CC BY
42
Использование метода люминесцентного спектрального анализа клеток железистого желудка цыплят для идентификации кишечных инфекций
С.В. Ларионов, доктор ветеринарных наук, член-корреспондент РАСХН,
С.В. Акчурин, кандидат ветеринарных наук
ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»
Ключевые слова: белки, гистопрепараты стенки железистого желудка, клебсиеллез, нуклеиновые кислоты, эшерихиоз, сальмонеллез, спектральный анализ, цътлята, «Stains all»
Сокращения: НК — нуклеиновые кислоты
Введение
Для диагностики различных патологических процессов в биологии и медицине широко используют люминесцентно-микроскопический метод, который характеризуется высокой чувствительностью и позволяет выявлять детальную картину микроскопических изменений при полном сохранении всех морфологических структур клеток и тканей. Уникальные возможности люминесцентной микроскопии были использованы в ветеринарной медицине для диагностики микроспории и бешенства животных [4, 5]. Однако, визуально обнаруживаемая в этих случаях флуоресценция оценивается на основании субъективного восприятия цветового оттенка ее светового потока, что в значительной степени снижает диагностическую значимость предлагаемого метода исследования.
Чтобы повысить достоверность интерпретации результатов, был разработан метод микроспектрально-го люминесцентного анализа, который обеспечивает объективную регистрацию и оценку полученных данных [3]. Суть метода состоит в следующем: изучая гистологические срезы железистого желудка, флуоро-хромированные люминесцентным метахроматическим красителем «Stains All», регистрируют внутриклеточные изменения соотношения НК и белков. Поскольку указанные соединения служат основными индикаторами функционального состояния клеток, то по динамике их соотношения можно судить и об их функциональной активности. Посредством разработанного метода удается обнаруживать ранние биохимические сдвиги, которые развиваются в клетках до появления характерной клинической и патоморфологической картины воспалительного процесса. Данное обстоятельство приобретает особое значение, если речь идет о диагностике и дифференциальной диагностике заболеваний, приводящих к гибели животных в короткие сроки. К числу таких болезней птиц относят острые желудочно-кишечные инфекции бактериальной этиологии — эшерихиоз, сальмонеллез и клеб-сиеллез, которые представляют серьезную угрозу для
птицеводческих хозяйств из-за массовой гибели поголовья. Следует полагать, что установленные особенности функционального состояния клеток железистого желудка — первой мишени на пути проникновения возбудителей кишечных инфекций в организм птиц, могут быть использованы для дифференциальной диагностики болезней.
В ранее опубликованных работах были раскрыты вопросы функционального состояния клеток слизистой оболочки [1, 2]. В настоящей статье приведены результаты исследования функционального состояния клеток серозной оболочки.
Цель исследования
Оценить функциональное состояние клеток слизистой и серозной оболочек железистого желудка методом люминесцентного спектрального анализа при эшерихиозе, сальмонеллезе и клебсиеллезе птиц и разработать дифференциально-диагностические критерии для идентификации этих инфекций.
Материалы и методы
Исследования проводили на 750 цыплятах породы хайсекс коричневый, взятых из благополучного по инфекционным заболеваниям хозяйства. Цыплята были разделены на 4 группы: 3 опытные (по 200 цыплят) и 1 контрольная (150 цыплят). Цыплят опытных групп заражали на 2-е сутки их жизни пероральным путем с помощью шприца на 1 мл и иглы с булавовидной напайкой на конце. Цыплят I опытной группы инфицировали бактериями SаlmoneUa еnteritidis в разведении 200 млн кл/мл в заражающей дозе 0,2 мл/голову; цыплят II опытной группы — бактериями Escherichia coli в разведении 200 млн кл/мл в заражающей дозе
0,2 мл/голову; цыплят III опытной группы — бактериями Klebsiella pneumoniae в разведении 2,5 млрд кл/мл в заражающей дозе 0,4 мл/голову Цыплятам контрольной (IV) группы вводили физиологический раствор в объеме 0,4 мл/голову.
Гистологические препараты железистого желудка цыплят всех групп исследовали на 1-е, 2-е, 4-е, 5-е и 6-е сутки после заражения. Гистологические срезы толщиной 4...7 мкм изготавливали на микротоме «Mikrom HM450» (Германия) из парафиновых блоков кусочков железистого желудка, фиксированных в 10%-м нейтральном забуференном водном растворе формалина.
£
X
о
С.В. Ларионов, С.В. Акчурин
Общую картину микроскопических изменений изучали на гистологических препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином, люминесцентно-микроскопические характеристики — на гистопрепаратах, окрашенных 10-4 М спиртовым раствором «Stains All» по методике, разработанной применительно к гистологическим срезам. Спектры люминесценции получали с помощью универсального цветоанализатора микроскопа-спектрофотометра МСФУ-К. Объектом для исследования методом спектрального анализа служили клетки серозной оболочки железистого желудка цыплят. Величину интенсивности люминесценции регистрировали в синей (480 нм) и красной (630 нм) областях ее спектра, и по полученным данным определяли коэффициенты соотношений НК и белков в соответствии с разработанной методикой [3]. Статистический анализ результатов проводили по стандартным программам Microsoft Excel XP.
Результаты и обсуждение
При сравнительной визуальной оценке микроскопических изменений, обнаруженных в гистологических препаратах железистого желудка птиц с кишечной патологией, значимых идентификационных диагностических признаков не выявлено. В гистопрепаратах стенки железистого желудка цыплят контрольной группы патологические изменения отсутствовали.
В гистологических срезах стенки железистого желудка, окрашенных «Stains All», наблюдали своеобразную люминесцентно-микроскопическую картину, характеризующуюся сочетанием синего, зеленоватого и малиново-красного цветов с разной степенью интенсивности на различных его участках, отражающей особенности распределения НК и белков. При изучении люминесцентных спектральных характеристик, полученных с флуорохромированных гистопрепаратов, выявлена определенная закономерность в динамике интенсивности люминесценции клеток серозной оболочки.
У птиц, больных сальмонеллезом, интенсивность люминесценции увеличивалась как в синей, так и в красной областях ее спектра, на протяжении всего изучаемого периода времени (рис. 1). В 1-е сутки заболевания ее величина была минимальной, а на 6-е сутки достигала своего максимального значения, что могло быть следствием усиления функциональной активности клеток серозной оболочки в ответ на развитие воспалительного процесса.
Рис. 1. Спектры люминесценции клеток серозной оболочки железистого желудка цыплят I опытной группы в 1-е, 2-е, 4-е, 5-е и 6-е сутки после заражения
Иная картина наблюдалась в спектрах люминесценции клеток железистого желудка птиц, больных эшерихиозом (рис. 2). На 2-е сутки интенсивность люминесценции достигла самых низких значений, на 4-е она возрастала до самых высоких показателей, постепенно снижаясь на 5-е и 6-е сутки болезни.
Рис. 2. Спектры люминесценции клеток серозной оболочки железистого желудка цыплят II опытной группы в 1-е, 2-е, 4-е, 5-е и 6-е сутки после заражения
У птиц, больных клебсиеллезом, с 1-е по 4-е сутки заболевания отмечали постепенное возрастание интенсивности люминесценции (рис. 3), а на 5...6-е сутки — снижение.
Рис. 3. Спектры люминесценции клеток серозной оболочки железистого желудка цыплят III опытной группы в 1-е, 2-е, 4-е, 5-е и 6-е сутки после заражения
При анализе коэффициентов соотношений НК и белков (1480/1630) в клетках серозной оболочки железистого желудка птиц контрольной и опытных групп (рис. 4) установлено, что изменения данных показателей наблюдаются во всех группах кишечных инфекций, но являются неидентичными при разных ее видах и сроках. Динамика коэффициентов 1484/1630 у цыплят контрольной группы укладывалась в картину умеренного постепенного увеличения значений коэффициентов в исследуемый период, что могло быть следствием постепенного и опережающего увеличения 1480 относительно роста 1630 (рис. 4-ГУ). На кривых коэффициентов соотношений НК и белков в группе птиц, больных эшерихиозом и сальмонеллезом, наблюдали несколько пиков повышения их значений, причем их местоположение определялось видом кишечной инфекции. Так, у
Использование метода люминесцентного спектрального анализа клеток железистого желудка цыплят для идентификации кишечных инфекций
Рис. 4. Изменение показателей коэффициентов соотношений НК и белков (К) в клетках серозной оболочки железистого желудка цыплят контрольной (IV) и опытных групп (I — сальмонеллез,
II — эшерихиоз, III — клебсиеллез)
птиц, больных эшерихиозом и клебсиеллезом (рис. 4, II, III), наибольшее значение коэффициента I480/I630 отмечено на 4-е и 5-е сутки соответственно, а у птиц, больных сальмонеллезом (рис. 4, I), — на 1-е и 6-е сутки заболевания.
После статистической обработки полученных данных были установлены дифференциально-диагностические критерии, позволяющие идентифицировать эшерихиоз, сальмонеллез и клебсиеллез на ранних стадиях их развития (табл.).
Выводы
Проведенные исследования свидетельствуют, что метод люминесцентного спектрального анализа поз-
Библиография
1. Акчурин С.В. Изучение соотношений нуклеиновых кислот и белков в стенке железистого желудка цыплят люминисцент-номикроскопическим методом при экспериментальном колибак-териозе / Современные научно-практические достижения в ветеринарии: Сборник статей Всероссийской научно-практической конференции, 2012; 3: 5—10.
2. Акчурин С.В., Демкин Г.П., Салаутин В.В., Домницкий И.Ю. Изучение соотношений нуклеиновых кислот и белков в стенке железистого желудка цыплят при экспериментальном сальмонеллезе // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова, 2012; (3): 3—7.
Дифференциально-диагностические критерии идентификации кишечных инфекций в ранние сроки заболевания цыплят по результатам люминесцентного спектрального анализа клеток серозной оболочки железистого желудка
Г руппа Коэффициенты соотношений НК и белков в разные сроки после заражения
1-е сут 2-е сут 4-е сут 5-е сут 6-е сут
I (сальмонеллез) >3,63 2,23.2,85 2,17.2,38 >3,0 >3,22
II (эшерихиоз) 1,91...3,21 >3,26 >3,64 2,41.2,64 2,06.2,39
III (клебсиеллез) <1,21 <1,35 <1,97 <2,23 <1,7
IV (контроль) 1,42-1,67 1,67.1,85 2,61.3,12 2,79.2,9 2,74.3,01
воляет устанавливать зависимость функционального состояния клеток серозной оболочки железистого желудка цыплят от вида и сроков развития у них кишечных инфекций. Изменение функциональной активности клеток этой зоны отражается на динамике выявляемых с помощью данного метода коэффициентов соотношения НК и белков. С помощью разработанных на их основе дифференциально-диагностических критериев можно идентифицировать эшерихиоз, сальмонеллез и клебсиеллез в ранние сроки развития этих инфекций. Полученные данные могут оказаться полезными при формировании принципиально нового подхода к вопросу создания современных технологий диагностики, профилактики данных заболеваний, а также лечения птиц.
3. Акчурин С.В. Новый метод люминесцентного анализа соотношений нуклеиновых кислот и белков в серозной оболочке железистого желудка цыплят с использованием флуорохрома «Stains АН» // Вестник НГАУ, 2012; 1 (22): 72—78.
4. Метлин А.Е., Назаров Н.А., Рыбаков С.С., Михайлина Н.М., Груздев К.Н., Чепуркин А.В., Егоров А.А. Диагностика бешенства животных с использованием реакции иммунофлюоресценции // Ветеринария, 2006; 2: 20—23.
5. Ханис А.Ю. Вирулентные и люминесцентные свойства разных штаммов microsporum canis // Ветеринария, 2003; 2: 25—27.
Summary
S.V. Larionov, S.V. Akchurin. Differential Intestine Infection Identification in Chickens Using Spectral Luminescent Analysis of Serous Cuticle of Glandular Stomach. Using microspectral luminescent analysis of chickens serous cuticle cells of glandular stomach, characteristics of their functional state at colibacillosis, salmonellosis and klebsiellosis were determined and differential-diagnostic criteria were worked out. These criteria allow identification of the infections mentioned above at the early stages of their progress. Resulting data can be used for development of fundamentally new approach to the problem of creation of modern diagnostic technologies, preventive measures and treatment of the above mentioned diseases.
2012 РОССИЙСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ЖУРНАЛ
«Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные» — научно-практическое издание для специалистов в области ветеринарной медицины и биотехнологии.
Главный редактор — д-р вет. наук, профессор кафедры анатомии, физиологии и хирургии РУДН — С.А. Ягников
Издается с 2005 г. при поддержке Минсельхоза и Россельхознадзора, входит в Перечень ВАК ведущих рецензируемых научных журналов и изданий
Подписка на журнал осуществляется через редакцию и каталог Почта России. Издательский дом «Логос Пресс», 127055, Москва, а/я 9.
Http://logospress.ru, e-mail: info@logospress.ru, тел/факс: +7 (495) 220-4816.
РВЖ • СХЖ • № 3/2012
