CC BY
95
УДК 57.084.1
ПОДХОДЫ К ОЦЕНКЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОПАСНОСТИ ДИОКСИНОВ
© 2016 Г.И. Гумерова, Э.В. Гоголь, О.С. Егорова
Казанский национальный исследовательский технический университет им. А.Н. Туполева - КАИ
Статья поступила в редакцию 02.12.2015
Рассмотрен метод биотестирования для оценки безопасности диоксиноподобных соединений. Описан процесс трансформации диоксинов в живых системах до более токсичных метаболитов. Выявлены ферменты, участвующие в детоксикации диоксинов. Получены модельные растворы диоксинов, имитирующие образование их в объектах окружающей среды. Экспериментально доказана неинформативность биотестирования для определения опасности диоксинов. Ключевые слова: диоксины, биотестирование, цитохром Р450, опасность для окружающей природной среды, диоксиновый эквивалент, коэффициент токсичности.
1. ВВЕДЕНИЕ
Диоксины - это собирательный термин для галогенированных шестичленных ароматических углеводородов, содержащие в своем составе два атома кислорода.
Диоксины являются побочными продуктами производственных процессов (пиролиза, отбеливания целлюлозы и пр.) химической, нефтехимической и металлургической промышленностей, образуются при горении полимеров (бытовых и медицинских отходов, древесины). Диоксины присутствуют в природной среде в виде сложных смесей, каждый из компонентов которых имеет разную токсичность, в связи с чем в пробах реальных объектов природной среды сложно определить их общую токсичность и оценить экологическую опасность смеси [1]. Рассеивание в атмосфере способствует трансграничному переносу диоксинов, поэтому их распространение в природной среде носит глобальный характер: диоксины обнаруживаются во всем мире в пробах почв, донных отложений, продуктах питания, воды и воздуха [2].
Ившин с соавт. [1] предположили, что образование ПХДД/ПХДФ возможно из ароматических соединений - прекурсоров - в присутствии хлора и катализаторов - переходных металлов. В качестве прекурсоров могут выступать такие ароматические соединения, как фенолы, хлорфенолы и хлорбензолы. Хлорид меди (II) может ускорять превращение ароматических прекурсоров в их хлорированные формы, а затем в диоксины и дибензофураны [3].
Гумерова Гузель Ильдаровна, кандидат технических наук, старший преподаватель кафедры общей химии и экологии. E-mail: geri6872@mail.ru
Гоголь Эллина Владимировна, кандидат химических наук, доцент кафедры общей химии и экологии. E-mail: ellinagogol@bk.ru
Егорова Ольга Сергеевна, старший преподаватель кафедры общей химии и экологи. E-mail: egorova_o_s@bk.ru
Находящиеся в воде гуминовые и фульво-кислоты являются естественными источниками фенольных веществ, которые по вышеуказанному механизму могут преобразовываться в соединения диоксинового ряда (рис. 2).
Все соединения диоксинового ряда характеризуются высокой температурой плавления (> 800 °С), низкой растворимостью в воде (0,2 мкг/л) и хорошей растворимостью в неполярных растворителях, устойчивостью к агрессивным средам и окислителям в отсутствии катализаторов, высокой способностью к адгезии к любым поверхностям. Их накопление или адсорбция происходит в донных отложениях, взвешенных твердых частицах, золе, саже и жировых тканях организма. Эти свойства важны для прогнозирования образования диоксинов в ряде производственных процессов и выбора метода аналитической диагностики [4]. Для выбора методов контроля содержания диоксинов важными являются не только физико-химические свойства этих соединений, но и понимание механизма их влияния на живые системы.
В Российской практике в рамках экологического нормирования широко используются санитарно-гигиенические показатели для оценки токсичности объектов природной среды, которые основываются на определении концентраций нормируемых компонентов и сопоставления их с предельно допустимыми значениями. Но данный подход не позволяет оценить степень биологической опасности для живых организмов. В связи с этим проводится биотестирование на тест - организмах для характеристики и оценки токсического эффекта.
С помощью биотестирования возможно определить токсическое действие некоторых веществ для которых не установлены предельно допустимые концентрации, а следовательно и опасность. Метод позволяет определить интегральную токсичность, обусловленную совокупностью всех присутствующих в пробе опасных токсических веществ и их метаболитов.
2,3,7,8-тетрахлордибензо-п-диоксин
2,3,4,7,8-пентахлордибензофуран
3,3',4,4',5-пентахлорбифенил
Рис. 1. Наиболее опасные представители класса диоксинов
CvjCIj
а
а,
CI,
х ^'х У
Рис. 2. Образование диоксиноподобных ксенобиотиков из фенола в качестве прекурсора
Конечной целью биотестов является оценка безопасности исследуемого объекта и на основании полученных результатов прогнозирование реакции организма человека или животных. Сложность при таком подходе к оценке безопасности заключается в получении прогноза с достаточным уровнем достоверности, так как любые биологические модели имеют разную степень приближения к организму, который моделируют. А следовательно, и разную реакцию на продукты метаболизма этих веществ внутри клетки.
В отношении диоксинов применение биотестирования вызвано тем, что физико-химические методы анализа могут оказаться неэффективными из-за недостаточной чувствительности, отсутствия методик на определение некоторых конгенеров и ультранизких концентраций. Тогда как живые организмы способны воспринимать более низкие концентрации веществ, чем любой аналитический датчик. Т.е. они могут быть подвержены токсическим воздействиям, не регистрируемым техническими средствами [5].
Считается, что опасность представляют только 17 хлор- и бромпроизводных конгенеров ПХДД и ПХДФ, обладающих диоксиноподобной активностью, т.е. особо токсичных для окружающей среды. Согласно стандартам ВОЗ токсичность каждого соединения ряда диоксинов определяется фактором токсической эквивалентности (ФТЭ)
по отношению к наиболее токсичной форме (2,3,7,8-ТХДД) и называется диоксиновым эквивалентом (ДЭ) размерностью нг/кг [6]. ДЭ=У(ТХДД* ФТЭ:)+ У(ТХДФ.* ФТЭ^ У(ПХБ.* ФТЭ^
Факторы токсической эквивалентности основаны на величинах острой токсичности, полученных в исследованиях in vivo и in vitro. Однако метод с применением ФТЭ имеет свои ограничения. Молекулярная организация живого чрезвычайно сложна. Теоретически любая молекула организма может стать мишенью для воздействия диоксинов. Однако, поскольку значение ФТЭ для разных когенеров неодинаково, то и последствия этого воздействия различны.
Отсутствие острой токсичности некоторых соединений диоксинового ряда не говорит об отсутствии опасности их воздействия на живые организмы. Воздействие когенеров с низким фактором токсической эквивалентности или микродоз когенеров, проявляющих, либо не проявляющих острою токсичность, может быть опасным. Опасность может заключаться в их накоплении и образовании онкологических заболеваний и генных изменений.
К тому же, попадая в живые системы, диоксины вступают в метаболизм и подвергаются биохимической трансформации под действием ферментов ряда цитохромов Р450 [7]. Ферментная система цитохромов Р450 обнаруживается во всех организмах, начиная от бактерий, и характеризуется высокой каталитической актив -ностью и способностью к окислению почти всех классов сложных органических ксенобиотиков [9]. Митохондриальные цитохромы Р450 играют важнейшую роль в определении интенсивности и времени действия чужеродных соединений и ключевую - в детоксикации ксенобиотиков, а также в активации их до токсичных и/или канцерогенных метаболитов [9].
С физиологической точки зрения это процесс направлен на защиту живых систем от накопления в них подобных соединений и является важней-
шей составляющей адаптивного ответа на чужеродные соединения, попадающие в клетку, усиления детоксификационной функции организма и выведения ксенобиотика [10]. Однако, в случае диоксинов, побочными продуктами метаболизма являются фенольные соединения, которые могут привести к гораздо большим токсическим эффектам, чем нативные когенеры. Причем острый токсический эффект от продуктов метаболизма диоксинов у всех организмов будет разным. Это зависит от активности фермента фенолоксидазы, способной разлагать фенольные соединения и выводить их из организма. Поэтому об опасности диоксиноподобных соединений в отношении живых систем можно судить по активации именно изоформы фермента цитохром Р4501А1.
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1. Материалы и реагенты
В качестве объектов исследования были выбраны модельные пробы, имитирующие фоновое содержание фенола в Куйбышевском водохранилище, которые готовились из дистиллированной воды, нитрата меди и фенола.
При определении концентрации фенола использовали стандартные образцы состава водного и спиртового растворов фенола (с погрешностью не более 1 %), фенол кристаллический, натрий гидроокись, спирт этиловый ректифицированный технический, калий хлористый или,
двузамещенного, содержащем для постоянства ионной силы 0,1 М Na2SO4.
Измерения проводили с помощью комплекса аналитического вольтамперометрического СТА-1 сопряженного с 1ВМ-совместимым компьютером.
При имитации образовании диоксинов были использованы растворы NaCl, №ОС1 (свежеприготовленный), хлориды Fe3+, Cu2+.
Биотестирование проводили на инфузориях-туфельках Paramecium caudatum и дафниях Ceriodaphnia affinis.
Качественная реакция на содержание диок-синовых соединений в модельном растворе производилась индикаторами на основе азотистых соединений.
Растворы диоксинов заданной концентрации, использованные для сравнительного анализа при определении концентрации модельных проб, изготавливались из аттестованных стандартных образцов растворов ПХДД в толуоле.
В исследованиях биохимического разложения диоксинов использовали изоформы ферментов цитохром Р4501А1.
2.2. Моделирование образования диоксинов в процессе хлорирования воды, содержащей фенольные соединения
Исходя из того, что фенол является прекурсором образования диоксинов, на первом этапе эксперимента были подготовлены 3 модельные пробы (см. таблицу проб):
№ модельной Состав Пробоподготовка Назначение
пробы
1 Вода Готовили раствор Имитация фонового
дистиллированная, фенола концентрацией содержания фенола в
СиСЬ,фенол 0,001 мг/л Куйбышевском водохранилище
2 Модельная проба № 1, Газообразный хлор Имитация
хлор газообразный получали электролизом ЫаС1 и обрабатывали им модельную пробу № 1 обеззараживания питьевой воды хлорированием при водоподготовке
3 Модельная проба № 1, В модельную пробу № 1 Имитация условий,
раствор, содержащий добавляли раствор, создаваемых при
ЫаОС1 (хозяйственный содержащий ЫаОС1 смешении бытовых стоков
отбеливатель), (хозяйственный с природными водами в
катализаторы - ионы отбеливатель)и летний период
Бе3+ и Си2+ обрабатывали УФ -лампой
вода дистиллированная, аргон газообразный с содержанием кислорода не более 0,03%, бумага индикаторная универсальная, натрий двууглекислый (пищевая сода), бумага фильтровальная.
Буферный раствор готовили на основе дистиллированной воды из натрия фосфорнокислого
Желтое окрашивание при добавлении индикатора на основе азотистых соединений в пробы № 2 и № 3 подтвердило образование диоксиноподобных соединений из прекурсора - фенола. В пробе № 1 цветовой реакции не наблюдалось.
2.3. Определение острой токсичности модельных проб воды, содержащих фенол и диоксины, методом биотестирования
Острое токсическое действие исследуемой воды определяли по смертности (летальности) тест-объектов за определенный период экспозиции. Критерием острой токсичности являлось гибель 50% и более цериодафний и инфузорий за 48 часов в исследуемой воде при условии, что в контрольной пробе, не содержащей фенольных соединений, гибель не превышает 10%. Биотестирование и определение критерия токсичности проводили в соответствии с [11-14].
Разведение модельных проб № 1, № 2 и № 3 проводилось согласно табл.1. Для каждой серии растворов дополнительно готовились контрольные пробы с культивационной водой.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ
Несмотря на наличие множества производств, побочным продуктом которых являются диоксины, они так же могут неконтролируемо образовываться в объектах окружающей среды при определенных условиях. Прежде всего, это касается водоемов, подверженных загрязнению сточных промышленных вод. Процесс реализуется при температуре от 20 °С, воздействие УФ излучения ускоряет образование диоксинов, так как оно усиливает реакционную способность
хлора. Это явление хорошо известно в России, где хлорирование является стандартной процедурой водоподготовки и обеззараживания питьевой воды, а контроль содержания хлорфенолов является необязательной процедурой. Косвенно это явление нашло отражение в российских стандартах качества питьевой воды. В них допустимая концентрация фенола в нехлорируемой воде составляет 0,1 мг/л, а в хлорируемой - 0,001 мг/л [15].
При поступлении в организм в дозах, не превышающих допустимых суточных, принятых во многих странах, диоксины не обладают острой токсичностью. Накапливаясь в жировых тканях, они могут приводить к отдаленным последствиям - концерогенезу и мутагенезу. Доказательством этому служат результаты биотестирования подготовленных модельных проб, которое проводилось для подтверждения отсутствия острой токсичности диоксиноподобных соединений и невозможность их определения скрининг - анализом на живых системах (таблица 2).
Для проявления токсического эффекта на живой организм диоксинам требуется активация с образованием электрофильной формы, которая в результате выдает молекулу, способную необратимо реагировать с нуклеофилами живой ткани. Такая биохимическая активация катализируется изоформой фермента цитохром Р4501А1.
Все цитохромы Р450 - гемсодержащие белки. Обычно гемовое железо находится в окисленном состоянии (Ре3+). Механизм монооксигеназных
Таблица 1. Кратность разведения водной вытяжки в зависимости от класса опасности
Класс опасности отхода Кратность разведения водной вытяжки, при которой вредное воздействие на гидробионтов отсутствует
I >10000
II От 10000 до 1001
III От 1000 до 101
IV <100
V 1
Вид Наименование тест - Вид опыта Показатель Класс опасности
контролируе- объекта, методика (острый, токсичности
мого объекта хронический)
(фракции)
Paramecium caudatum Острый Кр(ю)=30
ПНДФТ 14. 1:2:3.13-06
Модельная 4
проба № 2 (малоопасный)
Ceriodaphnia affinis Острый Кр(ю)=70
ФР.1.39.2007.03221
Paramecium caudatum Острый Кр(ю)=10
Модельная ПНДФТ 14. 1:2:3.13-06 4
проба № 3 Ceriodaphnia affinis ФР.1.39.2007.03221 Острый Кр(ю)=50 (малоопасный)
Таблица 2. Результаты биотестирования модельных проб №№ 2 и 3
реакций включает активацию кислорода, с образованием весьма реакционноспособной частицы РеО+3, отщепляющий атом водорода или не связывающий п-электрон (при РеО+3), и рекомбинацию радикалов. Каталитическое действие цитохромов Р450 заключается в проявлении РеО+3 очень сильной окислительной способности. В механизме токсического действия принимает участие лабильное железо, включаясь в состав железопор-фириновых белков при индукции ферментов семейства цитохром Р450, поэтому при явном дефиците железа токсичность ксенобиотиков для живых организмов заметно снижается [16].
Монооксигеназная реакция, которую катализируют цитохромы Р450 является основной, в которой один атом кислорода взаимодействует с субстратом (ЛгИ), а другой восстанавливается до НО-. В качестве восстановителя в реакции (1) участвует НАДФН:
ЛгИ (диоксин)+О2 + НАДФИ + И+ ^ ^ ЛгОИ (фенол) + Н2О + НАДФ+ (1)
Механизм, благодаря которому цитохром получает электрон от НАДФИ, зависит от внутриклеточной локализации цитохрома Р450 [17].
Согласно [18], диоксин прочно связывается со специальным белком, названным арилу-глеводородным рецептором (ЛЬ-Я), который имеют многие клетки организма. Далее этот комплекс проникает в ядро клетки, активирует специальные гены. В результате в клетках в избыточном количестве нарастает содержание изоформы фермента цитохром Р4501А1. Чрезмерное увеличение содержания этого белка ускоряет окисление важных для жизнедеятельности клетки молекул, что и приводит к нарушению многих биологических процессов и, кроме того, способствует увеличению токсичности других химических соединений, поступающих в организм. Суть работы цитохрома Р450 состоит в том, что он связывает О2 и восстанавливает его в некий эквивалент активных форм кислорода. Именно в таком активированном состоянии фермент окисляет связанный субстрат [19]. Основным путем метаболизма диоксиноподобных ксенобиотиков у млекопитающих изоформой цитохрома Р4501А1, является их дегалогени-
рование, расщепление цикла и образование гидроксипроизводных - фенольных метаболитов [20, 21], токсическое действие которых так же подтверждалось методом биотестирования (табл. 3).
Результаты биотестирования показали, что для ксенобиотиков типа диоксина острая токсичность не является критерием опасности, поэтому данный метод контроля для ксенобиотиков, которые не обладают острой токсичностью, а являются канцерогенами и мутагенами, может быть не информативен. Главная опасность, исходящая от соединений такого типа, заключается в их отдаленных последствиях, и их пагубное воздействие происходит только при попадании в организм и вступлении в метаболизм под действием ферментов.
ВЫВОДЫ
При оценке токсичности на основе биотестирования проб воды, содержащих диоксины, их опасность при расчете диоксинового эквивалента занижается, поскольку не учитываются особенности метаболизма диоксинов в живых организмах. Система определения коэффициента токсичности не включает в себя возможности дальнейших превращений диоксинов, происходящих посредством действия ферментов непосредственно в клетках, когда менее токсичные соединения могут превращаться в более токсичные с точки зрения канцерогенно-сти и мутагенности. Не учитывается также тот факт, что диоксины, наряду с прямым действием, обладают также синергическим, усиливая токсическое действие других веществ. К тому же нельзя исключить вероятность того, что при практических исследованиях могут встретиться задачи, которые потребуют учета токсического вклада других, не учтенных пока факторов.
Т.о. при определении опасности ксенобиотиков для живых организмов следует отходить от определения острой токсичности и ориентироваться на процессы, запускаемые ферментными системами при попадании внутрь клетки живых организмов.
Таблица 3. Результаты биотестирования модельной пробы № 1
Вид Наименование тест - Вид опыта Показатель Класс опасности
контролируе- объекта, методика (острый, токсичности
мого объекта хронический)
Paramecium caudatum Острый Токсично,
ПНДФТ 14. 1:2:3.13-06 Кр(ю)=6000
Крр0)=5000 2
Проба № 1 (высокоопасный)
Ceriodaphnia affinis Острый Токсично,
ФР.1.39.2007.03221 Кр(ю)=5000
Кр(50)=2000
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ившин В.П. Диоксины и диоксиноподобные соединения: пути образования, свойства, способы деструкции. Марий Эл: Изд-во Марийского государственного университета, 2005.- 320 с.
2. Neubert D. Reflections on the assessment of the toxicity of dioxins for humans, using data from experimental and epidemiological studies // Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 1997. Vol.17. №4-5. Р. 157 - 215
3. Экспресс- анализ в экохимии / Ю.А. Тунакова, Г.И. Гумерова, М.Н. Исхакова, Д. А Богданова // Научный журнал «Вестник Казанского технологического университета». 2013 . Т.16. № 1. С. 163-167
4. Alcock R.E., Jones K.C. Dioxins in the Environment: A review of Trend Data // Environmental Sciense and Technology. 1996. Vol. 30. №11. - Р.3133 - 3143
5. Розанцев, Э.Г., Черемных Е.Г. Биотестирование или биологическая оценка безопасности // Экология и промышленность России. - 2003. - № 10. - С. 44-46
6. Safe S. Polychlorinated biphenyls (PCBs), dibenzo-p-dioxins (PCDDs), dibenzofurans (PCDFs), and related compounds: Environmental and mechanistic considerations which support the development of toxic equivalency factors (TEFs)// CRC Crit. Rev. Toxicol.1990. № 21.- Р. 51-88
7. Гумерова Г.И., Галиева А.Т., Гоголь Э.В. Методика определения диоксиноподобных токсикантов / // Вестник КГТУ им. А.Н. Туполева. 2013. № 1. С. 125-130
8. Guengerich, F. P. Human cytochrome P450 enzymes. in Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry / P. R. Ortiz de Montellano // Kluwer Academic/Plenum Press, New York. 2005.- Р. 377-530
9. Nelson D.R. P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers, and nomenclature / L. Koymans, T. Kamataki, J. J. Stegeman, R. Feyereisen, D. J. Waxman, M. R. Waterman, O. Gotoh, M. J. Coon, R.W. Estabrook, I. C. Gunsalus, D.W. Nebert // Pharmacogenetics. 1996. V.6. Р. 1-42
10. Микросомная монооксигеназная система живых
организмов в биомониторинге окружающей среды. Аналитический обзор. / Л.Ф. Гуляева, А.Ю. Гриша-нова и др. // ГПНТБ. - Новосибирск, 1994 - 98 с.
10. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости цериодаф-ний. ФР. 1.39.2007.03221.- М.: Акварос, 2007.- 56 с.
10. Методика определения острой токсичности питьевых, пресных природных и сточных вод, водных вытяжек из почв, осадков сточных вод и отходов по смертности дафний (Daphnia magna straus). ПНД Ф Т 14.1:2:4.12-06; Т 16.1:2.3:3.9-06.- М. 2006.- 45 с.
10. Временная инструкция по подготовке проб при определении экспериментальным методом класса опасности отходов для окружающей природной среды № 247 от 25.03.2002
10. Критерии отнесения опасных отходов к классам опасности для окружающей природной среды. Приказ № 511 от 15.06.2001
10. Милош В.В. Диоксины и их потенциальная опасность в экосистеме «человек - окружающая среда» [Электронный ресурс]. URL: http://crowngold.narod. ru/articles/dioxini.htm (дата обращения 10.11.2015).
10. Guengerich F.P., MunroA.W. Unusual cytochrome P450 enzymes and reactions // J. Biol. Chem. 2013. № 288.- Р. 17065-17073.
10. Reactive intermediates in cytochrome P450 catalysis / Krest, C. M. E. L. Onderko, T. H. Yosca, J. C. Calixto, R. F. Karp, J. Livada, J. Rittle, M. T. Green // J. Biol. Chem. 2013. № 288. Р. 17074-17081
10. Сибиряк, С.В. Влияние диоксинов на здоровье человека. Челябинск. 2005. 28 с.
10. Шкроб, А.М. Журнальная версия «Молекулы лечат»// «ХиЖ - XXI». 1998. №№ 1-3
20. Голиков, С.Н. Саноцкий И.В., Тиунов Л.А. Общие механизмы токсического действия. Л.: Медицина, 1986. 286 с.
21. Claassen, C.D. Toxicology . The basic Science of poisons // New York, Chicago, Toronto, London. Sixth Edition. 2001.- Р. 1236
APPROACHES TO RISK ASSESSMENT DEFINITIONS DIOXINS
© 2016 G.I Gumerova, E.V. Gogol, O.S. Egorova
Kazan National Research Technical University named after A.N. Tupolev
The method of bioassay to assess the safety of dioxin-like compounds. The process of transformation of dioxins in living systems to more toxic metabolites. Revealed the enzymes involved in the detoxification of dioxins. A model solutions dioxins, imitating their formation in the environment. Experimentally proved uninformative bioassay to determine the danger of dioxin.
Keywords: dioxins, bioassay, cytochrome P450, a danger to the environment, the equivalent of dioxin, a toxic coefficient.
Guzel Gumerova, Candidate of Technical Science, Senior Lecturer at the General Chemistry and Ecology Department. E-mail: geri6872@mail.ru
Ellina Gogol, Candidate of Chemistry, Associate Professor at the General Chemistry and Ecology Department. E-mail: ellinagogol@bk.ru
Olga Egorova, Senior Lecturer at the General Chemistry and Ecology Department. E-mail: egorova_o_s@bk.ru
