CC BY
42
Использование микроспектрального метода для оценки функционального состояния клеток железистого желудка цыплят при кишечных инфекциях
С.В. Акчурин, к.в.н., Саратовский ГАУ
В настоящее время в биологии и медицине для диагностики и дифференциальной диагностики различных патологических процессов широко применяется люминесцентно -микроскопический метод, обладающий высокой специфичностью, чувствительностью и информативностью. Уникаль-
ные возможности люминесцентной микроскопии были использованы в ветеринарной медицине для диагностики вирулентности поражающих кожу и волосы грибов Ыкгозротш оатъ и бешенства животных [1, 2]. Однако визуально обнаруживаемую в этих случаях флуоресценцию авторы предлагали оценивать на основании субъективного восприятия цветового оттенка её светового потока, что в
значительной степени снижало диагностическую значимость предлагаемых методов исследования.
Для повышения достоверности интерпретации результатов в ветеринарной медицине был разработан метод микроспектрального люминесцентного анализа, который обеспечивает объективную регистрацию и соответственно оценку полученных данных. Данный метод позволяет выявлять внутриклеточные изменения соотношений нуклеиновых кислот (НК) и белков при изучении гистологических срезов железистого желудка цыплят, флуорохромированных люминесцентным метахроматическим красителем «Steins all» [3].
Возможность улавливать с помощью данного метода ранние биохимические сдвиги, которые развиваются в клетках до появления характерной клинической и патоморфологической картины воспалительного процесса, может играть решающую роль не только для диагностики, но и дифференциальной диагностики заболеваний в ранние сроки их развития.
До настоящего времени острые желудочнокишечные инфекции (эшерихиоз, сальмонеллёз и клебсиеллёз) представляют серьёзную угрозу для птицеводческих хозяйств из-за массовой гибели птиц. Их причиной являются, как правило, трудно диагностируемые патологические метаболические изменения, развивающиеся в клетках внутренних органов на начальных этапах заболевания, что затрудняет своевременную постановку правильного диагноза. Поскольку первой мишенью на пути проникновения возбудителей кишечных инфекций в организм птицы является слизистая оболочка железистого желудка, целью настоящей работы стала оценка функционального состояния эпителия её альвеолярных желёз методом люминесцентного спектрального анализа при эшерихиозе, сальмонеллёзе и клебсиеллёзе птиц.
Материал и методы исследования. Исследования проведены на 750 цыплятах породы хайсекс коричневый, взятых из благополучного по инфекционным заболеваниям хозяйства. Цыплята по принципу аналогов были разделены на четыре группы: три опытные (по 200 цыплят) и одна контрольная (150 цыплят). Заражение цыплят опытных групп проводили на вторые сутки их жизни пероральным путём с помощью однограммового шприца и иглы с булавовидной напайкой на конце. Цыплят I опытной гр. заражали бактериями Sаlmonella еnteritidis в разведении 200 млн бактериальных клеток в 1 мл в заражающей дозе 0,2 мл/гол. Цыплят II опытной гр. инфицировали бактериями Escherichia coli в разведении 200 млн бактериальных клеток в 1 мл в заражающей дозе 0,2 мл/гол, цыплят III опытной гр. — бактериями Кlebsiellapneumoniae в разведении 2,5 млрд бактериальных клеток в 1 мл в заражающей дозе 0,4 мл/гол. Цыплятам контрольной (IV) группы вводили физиологический раствор в объёме 0,4 мл/гол.
Убой птиц контрольной и опытных групп проводили на 1, 2, 4, 5 и 6-е сутки после заражения. Гистопрепараты толщиной 4—7 мкм изготавливали на микротоме «Mikrom HM450» (Германия) из парафиновых блоков кусочков железистого желудка, фиксированного в 10-процентном нейтральном забуференном водном растворе формалина.
Общую картину микроскопических изменений изучали на гистологических срезах, окрашенных гематоксилин-эозином, люминесцентномикроскопические характеристики — на гистопрепаратах, окрашенных 10-4М спиртовым раствором «Steins all» по методике, разработанной применительно к гистологическим срезам. Спектры люминесценции получали с помощью универсального цветоанализатора микроскопа-спектрофотометра МСФУ-К. Объектом для исследования методом спектрального анализа служил эпителий альвеолярных желёз слизистой оболочки железистого желудка цыплят. Величину интенсивности люминесценции регистрировали в синей (I ) и красной (I620) областях её спектра и по полученным данным определяли коэффициенты соотношений НК и белков в соответствии с разработанной методикой [3]. Статистический анализ результатов проводили по стандартным программам Microsoft Excel XP.
Результаты исследования. При сравнительной визуальной оценке микроскопических изменений, обнаруженных в гистологических препаратах железистого желудка птицы с кишечной патологией, значимых идентификационных диагностических признаков не выявлено. В гистопрепаратах стенки железистого желудка цыплят контрольной группы патологические изменения отсутствовали.
В окрашенных « Stems all» гистологических срезах стенки железистого желудка наблюдали своеобразную люминесцентно-микроскопическую картину, характеризующуюся сочетанием синего, зеленоватого и малиново-красного цветов с разной степенью интенсивности на различных его участках, отражающую особенности распределения НК и белков. При изучении люминесцентных спектральных характеристик, полученных с флуорохромированных гистопрепаратов, выявлена определённая закономерность в динамике интенсивности люминесценции эпителия альвеолярных желёз (рис. 1—3). Так, у цыплят, больных сальмонеллёзом, в течение изучаемого периода интенсивность люминесценции данных клеток постепенно усиливалась как в синей (I ), так и в красной (I62g) области её спектра (рис. 1). В 1-е сутки заболевания её величина была минимальной, а на 6-е сутки достигала своего максимального значения. Это, вероятнее всего, является следствием усиления функциональной активности эпителиальных клеток в ответ на развитие воспалительного процесса.
Иная картина наблюдалась в спектрах люминесценции клеток железистого желудка птиц, больных эшерихиозом (рис. 2). На 2-е сутки вели-
In
X, нм
Рис. 1 - Спектры люминесценции клеток эпителия альвеолярных желёз слизистой оболочки железистого желудка цыплят I опытной группы в первые (1), вторые (2), четвёртые (4), пятые (5) и шестые (6) сутки после заражения. Гистологические срезы. Окраска «Stains all». По оси ординат - интенсивность люминесценции (In), по оси абсцисс - длина волны (А,, нм)
X, нм
Рис. 2 - Спектры люминесценции клеток эпителия альвеолярных желёз слизистой оболочки железистого желудка цыплят II опытной группы в первые (1), вторые (2), четвёртые (4), пятые (5) и шестые (6) сутки после заражения. Гистологические срезы. Окраска <^а^ all». По оси ординат - интенсивность люминесценции (In), по оси абсцисс - длина волны (А, нм)
чина 1484 и I62() снижалась, на 4-е сутки — несколько возрастала, а на 5-е сутки вновь снижалась, достигая наименьших значений. На 6-е сутки интенсивность люминесценции резко возрастала и имела самое высокое значение. Указанные изменения свидетельствуют о различном функциональном состоянии эпителия альвеолярных желёз в разные сроки развития эшерихиоза.
У цыплят, больных клебсиеллёзом, с 1-х по 4-е сутки заболевания отмечали постепенное возрастание 1484 и I К 4-м суткам их значения становились максимальными, что являлось следствием наибольшей функциональной активности эпителиальных клеток (рис. 3). На 5-е сутки интенсивность люминесценции как в синей, так и в красной част и спектра несколько снижалась, а к 6-м суткам уменьшалась настолько, что значения её были ниже, чем в 1-е сутки развития инфекционного процесса. Это свидетельствует о резком снижении функциональной активности эпителия альвеолярных желёз к 6-м суткам заболевания.
Увеличение/уменьшение 1484 по сравнению с ростом/снижением 162д в эпителиальных клетках зависит не только от видов кишечных инфекций,
но и сроков их развития. Данное обстоятельство нашло отражение в динамике изменений показателей коэффициентов соотношений НК и белков у птиц контрольной и опытных групп (рис. 4). На рисунке 4 видно, что динамика коэффициентов 184/1200 у цыплят контрольной группы укладывалась в картину умеренного постепенного увеличения значений коэффициентов в исследуемый период, что могло быть следствием постепенного и опережающего увеличения 1884 относительно роста 1200 (рис. 4, IV). На кривых коэффициентов соотношений НК и белков в группе птиц, больных эшерихиозом и сальмонеллёзом, отмечалось несколько пиков повышения их значений, причём их местоположение определялось видом кишечной инфекции. Так, у цыплят, больных эшерихиозом (рис. 4, II), высокое значение коэффициента 1884/I наблюдалось на 2-е и 5-е, у больных сальмонеллёзом (рис. 4, I), — на 1-е и 4-е, у больных клебсиеллёзом (рис. 4, III) — на 1, 4 и 6-е сутки заболевания.
После статистической обработки полученных данных были получены дифференциальнодиагностические критерии оценки функционального состояния эпителия альвеолярных желёз
X, нм
Рис. 3 - Спектры люминесценции клеток эпителия альвеолярных желёз слизистой оболочки железистого желудка цыплят III опытной группы в первые (1), вторые (2), четвёртые (4), пятые (5) и шестые (6) сутки после заражения. Гистологические срезы. Окраска «Stmns all». По оси ординат - интенсивность люминесценции (In), по оси абсцисс - длина волны (А, нм)
К
Рис. 4 - Изменение показателей коэффициентов соотношений НК и белков (К) в клетках эпителия альвеолярных желёз слизистой оболочки железистого желудка цыплят контрольной (IV) и опытных групп (I - сальмонеллёз, II - эшерихиоз, III - клебсиеллёз). По оси ординат - коэффициенты соотношений нуклеиновых кислот и белков (К), по оси абсцисс - сутки после заражения (сут.)
Дифференциально-диагностические критерии оценки функционального состояния эпителия альвеолярных желёз слизистой оболочки железистого желудка цыплят при эшерихиозе, сальмонеллёзе и клебсиеллёзе
Группа Коэффициенты соотношений НК и белков (К) в 1-6-е сутки после заражения
1 2 4 5 6
I (сальмонеллёз) II (эшерихиоз) III (клебсиеллёз) IV (контроль) >3,34 2,21-2,47 2,72-3,01 <2,13 2,43-2,51 >2,69 <1,93 2,03-2,12 2,72-2,97 2,47-2,53 >3,24 <2,23 <2,0 >3,14 2,19-2,32 2,51-2,78 <2,26 2,82-3,04 >3,24 2,45-2,61
слизистой оболочки железистого желудка цыплят при эшерихиозе, сальмонеллёзе и клебсиеллёзе на ранних стадиях их развития (табл.).
Выводы. Проведённые исследования показали, что с помощью метода люминесцентного спектрального анализа эпителия альвеолярных желёз слизистой оболочки железистого желудка цыплят можно оценить функциональное состояние этих клеток. Установлена зависимость степени функциональной активности эпителиальных клеток от вида и сроков развития кишечных инфекций у цыплят. Выявлено, что изменение функциональной активности клеток данной зоны отражается на динамике выявляемых с помощью использованного метода коэффициентов соотношений НК и белков.
Полученные дифференциально-диагностические критерии могут оказаться полезными при формировании принципиально нового подхода к вопросу создания современных технологий диагностики и профилактики указанных заболеваний, а также лечения птицы.
Литература
1. Метлин А.Е., Назаров Н.А., Рыбаков С.С. и др. Диагностика бешенства животных с использованием реакции иммунофлюоресценции // Ветеринария. 2006. № 2. С. 20—23.
2. Ханис А.Ю. Вирулентные и люминесцентные свойства разных штаммов microsporum canis // Ветеринария. 2003. № 2. С. 25-27.
3. Акчурин С.В. Ларионов С.В. Новый метод люминесцентного спектрального анализа клеток железистого желудка цыплят с использованием флуорохрома «81ат$ all» // Ученые записки КГАВМ. 2013. Т. 213. С. 6-11.
