CC BY
116
УДК 543.068.5
Г. И. Гумерова, Э. В. Гоголь, О. С. Егорова, О. Н. Кузнецова
СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ НА ПОВЕРХНОСТИ ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЭЛЕКТРОДОВ
Ключевые слова: биосенсор, иммобилизация, фермент, химически модифицированные электроды.
Исследование и создание новых способов иммобилизации ферментов на поверхности химически модифицированных электродов является одной из важных задач при конструировании биосенсоров. Рассмотрены различные способы иммобилизации ферментов на химически модифицированные полимерными материалами поверхности электродов. Апробирован способ иммобилизации ферментов на поверхности объемных электродов методом вакуумирования в парах глутарового альдегида, разработанный для планарных датчиков, и подобраны необходимые условия.
Keywords: biosensor, the immobilization, enzyme, chemically modified electrodes.
Research and development of new methods of immobilizing enzymes onto the surface of chemically modified electrodes is an important task in designing of biosensors. Various methods of immobilizing enzymes onto the electrode surfaces which are chemically modified by polymeric materials have been considered. Method of enzyme immobilization onto the surface of the volume electrodes by vacuum in glutaraldehyde pairs, which is designed for the planar sensors, was tested and the necessary conditions were chosen.
Введение
При создании ферментативных биосенсоров возникает необходимость изменения поверхности электрода нанесением на нее слоя токопроводящего полимера или неорганического материала физическим, химическим либо электрохимическим способом, называемым модификатором [1]. При этом модификатор придает электроду новые электрокаталитические свойства, за счет которых увеличиваются предел обнаружения, чувствительность, селективность, воспроизводимость результатов и уменьшаются погрешности [2].
Химически модифицированные электроды с использованием полимерных материалов, тонким слоем нанесенных на поверхность электрода, сочетают в себе ряд преимуществ, таких как минимальный предел обнаружения и погрешности, быстрый отклик, возможность определения аналита в присутствии примесей [3,4].
Поверхностно - функциональные группы некоторых полимеров (например, нафиона) играют очень важную роль при модификации электрода, т.к. позволяют использовать методы ковалентной иммобилизации, создавая достаточно устойчивые фермен-тсодержащие слои на поверхности электрода.
Мембрана нафион представляет собой сополимер тетрафторэтилена и сомономера, имеющего боковые цепи перфторированного винилового эфира, оканчивающиеся сульфогруппами. Нафион отличается отсутствием электронной проводимости, а, следовательно, и цепей сопряженных связей между электроактивными группами, что не влияет на электродный процесс, катализируемый ферментом. За счет ярко выраженных гидрофобных свойств пер-фторированного скелета и наличия полярных суль-фогрупп в мембране происходит самоорганизация, в процессе которой образуются транспортные каналы, богатые водой и сульфогруппами, которые разделены гидрофобными полимерными цепями [5]. Такая
уникальная структура позволяют рекомендовать нафион для использования в качестве подложки для иммобилизации фермента при конструировании биосенсора.
Если селективность биохимического распознавания определяется в основном биологическим компонентом, то характеристики регистрации этого распознавания зависят, прежде всего, от способа включения биологического компонента в состав биосенсора, т.е. совокупностью факторов, определяющих контакт преобразователя и биокомпонента и способ регистрации сигнала.
Из-за своей белковой природы ферменты неустойчивы при хранении, а также чувствительны к тепловым воздействиям. Решить эти проблемы помогает создание иммобилизованных ферментов. Необходимость иммобилизации ферментов объясняется, так же, экономической выгодой. При прямом введении фермента в реакцию, по окончании процесса он, вместе с продуктом реакции, выводится из рабочей зоны и утрачивается. Следовательно, подлежит использованию только однократно. Исходя из этого, необходимо задерживать фермент в зоне реакции с целью его многократного использования [6].
Иммобилизация ферментов на модифицированных полимером электродах стала перспективным направлением развития биохимических методов контроля объектов окружающей среды. Иммобилизация обеспечивает стабилизацию биоматериала и близость между биоматериалом и преобразователем. Такие электроды обладают повышенной селективностью и чувствительностью при количественном определении контролируемых компонентов [7].
Экспериментальная часть
Иммобилизованный фермент при включении его в состав поверхности электрода должен сохранять высокую каталитическую активность по отношению к определяемому компоненту, структурную целостность (не денатурировать) и стабильность отклика
при хранении. В связи с этим был проведен ряд экспериментов с различными способами иммобилизации фермента на стеклоуглеродном электроде с модифицирующим покрытием с целью выбора наиболее подходящего.
По [8, 9] проведена иммобилизации фермента путем смешивания раствора мономера с ферментом, который во время полимеризации оказывается захваченным в его пространственную сетку.
Исходя из того, что через 9-11 раз использования чувствительность биосенсора резко снижалась (рис. 1), было сделано предположение, что этот способ ведет к постепенному вымыванию фермента из носителя в водных растворах и в полярных растворителях, что связано с чрезвычайно хорошей растворимостью казеина либо геля, взятых за основу носителя.
Количество измерений Рис. 1 - Иммобилизация путем смешивания раствора мономера с ферментом
Способ иммобилизации фермента на водонерас-творимых твердых носителях механическим перемешиванием, достаточного для иммобилизации фермента, осуществленный по [10], так же показал неудовлетворительные результаты (рис. 2). По-видимому, это связано с тем, что вследствие воздействия на фермент агрессивных сред, входящих в состав раствора полимера, такой способ может привести к денатурации и инактивации ферментов. Биосенсоры, изготовленные таким способом, имеют достаточно низкую активность иммобилизованных ферментов- 45-75% от нативной величины.
Способ иммобилизации путем обработки органического носителя водным раствором фермента был реализован по [11] на стеклоуглеродном электроде. В результате проведенных анализов был отмечен однократный отклик биосенсора (рисунок 3). В связи с чем, следует предположить, что не закрепленный ничем на подложке фермент попросту смывается при проведении анализов в водных средах. Активность фермента величиной 91 %, обеспеченная ранее [12], подтверждает предположение малой прочности связи фермент - полимер.
Количества измерений Рис. 2 - Иммобилизация фермента на водонерас-творимых твердых носителях механическим перемешиванием
Количество измерений Рис. 3 - Иммобилизация обработкой электрода водным раствором фермента
Иммобилизация фермента смешением полимерного носителя и сшивающего агента по [13] полностью не удовлетворяет требованиям, предъявляемым биосенсорам. В указанном способе иммобилизация фермента производится постепенным включением его в структуру полимера при смешении на вальцах при температуре 37 0С. Иммобилизованный таким способом фермент полностью денатурировался в процессе включения в полимерную пленку и отклика биосенсора не наблюдалось. Можно предположить, что повышенная температура совместно с механическим воздействием при реализации метода приводило к нагрузке на фермент, что способствовало иннактивации фермента.
Чтобы избежать указанных проблем, в настоящей работе была использована методика, разработанная [5], сочетающая приемы, использованные при изготовлении накладных мембран, и описанных для одноразовых биосенсоров на основе планарных электродов. Используя указанную методику иммобилизации, нами были проведены исследования, нацеленные на иммобилизацию ферментов на объемные электроды вакуумированием в парах глута-рового альдегида и подборку необходимых условий (рис. 4).
Модифицированный способ состоит в том, что иммобилизация раствора фермента в буфере производится на химически модифицированной полимером поверхности электрода с закреплением фермента вакуумированием в парах 2-5% глутарового альдегида, что позволяет сохранить высокую ферментативную активность и снизить расход фермента. В качестве полимера использовалась перфторирован-
ная ионообменная мембрана нафион, разработанная компанией DuPont. В качестве фермента была использована изоформа цитохрома Р450. В качестве материала электрода был выбран стеклоуглерод.
Количество измерений Рис. 4 - Иммобилизация фермента вакуумирова-нием в парах глутарового альдегида
Иммобилизацию фермента на рабочей части биосенсора размером 10x3 мм проводили путем кросс-сшивки парами глутарового альдегида. Для этого на рабочую поверхность сначала наносили 2 мкл суспензии нафиона в этаноле, давали высохнуть при комнатной температуре в течение суток. На следующий день растворяли исходный препарат фермента в фосфатном буферном растворе, рН 7.8, и наносили по 2 мкл полученного раствора на электрод. В результате расход фермента составлял менее 0,001 мг на каждый биосенсор, а активность фермента в расчете на каждый электрод 0,1 - 5,3 Е. Капле раствора давали подсохнуть до образования равномерной пленки. Затем электрод закрепляли в держателе на расстоянии 1 см над поверхностью раствора глутарового альдегида. Включали вакуумный насос и проводили иммобилизацию парами глутарового альдегида в течение 1 мин.
После этого электрод подсушивали при комнатной температуре и далее отмывали избыток глута-рового альдегида дистиллированной водой до полного исчезновения запаха. Электроды вымачивали в рабочем фосфатном буферном растворе и после высыхания заворачивали в алюминиевую фольгу. Изготовленные биосенсоры хранили в холодильнике при 4 оС.
При увеличении толщины покровного слоя на рабочей поверхности электрода происходит уменьшение отклика биосенсора на субстрат. Очевидно, это связано с диффузионным ограничением массо-переноса продукта реакции, образующегося в ферментной пленке, к электроду. Оптимальное количество нафиона, не вызывающее изменений в токе окисления субстрата, но сохраняющее стабилизирующее действие на сенсор, соответствует 2 мкл раствора на электроде.
При меньшей нагрузке нафиона либо при полном его отсутствии воспроизводимость результатов и время жизни биосенсора резко снижаются.
Биосенсоры на основе стеклоуглеродных электродов, модифицированные нафионом, с иммобилизованной по предлагаемой методике изоформой фермента цитохрома Р450 показали хорошую воспроизводимость результатов и стабильность отклика при многократном использовании [14]. Полученные результаты позволяют рекомендовать данный способ иммобилизации при конструировании ферментативных биосенсоров.
Литература
1. W. Kutner, J. Wang, M. L'her, R.P. Buck, Pure and Appl. Chem., 70, 6, 1301-1318 (1998)
2. V. Volotovsky, A.P. Soldatkin, A.A. Shul'ga, V.K. Ros-sokhaty, V.I. Strikha, A.V. El'skaya, Anal.Chim.Acta., 322, 77-81 (1996)
3. T.G. Drummond, M.G. Hill, J.K. Barton, Nat. Biotechnol., 21, 1192-1199 (2003)
4. K. Kerman, M. Kobayashi, E. Tamiya, Meas. Sci. Tech-nol., 15, Rl-Rll (2004)
5. Э.В. Гоголь, Автореф. дисс. канд. хим. Наук. Казанский гос. Ун-т, Казань, 2000. 23 с.
6. Инженерная энзимология. Высшая школа, Москва, 1987, С. 23-29, 95, 120-123
7. В.В. Шумянцева, Ю.О. Рудаков, П.А. Французов, Итоговая конференция но результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки но приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, Россия, 2008). Москва, 2008. С. 161.
8. I. Windal, M.S. Denison, L.S. Birnbaum, N. Van Wouwe, W. Baeyens, L. Goeyens, Environ Sci Technol., 39, 73577364 (2005)
9. Пат. Российская Федерация 2294369 (2005)
10. Пат. Российская Федерация 2010858 (1994)
11. Пат. Российская Федерация 2475538 (2013)
12. Пат. Российская Федерация 2054481 (l996)
13. Пат. Российская Федерация 2124052 (l998)
14. Г.И. Гумерова, Автореф. дисс. канд. техн. наук. Казанский гос. энергетический ун-т, Казань, 2014. 16 с.
© Г. И. Гумерова - к.т.н., ст. препод. кафедры общей химии и экологии КНИТУ им. А.Н. Туполева - КАИ, geri6872@mail.ru; Э. В. Гоголь - к.х.н., доцент той же кафедры, ellinagogol@bk.ru; О. С. Егорова - ст. препод. той же кафедры, egorova_olechka@mail.ru; О. Н. Кузнецова - к.х.н., доцент кафедры технологии пластических масс КНИТУ.
© G. I. Gumerova - Ph.D., Senior Lecturer of "General Chemistry and Ecology", Kazan National Research Technical University named after A.N.Tupolev - KAI (KNRTU-KAI); geri6872@mail.ru; E. V. Gogol - Ph.D., Associate Professor of "General Chemistry and Ecology", Kazan National Research Technical University named after A.N.Tupolev - KAI (KNRTU-KAI); ellinagogol@bk.ru; O. S. Egorova - Senior Lecturer of "General Chemistry and Ecology", Kazan National Research Technical University named after A.N.Tupolev - KAI (KNRTU-KAI); egorova_olechka@mail.ru; О. N. Kuznetsova - Ph.D., Associate Professor of plastics technology, Kazan national research technological University.
