zygotes
Ryabykh V.P., Trubitsina T.P., Maksimenko S.V., Zhukova O.B., Stolyarova V.N.,
Ezerskii V.A., Koloskova E.M.
Institute of Physiology, Biochemistry and Nutrition of Animals, Borovsk Kaluga oblast, Russian Federation
ABSTRACT. The purpose of the article is to describe the main stages of the modified technology of producing transgenic mice, illustrated by the creating of humanized biomodels with integrated human N-acetyltransferase genes (Nat1 and Nat2). Improved method is described for inducing superovulation in mice-donors through the synchronization of sexual cycles in donor females at the time of their treatment by PMS gonadotrophin, which allows to get to a certain time 17 zygotes per donor with clearly visible pronuclei, suitable to the injecting of gene-engineered constructions. Linear fragments of the genetically engineered plasmid constructions comprising nucleotide sequences of human genes Nat1 Nat2 under mouse albumin gene promoter (hNatli hNat2), were microinjected into the male pronuclei of zygotes derived from Fi hybrid female mice (CBA/la *C57BL/6). During preparation of the recipient females, the method was also used of preliminary replanting recipient females to vasectomized males through the hurdle, which helped to stimulate folliculogenesis and synchronization of sexual cycle in female recipient. So, it is possible to obtain a greater number of pseudopregnant female recipients with copulatory plugs to a certain time, which is one of the criteria of usefulness of the recipient animal, and the possibility of a successful transplantation of embryos microinjected with gene-engineered constructions. On the basis of these methods, a modified version of the technology for producing transgenic mice is designed. Transgenic mouses (F0) are produced with integrated into their genome constructions comprising the nucleotide sequences of human genes Nat1 Nat2 under mouse albumin gene promoter. Analysis of integration of transgenes in various tissues and organs in the offspring (F1) of the primary transgenic mice (F0) does indicate that the incorporation of human genes Nat1 and Nat2 happened to all three germ layers.
Keywords: gene-engineered constructions, human N-acetyltransferase, mouse, superovulation, synchronization of sexual cycles, transgene integration
Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology, 2016, 2: 5-19
Поступило в редакцию: 05.03.2016 Получено после доработки: 25.04.2016
Рябых Владимир Павлович, д.б.н., проф., зав. лаб., 8(484)386-64-31, vlt03@kaluga.ru Трубицина Т.П., к.б.н., с.н.с; Максименко С.В., к.б.н., с.н.с.; Жукова О.Б., н.с.; Столярова В.Н., к.б.н., с.н.с.; Езерский В.А., н.с.; Колоскова Е.М., к.б.н., с.н.с.
