CC BY
12
УДК 577.3
Ключевые слова: нуклеиновые кислоты, белки, гистопрепараты, спектральный анализ
Key words: nucleic acids, proteins, tissue specimens, spectroscopic analysis
Акчурин С. В.
оценка функционального СОСТОЯНИЯ КЛЕТОК ЖЕЛЕЗИСТОГО ЖЕЛУДКА цыплят при кишечных инфекциях
functional status evaluation of glandular stomach cells in chickens atenteroidea
ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова» Адрес: 410012, Россия, г. Саратов, Театральная пл., 1
N. I. vavilov saratov state Agrarian university Address: 410012, Russia, saratov, Teatralnaya squre, 1
Акчурин Сергей Владимирович, к. в. н., доцент каф. морфологии, патологии животных и биологии
Akchurin sergey v., Ph.D. in veterinary science, Associate Professor at the Dept. of Morphology, Animal Pathology and Biology
Аннотация. Методом люминесцентного спектрального анализа установлены особенности функционального состояния клеток междольковой соединительной ткани подслизистой основы железистого желудка цыплят при эшерихиозе, сальмонеллезе и клебсиеллезе. Полученные результаты могут быть приняты во внимание при разработке принципиально нового подхода к вопросу создания современных технологий диагностики, профилактики и лечения указанных заболеваний.
Summary. The spectroscopic analysis of interlobular connective-tissue cells of submucous layer of chickens' glandular stomach identified features of these cells' functional status at colibacillosis, salmonellosis and klebsiellosis at early stages. The results can be used in development of fundamentally new approach to elaboration of modern technologies of diagnostics, prophylaxis and treatment of the above-mentioned diseases.
Введение
Острые желудочно-кишечные инфекции бактериальной этиологии (эшерихиоз, сальмонеллез, клебсиеллез) до настоящего времени представляют серьезную угрозу промышленному птицеводству, поскольку сопровождаются массовым падежом птицы. Их гибель наступает, как правило, в ранние сроки заболевания, когда инфекционный процесс еще не достиг характерной для каждого вида заболевания патоморфологиче-ской и клинической картины. Проведение своевременной диагностики заболеваний в эти сроки представляет значительные затруднения, поскольку причиной смерти птиц становятся глубокие патологические метаболические изменения в клетках, выявление которых требует использования высокочувствительных методов исследования. Эту проблему можно решить с помощью люминесцентного спектрального анализа, позволяющего изучать биохимические процессы, обеспечивающие внутриклеточную регуляцию обмена веществ и энергии [2]. Достоин-
ством данного метода является способность улавливать тонкие изменения в структуре молекул, входящих в состав функциональных механизмов клетки. Особенности физико-химических реакций, составляющих основу биологической функции клетки, выявляются с помощью регистрации изменений спектральных характеристик, которые отражают протекающие в ней биохимические сдвиги. С учетом этих возможностей для изучения функциональной активности клеток железистого желудка цыплят разработан метод микроспектрального анализа с применением люминесцентного метахроматического красителя '^а^ all" [1]. С помощью данного метода устанавливают соотношения нуклеиновых кислот (НК) и белков, играющих ведущую роль в изменении функционального состояния клеток и ее органоидов. Динамику соотношения этих веществ определяют по изменению их спектральных характеристик.
Поскольку первой мишенью на пути проникновения возбудителей кишечных инфекций (эшерихиоза, сальмонеллеза и клебсиел-
леза) в организм птиц является слизистая оболочка железистого желудка, целью настоящей работы была оценка функционального состояния клеток междольковой соединительной ткани подслизистой основы методом люминесцентного спектрального анализа в ранние сроки развития указанных заболеваний.
Материалы и методы
Исследования проведены на 350 цыплятах породы хайсекс коричневый, взятых из благополучного по инфекционным заболеваниям хозяйства. Цыплята были разделены на 4 группы: 3 опытные (по 100 цыплят) и 1 контрольная (50 цыплят). Заражение цыплят опытных групп проводили на 2 сутки их жизни пероральным путем с помощью однограммового шприца и иглы с булавовидным концом. Цыплят I опытной группы инфицировали бактериями Escherichia coli в разведении 200 млн бактериальных клеток в 1 мл в заражающей дозе 0,2 мл/голову. Цыплят II опытной группы - бактериями Sаlmonella еnteritidis в разведении 200 млн бактериальных клеток в 1 мл в заражающей дозе 0,2 мл/голову. Цыплят III опытной группы - бактериями Klebsiella pneumoniae в разведении 2,5 млрд бактериальных клеток в 1 мл в заражающей дозе 0,4 мл/голову. Цыплятам контрольной (IV) группы вводили физиологический раствор в объеме 0,4 мл/ голову.
Гистологические срезы железистого желудка цыплят контрольной и опытных групп исследовали на 3, 4, 6, 7 и 8 сутки их жизни, т. е. на 1, 2, 4, 5 и 6 сутки с момента заражения. Микропрепараты толщиной 4-7 мкм изготавливали на микротоме "Reichart Wien" (Германия) из парафиновых блоков кусочков железистого желудка, фиксированного в 10 % нейтральном забуференном водном растворе формалина.
Общую картину микроскопических изменений изучали на гистологических препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином по общепринятой методике, люминесцентноми-кроскопические характеристики - на гисто-препаратах, окрашенных 10-4 М спиртовым раствором "Steins all" по методике, разрабо-
танной применительно к гистологическим срезам. Спектры люминесценции получали с помощью универсального цветоанализато-ра микроскопа-спектрофотометра МСФУ-К. Объектом для исследования методом спектрального анализа служили клетки междольковой соединительной ткани подслизистой основы железистого желудка цыплят. Регистрировали величину интенсивности люминесценции в синей (I ) и красной (I ) областях ее спектра, и по полученным данным определяли коэффициенты соотношений НК и белков в соответствии с разработанной методикой [1]. Статистический анализ результатов проводили по стандартным программам Microsoft Excel XP.
Результаты и обсуждение
В 1 сутки с момента заражения у цыплят всех опытных групп выявляли расстройство кровообращения (отек и кровоизлияния) и дистрофические изменения в клетках покровного эпителия и железистых структурах слизистой оболочки. Признаки отека в виде разволокнения и разрыхления соединительнотканных структур наблюдали в серозной оболочке, собственной пластинке и подсли-зистой основе слизистой оболочки, а также в соединительной ткани, окружающей ее глубокие железы. В слизистой оболочке железистого желудка цыплят III опытной группы отмечали единичные мелкие перива-скулярные кровоизлияния. В последующие сутки отмечали нарастание отека, достигшего своего максимума на 6 сутки развития заболевания. К этому времени у цыплят III опытной группы, помимо отека, выявляли множественные, различной формы и величины кровоизлияния, а также дилятацию сосудов и явление стаза эритроцитов в просвете некоторых артериол слизистой оболочки. В гистопрепаратах стенки железистого желудка цыплят контрольной группы патологические изменения отсутствовали на протяжении всего эксперимента. При сравнительной визуальной оценке микроскопических изменений, обнаруженных в железистом желудке птиц, не было выявлено каких-либо идентификационных признаков, позволяющих проводить дифференциальную диагностику
Рис. 1. Спектры люминесценции клеток междоль-ковой соединительной ткани подслизистой основы железистого желудка цыплят I опытной группы в первые (1), вторые (2), четвертые (4), пятые (5) и шестые сутки (6) после заражения. Гистологические срезы. Окраска "Stains all". По оси ординат - интенсивность люминесценции (In), по оси абсцесс -длина волны (X, нм).
Рис. 2. Спектры люминесценции клеток междоль-ковой соединительной ткани подслизистой основы железистого желудка цыплят II опытной группы в первые (1), вторые (2), четвертые (4), пятые (5) и шестые сутки (6) после заражения. Гистологические срезы. Окраска "Stains all". По оси ординат - интенсивность люминесценции (In), по оси абсцесс -длина волны (X, нм).
X, нм
Рис. 3. Спектры люминесценции клеток междоль-ковой соединительной ткани подслизистой основы железистого желудка цыплят III опытной группы в первые (1), вторые (2), четвертые (4), пятые (5) и шестые сутки (6) после заражения. Гистологические срезы. Окраска "Stains all". По оси ординат - интенсивность люминесценции (In), по оси абсцесс -длина волны (X, нм).
эшерихиоза, сальмонеллеза и клебсиеллеза в ранние сроки их развития.
В окрашенных '^а^ all" гистологических срезах стенки железистого желудка
fpttmt* I сут Зсуг * СП 54fr &еут
Рис. 4. Изменение показателей коэффициентов соотношений нуклеиновых кислот и белков (К) в клетках междольковой соединительной ткани подслизистой основы железистого желудка цыплят контрольной (IV) и опытных групп (I - эшерихиоз, II - сальмонел-лез, III - клебсиеллез). По оси ординат - коэффициенты соотношений нуклеиновых кислот и белков (К), по оси абсцесс - сутки жизни после заражения (сут).
наблюдали своеобразную люминесцентно-микроскопическую картину, характеризующуюся сочетанием синего, зеленоватого и малиново-красного цветов с разной степенью интенсивности на различных участках, отражающую особенности распределения НК и белков. При изучении люминесцентных спектральных характеристик, полученных с флуорохромированных гистопрепара-тов, выявили определенную закономерность в динамике интенсивности люминесценции клеток междольковой соединительной ткани подслизистой основы (рис. 1-3). Увеличение/уменьшение !480 по сравнению с ростом/ снижением !620 было характерно для разных видов кишечных инфекций и разных сроков их развития (рис. 1-3). Максимальное значение интенсивности люминесценции как в синей (!480), так и в красной (Г620) областях ее спектра было отмечено на 6 сутки болезни птиц всех опытных групп, что может быть следствием наибольшей функциональной активности клеток данной зоны.
При изучении динамики изменений коэффициентов соотношений НК и белков (!480/!620) в клетках междольковой соединительной ткани подслизистой основы железистого желудка птиц контрольной и опытных групп была выявлена определенная закономерность (рис. 4). Динамика коэффициентов у цыплят контрольной группы укладывалась в картину умеренного постепенного увеличения значений коэффициентов в исследуемый период, что может быть следствием постепенного и опережающего увели-
Таблица 1.
Коэффициенты соотношений нуклеиновых кислот и белков в клетках междольковой соединительной ткани подслизистой основы железистого желудка цыплят опытной и контрольной групп
Группа Время после заражения, сутки
1 2 4 5 6
I (эшерихиоз) 3,25-3,56 > 3,65 2,99-3,23 > 4,57 3,56-3,78
II (сальмонеллез) > 3,86 3,35-3,01 > 3,44 3,94-4,27 > 5,59
III (клебсиеллез) < 2,43 < 1,6 < 2,27 3,42-3,67 4,22-5,01
IV (контроль) 2,63-2,91 1,92-2,85 2,51-2,86 < 3,12 < 3,25
чения 1480 относительно роста 1620 (рис. 4, IV). На кривых коэффициентов соотношений НК и белков в группе птиц, больных эшерихио-зом и сальмонеллезом, отмечалось несколько пиков повышения их значений, причем их расположение определялось видом кишечной инфекции. Так, для птиц, больных эшерихиозом (рис. 4, I), наибольшее значение коэффициента наблюдали на 2 и 5 сутки болезни, а для птиц, больных сальмонелле-зом (рис. 4, II), - на 1 и 6 сутки. У птиц, зараженных клебсиеллезом (рис. 4, III), после выраженного падения коэффициента !480Я620 на 2 сутки отмечали постепенный рост его значений, включая 6 сутки болезни.
Из этого следует, что возбудители кишечных инфекций по-разному влияют на функциональное состояние клеток междольковой соединительной ткани подслизистой основы железистого желудка цыплят, что находит отражение в динамике изменений коэффициентов соотношений НК и белков (табл. 1).
Заключение
Исследования показали, что метод люминесцентного спектрального анализа позволяет установить изменение функционального
состояния клеток междольковой соединительной ткани подслизистой основы железистого желудка цыплят при различных видах и сроках развития кишечных инфекций. Изменение функциональной активности клеток междольковой соединительной ткани отражается на динамике выявляемых с помощью данного метода коэффициентов соотношений соотношения НК и белков. Полученные данные могут оказаться полезными при формировании принципиально нового подхода к вопросу создания современных технологий диагностики, профилактики данных заболеваний, а также лечения птиц.
Список литературы
1. Акчурин, С. В. Анализ соотношений нуклеиновых кислот и белков в стенке железистого желудка цыплят методом люминесцентного спектрального анализа с использованием флуорохрома "Stains all" / С. В. Акчурин, С. В. Ларионов // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н. И. Вавилова. -2012. - № 02. - С. 3-7.
2. Карнаухов, В. Н. Люминесцентный анализ клеток [Электронный ресурс] : учебное пособие / В. Н. Карнаухов. - Пущино : Аналитическая микроскопия. - 2002. - Режим доступа : http:cam.psn. ru : Р. В. Гуркин, свободный. - Загл. с экрана. - № гос. регистрации 6072 от 4 февраля 2002 г.
Подпишись на рассылку новостей Института Ветеринарной Биологии для специалистов, чтобы первым узнать о новых учебных программах, методических разработках в области диагностики и лечения мелких домашних животных: www.invetbio.spb.ru/subscribe.htm
