CC BY
69
УДК 577.3
НОВЫЙ МЕТОД ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА КЛЕТОК ЖЕЛЕЗИСТОГО ЖЕЛУДКА ЦЫПЛЯТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛУОРОХРОМА «Steins all»
Акчурин С.В. - к.в.н., доцент; Ларионов С.В. - профессор, зав. кафедрой
Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И.Вавилова
Ключевые слова: нуклеиновые кислоты, белки, гистопрепараты стенки железистого желудка, «Steins all», спектральный анализ, экспериментальный сальмонеллез.
Keywords: nucleic acids, proteins, histologic specimen of glandular stomach part in chickens, «Steins all», spectral analysis, experimental salmonellosis.
В настоящее время в биологии и медицине все чаще применяется люминесцентный спектральный анализ, обеспечивающий изучение внутриклеточных химических процессов с сохранением всех морфологических структур клеток и тканей. При использовании метахроматического люминесцентного красителя, возникает возможность одновременного выявления различных органических соединений [2-4]. Таким свойством обладает люминесцентный краситель «Steins all», вызывающий достаточно яркую метахроматическую люминесценцию с формированием двух полос в спектре люминесценции, характерных для нуклеиновых кислот (НК) и белков [1]. Поскольку функциональное состояние клеток в значительной степени определяется степенью выраженности нарушений обмена этих органических соединений, целью данной работы стала разработка метода люминесцентного спектрального анализа с использованием флуорохрома «Steins all». Учитывая, что первой мишенью на пути проникновения возбудителей сальмонеллеза в организм птиц является железистый желудок, в качестве объекта исследования были выбраны клетки его слизистой оболочки.
Материал и методы. Для проведения исследования использовали 350 цыплят породы Хайсекс коричневый, которые были разделены на 2 группы: контрольную (200 цыплят) и опытную (150 цыплят). Для экспериментального заражения использовали двухдневных цыплят, взятых из благополучного по сальмонеллезу хозяйства, которых инфицировали перорально бактериями Sаlmonella еnteritidis в разведении 200 млн бактериальных клеток в 1 мл в заражающей дозе 0,2 мл/голову. Цыплятам контрольной группы вводили физиологический раствор в объеме 0,2 мл/голову. Изучали гистологические препараты железистого желудка
цыплят обеих групп на 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 15, 21, и 30 сутки их жизни. Гистологические срезы толщиной 4-7 мкм изготавливали на микротоме «Mikrom HM450» (Германия) из парафиновых блоков кусочков железистого желудка, фиксированных в 10 % нейтральном забуференном водном растворе формалина.
Люминесцентномикроскопические характеристики определяли на гистопрепаратах, окрашенных 10_4М спиртовым раствором «Steins all» по методике, разработанной применительно к гистологическим срезам. Спектры люминесценции эпителия альвеолярных желез получали с помощью универсального цветоанализатора микроскопа-спектрофотометра МСФУ-К (рис. 1).
X, нм
Рис. 1. Спектры люминесценции эпителия альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка цыплят контрольной (1) и опытной (2) групп. Гистологические срезы. Окраска «Steins all». По оси ординат -интенсивность люминесценции (I), по оси абсцисс - длина волны (X, нм)
Из рис. 1 видно, что в спектре люминесценции эпителия имеется две полосы максимума излучения: при длине волны 484 нм, характерной для НК, и 620 нм - для белков. Данные длины волн принимались во внимание при установлении коэффициента соотношения НК и белков в эпителии альвеолярных желез. Поскольку величина интенсивности люминесценции в процессе проведения исследования колебалась в очень больших пределах, для получения сопоставимых результатов был применен эталон, что позволило рассчитывать количество органических веществ в условных единицах. В качестве эталона (1Э) была использована максимальная величина интенсивности люминесценции промышленно изготовленного уранового стекла ЖС-19 толщиной 1,5 мм при длине волны 540 нм. Исходя из этого, количество НК в эпителии альвеолярных желез определяли по формуле:
X = —, где ^ 1Э
X - количество НК в условных единицах;
1п - величина интенсивности люминесценции при длине волны 484 нм. Количество белков в эпителии альвеолярных желез рассчитывали по формуле:
Y = , где
У- количество белков в условных единицах;
1ь - величина интенсивности люминесценции при длине волны 620
нм.
Для исключения влияния аутолиза, обусловливающего снижение показателей количественного содержания органических веществ в тканях, проводили фотометрирование трех участков с наибольшей степенью интенсивности люминесценции, выявляемой при визуальной микроскопии. При определении коэффициента соотношения НК и белков (К) учитывали максимальное значение из трех полученных результатов, и определяли его по формуле:
тг _ max
К = Y-----, где
max
Xmax - наибольшее количество НК в условных единицах;
Ymax - наибольшее количество белков в условных единицах.
Коэффициенты соотношения органических веществ (НК и белков) определяли у цыплят контрольной и опытной групп.
Результаты исследований и обсуждений результатов. В
окрашенных «Steins all» гистологических срезах стенки железистого желудка наблюдали своеобразную люминесцентномикроскопическую картину, характеризующуюся сочетанием синего, зеленоватого и малиново-красного цветов с разной степенью интенсивности на различных участках серозной, слизистой оболочек и мышечного слоя железистого желудка. Обнаруживаемая визуально люминесценция отражала особенности распределения в его стенке НК и белков, связанных с используемым флуорохромом.
Методом микроспектрального анализа были получены коэффициенты соотношения НК и белков в эпителии альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка цыплят. Динамика изменения коэффициентов соотношений у цыплят контрольной группы укладывалась в картину умеренного постепенного увеличения их значений с 1 по 30 сутки (рис. 2, 1).
Данное обстоятельство может быть объяснено постепенным и опережающим увеличением интенсивности люминесценции при длине волны 484 нм (In) относительно возрастания ее величины при 620 нм (Ib), которое наблюдалось в спектрах люминесценции клеток данной зоны. Эта тенденция сохранялась на протяжении всего периода увеличения возраста
цыплят (рис. 3, 1).
Рис. 2. Изменение показателей коэффициентов соотношений НК и белков в эпителии альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка цыплят контрольной (1) и опытной (2) групп. По оси ординат - значения коэффициентов соотношений НК и белков (К), по оси абсцисс - сутки жизни
(сут).
8-
6-
4-
2-
6 10 ЕИп Я!Ь
15
30
8-
6-
4-
2-
6
ЮЗ !п
Рис. 3. Величина интенсивности люминесценции НК (1п) белков (1Ь) в спектре люминесценции эпителия альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка цыплят контрольной (1) и опытной (2) групп. По оси ординат - величина интенсивности люминесценции, по оси абсцисс - сутки
жизни
0
0
3
У цыплят, инфицированных 8а1шопе11а ейегШ&Б, на кривой коэффициентов соотношения НК и белков, на 3 сутки жизни (1 сутки с момента заражения) отмечалось резкое увеличение данного коэффициента, что могло быть следствием роста 1п на фоне снижения 1ь (рис. 3, 2). В последующие сутки значение коэффициентов соотношения органических веществ уменьшалось, что могло быть результатом более быстрого роста 1ь по сравнению с увеличением 1п, причем, начиная с 7 суток, значение коэффициентов было значительно меньше аналогичных цифр контрольной группы.
Заключение. Проведенное исследование показало, что
разработанный метод люминесцентного спектрального анализа с использованием метахроматического люминесцентного красителя «Steins all» (в собственной модификации) позволяет определять коэффициенты соотношений НК и белков в эпителии альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка цыплят. Динамика изменений коэффициентов соотношения органических соединений отражает особенности развития нарушений внутриклеточного обмена этих веществ на протяжении всего патологического процесса - экспериментального сальмонеллеза. Результаты, полученные с помощью разработанного метода микроспектрального анализа, свидетельствуют о возможности выявления уже на ранних стадиях заболевания сальмонеллезом (до развития характерной патоморфологической и клинической картины) глубоких метаболических изменений в эпителии альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка цыплят. Данный метод может быть полезным при формировании принципиально нового подхода к вопросу создания современных методов диагностики, профилактики и лечения сальмонеллеза.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Карнаухов, В.Н. Люминесцентный анализ клеток [Электронный ресурс]: учебное пособие - Пущино. Электронное из-во «Аналитическая микроскопия». - 2002. - Режим доступа: http:cam.psn. ru: Р.В. Гуркин, свободный. - Загл. с экрана. - № гос. регистрации 6072 от 4 февраля 2002 г. 2. Пирс, Э. Специальные методы выявления веществ, содержащих углеводы. Метахромазия // Гистохимия. Теоретическая и прикладная. Пер. с англ. - Изд-во иностран. лит., 1962. - С. 224-236. 3. Dahlberg, A.E. Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agaroseacrylamide composite gels / Dahlberg, A.E.., Dingenon C.W., Peacock A.C. // J. Mol. Biol. - 1969. - V. 41. - P. 139-147. 4. Haag, D. Simultaneous differential staining of nucleic acids and proteins in histological tissues by means ofj-band effect / D. Haag, C. Tschahargane, K. Goerttler // Histochemie. - 1971. - V. 26. - P. 190-193.
НОВЫЙ МЕТОД ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА КЛЕТОК ЖЕЛЕЗИСТОГО ЖЕЛУДКА ЦЫПЛЯТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛУОРОХРОМА «Steins all»
Акчурин С.В., Ларионов С.В.
Резюме
Метод люминесцентного спектрального анализа с использованием метахроматического флуоресцентного красителя «Steins all» (в модификации автора) позволяет изучать динамику изменений коэффициентов соотношения нуклеиновых кислот и белков в эпителии альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка цыплят. Полученные авторами результаты свидетельствуют о возможности
использования данного метода для выявления ранних метаболических изменений до возникновения характерной патоморфологической и клинической картины сальмонеллеза цыплят.
MODERN METHOD OF LUMINESCENT ANALYSIS OF GLANDULAR STOMACH PART CELLS IN CHICKENS USING FLUORCHROME «Steins all»
Akchurin S.V., Larionov S.V.
Summary
The method of luminescent spectral analysis using metachromatic fluorescent tag «Steins all» (in author’s modification) allow examination of dynamic of proportion factors' changes of nucleic acids and proteins in epithelium of alveolar glands in mucosa of glandular stomach part in chickens.The obtained data testifies to possibility of the given method usage for revealing the early metabolic changes in glandular stomach part in chickens before characteristic pathomorphological and clinical changes at salmonellosis.
УДК636.084.73
ВЛИЯНИЕ КОНЦЕНТРАТА БИОТИНА В СОСТАВЕ МИНЕРАЛЬНО-ВИТАМИННОЙ ДОБАВКИ НА РОСТ И ОБМЕН ВЕЩЕСТВ МОЛОДНЯКА СВИНЕЙ
Алексеев В.А. - д.с-х.н., профессор; Никитин Е.Н. - аспирант Чувашская государственная сельскохозяйственна академия е-mail: alexeev.proff@yandex.ru
Ключевые слова: поросята, свиньи, опыт, рацион, витамины, биотин, живая масса, среднесуточный прирост, переваримость кормов, обмен веществ, кровь.
Keywords: pigs, porcine, experience, ration, vitamins, biotin, living mass, average daily weight gain, the digestibility of feed, metabolism, blood.
В детализированных нормах кормлении свиней учитываются шесть витаминов группы В из 17 известных [1]. По нашим исследованиям и литературным данными [2] свиньи, особенно молодняк, нуждаются и в других витаминах, не учитываемых в нормах. К ним относятся биотин или витамин Н.
Биологическая роль биотина в обмене веществ у животных изучена недостаточно. Предполагается, что он входит в ряд коферментов, принимающих участие в окислительных процессах, дезаминировании аминокислот, участвует в нервнотрофических процессах, при окислении
