CC BY
80
УДК 542.87
НОВЫЙ ПОДХОД К КАЧЕСТВЕННОМУ И КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ ДИОКСИНОВ
© 2014 Г.И. Гумерова1, Э.В. Гоголь1, А.В. Васильев2
1 Казанский национальный исследовательский технический университет им. А.Н. Туполева - КАИ (КНИТУ-КАИ) 2 Самарский государственный технический университет
Поступила в редакцию 13.01.2014
В данной статье рассмотрены основные проблемы, связанные с количественным определением диоксинов, предложен новый ферментный метод экспресс-анализа диоксиноподобных соединений и биосенсор для его реализации.
Ключевые слова: диоксины, ферментные методы анализа, биосенсор, вольтамперометрия, цитохром Р450.
За последнее время наблюдается значительный рост загрязнений окружающей среды [1-3, 10, 11]. Одним из наиболее опасных является загрязнение диоксинами.
Диоксины - это собирательный термин для галогенированных шестичленных ароматических углеводородов, содержащие в своем составе два атома кислорода. Наибольшую опасность из этого класса соединений представляют полихло-рированные дибензодиоксины (ПХДД), такие как 2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксин, полихлори-рованные дибензофураны (ПХДФ) и полихло-рированные бифенилы (ПХБ). Диоксины присутствуют в окружающей среде в виде сложных смесей [4]. Все они имеют разную токсичность и поэтому очень трудно определить общую токсичность любой смеси. Токсичность любой смеси определяется ДЭ (диоксиновым эквивалентом) и рассчитывается сложением сумм факторов токсической эквивалентности (ФТЭ), умноженных на концентрацию того или иного диоксиноподоб-ного соединения, выражается в общей концентрации, в нг/кг:
ДЭ= Z (ТХДД1* ФТЭ1)+ Z (ТХДФ1* ФТЭ1)+ + ¿(ПХБ** ФТЭ1) 1 1 (1)
По определению, чтобы рассчитать общий ТЭ необходимо знать концентрацию каждого диок-
Гумерова Гузель Ильдаровна, старший преподаватель кафедры общей химии и экологии. E-mail: geri6872@mail.ru Гоголь Эллина Владимировна, кандидат химических наук, доцент кафедры общей химии и экологии. E-mail: ellinagogol@bk.ru
Васильев Андрей Витальевич, доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой "Химическая технология и промышленная экология". E-mail: ecology@samgtu.ru
синоподобного компонента в смеси. Отсюда возникает необходимость в точных и надежных количественных анализах [5].
Аналитические требования по определению диоксинов являются уникальными по сравнению с определением других химических веществ, так как эти работы весьма трудоемки из-за аномально низких уровней определяемых концентраций.
В основе количественного контроля диоксинов лежат гибридные методы физико-химического анализа - сочетание хроматографии и масс-спектрометрии. Такое сочетание обеспечивает высокую чувствительность и точность определения. К недостаткам относятся дороговизна из-за использования дорогостоящих стандартов, химических реактивов, приборов с высокой стоимостью технического обслуживания, необходимость хорошо обученного персонала, низкая пропускная способность, невозможность определения некоторых диоксиноподобных соединений, таких как бром-хлор-диоксинов, полибромированных диоксинов [6]. Отбираемые пробы, как правило, имеют очень сложный и неоднородный состав и включают в себя большое количество химических веществ, которые могут стать помехой при определении диоксинов. По этой причине анализируемые образцы должны быть подвергнуты предварительной пробоподготовке и очистке от посторонних включений. В свою очередь, проведение эффективной пробоподготовки невозможно без дополнительного лабораторного оборудования.
Из-за сложной подготовки образца, селективности и сверхнизких пределов обнаружения, стоимость анализа диоксинов намного выше, чем любые другие аналитические методы.
Кроме того, среди проблем контроля объек-
1717
тов природной среды есть такие, решить которые затруднительно даже с помощью вышеуказанных методов: аварийные поступления загрязнений от предприятий, арбитражная практика, когда подтвердить аналитическую информации, полученную методами ГХ/МС или ВЭЖХ/МС, необходимо результатами, полученными совершенно иным методом контроля (электрохимическим, биохимическим и пр.).
Развитие количественных методов определения диоксинов предполагает снижение стоимости, повышение скорости, селективности, уменьшение пределов обнаружения анализа, что позволит увеличить число аналитов в одном анализе. На сегодняшний день возникает необходимость проведения таких анализов в реальном масштабе времени и приспособление к полевым условиям аналитического оборудования, которое не уступало бы своими возможностями лабораторному.
В этой связи разработка ферментных методов определения полигалогенированных дибен-зо-гс-диоксинов и родственных им соединений является актуальной.
Предлагаемый метод может использоваться для комбинированного или предварительного экспресс-анализа проб объектов природной среды, предположительно содержащих ксенобиотики, обладающие опасными и/или токсичными свойствами для экологической системы. Метод предполагает сочетание физико-химического датчика (сенсора) и биообъекта. Подобное сочетание называют биосенсором.
Биосенсоры на основе ферментов наиболее просты в изготовлении и эксплуатации и имеют перспективы широкого применения [7]. Недостатком их является то, что фермент часто денатурирует (изменяет структуру своего белка) под действием химических реагентов, используемых при обработке проб. Решение этой проблемы лежит в области модификации либо структуры самого белка, либо поверхности датчика.
Электрохимические биосенсоры - это электроды, поверхность которых сформирована с использованием полимерных пленок, на которые иммобилизован селективный к определяемому токсиканту фермент [8]. Такие электроды реализуют одновременно принципы твердофазной экстракции (на ферментсодержащей мембране) и биохимическое «узнавание» целевой молекулы. Поэтому выбор фермента при конструировании биосенсора является ключевой задачей.
Для проявления токсического эффекта на живой организм большинству ксенобиотиков
требуется активация с образованием электро-фильной формы, которая в результате выдает молекулу, способную необратимо реагировать с нуклеофилами живой ткани. Известно, что такая биохимическая активация катализируется почти всеми ферментами, участвующими в биотрансформации ксенобиотиков.
Цитохромы Р450 млекопитающих представляют собой структурно и функционально различные изоферменты, которые кодируются суперсемейством генов. Одним из важнейших свойств компонентов монооксигеназной системы, в частности цитохрома Р-450, является способность к индукции под действием внешнего стимула, в роли которого могут выступать ксенобиотики. Экзогенные вещества индуцируют ферменты, что является побочным действием метаболизма. Феномен индукции цитохромов Р450 является важнейшей составляющей адаптивного ответа на чужеродные соединения, попадающие в клетку. Это приводит к усилению детоксификационной функции организма с последующим выведением ксенобиотика [9].
Для подтверждения отсутствия острой токсичности диоксиноподобных соединений и невозможность их определения скрининг - анализом на живых системах было проведено биотестирование подготовленных модельных проб. Результаты биотестирования показали, что для ксенобиотиков типа диоксина, которые не обладают острой токсичностью, а являются канцерогенами и мутагенами, данный метод контроля не информативен. Опасными, соединения такого типа, становятся только при попадании в организм и вступлении в метаболизм под действием ферментов.
Изоформа цитохрома 1А1 присутствуют в организме как человека, так и млекопитающих и типичным субстратом для нее являются диоксины. Это и послужило основанием для выбора данной изоформы цитохрома в качестве биорецептора разрабатываемого биосенсора.
Принцип работы предлагаемого биосенсора заключается в том, что при проведении анализа в электрохимической ячейке определяемый компонент диффундирует в тонкий слой биологического материала датчика, где протекает реакция с образованием продуктов, на которые реагирует электрод.
Так как изоформа фермента цитохром Р4501А1 проявляет свою активность только в отношении диоксинов, другие ионы, присутствующие в буферном растворе, не мешают протеканию химической реакции. Для конструирования
1718
такого биосенсора необходимо было подобрать составляющие его материалы и условия изготовления так, чтобы сигнал был воспроизводимым и стабильным, время функционирования биосенсора увеличилось и фермент, иммобилизованный на его поверхности, имел хорошую активность и не денатурировал.
Так как биодеградации диоксинов приводит к образованию фенола, который является электроактивным соединением, было принято решение использовать электрохимические методы анализа для определения его концентрации, а именно инверсионную вольтамперометрию. Этот метод широко используется в области химического анализа веществ, присутствующих в микроконцентрациях.
Исходя из свойств материалов, возможных для использования при конструировании электрода, была предложена конструкция биосенсора, за основу которого взят электрод из стеклоугле-родного материала с иммобилизованным на его поверхность биологически чувствительного элемента (изоформы фермента цитохрома Р4501А1).
Если селективность биохимического распознавания определяется в основном биологическим компонентом, то характеристики регистрации этого распознавания зависят, прежде всего, от способа включения биологического компонента в состав биосенсора, т.е. совокупностью факторов, определяющих контакт преобразователя и биокомпонента и способ регистрации сигнала.
Из за своей белковой природы ферменты неустойчивы при хранении, а также чувствительны к тепловым воздействиям. Решить эти проблемы помогает создание иммобилизованных ферментов. Необходимость иммобилизации ферментов объясняется, так же, экономической выгодой. При прямом введении фермента в реакцию, по окончании процесса он, вместе с продуктом реакции, выводится из рабочей зоны и утрачивается. Следовательно, подлежит использованию только однократно. Исходя из этого, необходимо задерживать фермент в зоне реакции с целью его многократного использования.
Во избежание проблем, возникающих при различных способах иммобилизации, нами была разработана модифицированная методика, сочетающая приемы, использованные при изготовлении накладных мембран и описанные для одноразовых биосенсоров на основе планарных электродов.
Соблюдение единообразия при конструировании биосенсора по предлагаемой методике по-
зволяют получать хорошую воспроизводимость результатов и стабильность отклика при многократном использовании.
Биосенсоры показали хорошую воспроизводимость как фонового тока, так и отклика на низкие концентрации диоксинов в пределах 10-9 - 10-12 М.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Васильев А.В. Обеспечение экологической безопасности в условиях городского округа Тольятти: учебное пособие. Самара: Изд-во Самарского научного центра РАН, 2012. 201 с., ил.
2. Васильев А.В., ПерешивайловЛ.А. Глобальный экологический кризис и стратегии его предотвращения. Региональные аспекты защиты окружающей среды. Учеб. пособие для студентов вузов, обучающихся по экологическим специальностям. Федеральное агентство по образованию, Тольяттин-ский гос. ун-т. Тольятти, 2005.
3. ЗаболотскихВ.В., Васильев А.В. Мониторинг токсического воздействия на окружающую среду с использованием методов биоиндикации и биотестирования: монография. Самара, 2012.
4. Ившин В.П. Диоксины и диоксиноподобные соединения: пути образования, свойства, способы деструкции. Йошкар-Ола: Изд-во Марийского государственного университета, 2005. 320 с.
5. Safe S. Polychlorinated biphenyls (PCBs), dibenzo-p-dioxins (PCDDs), dibenzofurans (PCDFs), and related compounds: Environmental and mechanistic considerations which support the development of toxic equivalency factors (TEFs) // CRC Crit. Rev. Toxicol. 1990. № 21. Р. 51-88.
6. An enlightened approach to screening for dioxins/ Environews. Forum // Environmental Health Perspectives. 1997. Vol.105, №11. P.1176-1177
7. Electrochemical biosensors: recommended definitions and classification./ Thevenot DR, Toth K, Durst RA, Wilson GS.// Biosens Bioelectron. 2001, № 16(1-2). Р. 121-31.
8. Дзядевич С.В. Амперометрические биосенсоры. Основные принципы работы и особенности датчиков разных генераций.// Бiополiмери i кл^и-на. 2002. Т. 18, № 1. С. 13-25
9. P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers, and nomenclature / Nelson, D.R., Koymans, L., Kamataki, T., Stegeman, J. J., Feyereisen, R., Waxman, D. J.,Waterman, M. R., Gotoh, O., Coon, M. J., Estabrook, R.W., Gunsalus, I. C., and Nebert, D.W. // Pharmacogenetics. 1996, № 6. Р. 1-42.
10. Vasilyev A.V., Khamidullova L.R., Podurueva V.V., Solovyov S.G. Investigation of toxicity of waste water of "AVTOVAZ" company by using biological testing methods // Safety of Technogenic Environment. 2012. № 2. С. 72-75.
1719
11. Vasilyev A.V., Gusarova D.V. Analysis of lubricating health and the ways of it reduction // Safety of
cooling liquids negative influence to the human's Technogenic Environment. 2013. № 4. C. 37-41.
A NEW APPROACH TO THE QUALITATIVE AND QUANTITATIVE DETERMINATION OF DIOXINS
© 2014 G.I. Gumerova1, E.V. Gogol1, A.V. Vasilyev2
'Kazan National Research Technical University named after A.N. Tupolev (KNRTU n.a.A.N. Tupolev)
2Samara State Technical University
This article describes the main problems associated with the quantification of dioxin, we propose a new method for rapid enzyme analysis of dioxin-like compounds and biosensor for its implementation. Keywords: dioxins, enzymatic methods of analysis, biosensor, voltamperometry, cytochrome P450.
Guzel Gumerova, Senior Lecturer at the Chemistry and Ecology Department. E-mail: geri6872@mail.ru Ellina Gogol, Candidate of Chemical Sciences, Associate Professor at the Chemistry and Ecology Department. E-mail: ellinagogol@bk.ru
Andrey Vasilyev, Doctor of Technical Science, Professor, Head at the of Chemical Technology and Industrial Ecology Department. Email: ecology@samgtu.ru
1720
