CC BY
15
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro Ha^OHaibHoro ymBepcurery BeTepHHapHOi MegnuUHH Ta 6i0TexH0iroriH iMeHi C.3. f^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyj
doi: 10.15421/nvlvet7422
ISSN 2519-2698 print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
УДК 57.082.1::591.463.1
xx •• • • • ^ •• • •
Hqbi шдходи щодо оц1нки якост! генетичного матертлу оугат-плвдникт
1нститут тваринництва НААН, вул.7-о1 Гвардшсъког Армп, 3, смт Кулиничi, Харювсъкийр-н, Хартесъка обл., 62404, Украша
Запропоновано модертзований метод оцтки якостг сперми бугагв. Встановлено, що обробка сперми з використанням градгентгв щыъностг сприяе тдвищенню показниюв рухливостг, виживаностг та абсолютног виживаностг як у свгжих зразках, так i в заморожено-вгдталш спермг, що дае можливктъ быъш об'ективно охарактеризувати яюстъ бгоматерга-лу. Запропоноват новi характеристики спермограм бугагв: «виживашстъ потенцшно-фертилъног фракцп сперми», «пока-зник абсолютног виживаностi потенцшно-фертилъног фракцп сперми» можутъ стати важливими критерiями оцтки еякулятiв бугагв. Наведено резулътати до^дженъ показниюв бiологiчноi якостi сперми буга1в сименталъсъког Украгнсъког чорно-рябог молочног та червоно-рябог голштинсъког породи залежно вiд методу обробки проб.
Потенцшно-фертилъна фракцiя як свiжоотриманоi, так i заморожено^дталог сперми, суттево вiдрiзняетъся за рядом бiологiчних вiд середтх показниюв сперми, що робитъ необхiдним введення в показники спермограми додаткових характеристик. Показник виживаностi потенцшно-фертилъног фракцп заморожено^дталог сперми тдвищився майже на 3 год, або на 32,8 %. Показник абсолютног виживаностi потенцшно-фертилъног фракцп тдвищився на 8,19 умов.одн.
Ключовi слова: бугаг, глибокозаморожена сперма, деконсерваця, рухливктъ, виживашстъ, потенцшно-фертилъна фракця.
Институт животноводства НААН, ул. 7-й Гвардейской Армии, 3, пгт Кулиничи, Харьковский р-н, Харьковская обл., 62404, Украина
Предложено модернизированный метод оценки качества спермы быков. Установлено, что обработка спермы с использованием градиентов плотности превышает показатели активности, выживаемости и абсолютной выживаемости как у свежеполученных образцах, так и в заморожено-оттаянной спермы, что дает возможность более объективно охарактеризовать качество биоматериала. Приведены результаты исследований биологического качества спермы быков симментальской черно-пестрой и красно-пестрой голштинской породы в зависимости от метода обработки проб.
Потенциально фертильная фракция как свежополученной так и заморожено-оттаявшей спермы, существенно отличается по ряду биологических средних показателей спермы, что делает необходимым введение в показатели спермограм-мы дополнительных характеристик. Показатель выживаемости потенциально фертильной фракции заморожено-оттаявшей спермы повысился почти на 3 часа, или на 32,8%. Показатель абсолютной выживаемости потенциально фертильной фракции повысился на 8,19 усл. ед.
Ключевые слова: быки, свежеполученная сперма, глубокозамороженная сперма, деконсервация, активность, выживаемость, потенциально-фертильная фракция.
Citation:
Savelieva, M., Suchko, A. (2017). New approaches to the assessment of the quality of genetic material bulls. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 19(74), 99-102.
М.С. Савельева, О.Б. Сушко [email protected]
Новые подходы к оценке качества генетического материала
быков-производителей
М.С. Савельева, А.Б. Сушко [email protected]
New approaches to the assessment of the quality of genetic material bulls
M. Savelieva, A. Suchko [email protected]
Institute of animal science NAAS, 7th Guards Army Str., 3, village Kulinich, Kharkov district, Kharkov region, 362404, Ukraine
On the first stage experiments are conducted by the aim of establishment on how many higher the real indexes offresh sperm and dilute protective environments after moving away of cellular debris, extraneous cages and dead cages. On the second stage, comparison of basic physiological indexes of the fertilization faction got from deconservation sperm and compared to the corresponding indexes of 3 sperm was conducted, that was not subject to the special cleansing procedure. Difference between research and control groups, in relation to survivability of sperm and index of absolute survivability of sperm was statistically reliable (P < 0,001), as for fresh sperm so for sperm, that carried freezing and thawing in liquid nitrogen. Faction of sperm, that has impregnating ability potentially, as fresh sperm so that was subject to freezing and thawing substantially differ in the row of biological indexes of sperm, that creates the necessity of introduction of new additional descriptions for the analysis of sperm. Index of survivability of sperm, that potentially has impregnating ability at deconservation sperm rose on three hours or on a 32,8 percent's . Index of absolute survivability of sperm, that potentially has impregnating ability rose on 8,19 conditional units.
The modernized method of estimation of quality of sperm of bulls is offered. It is set that treatment of sperm with the use of gradients of closeness exceeds the indexes of activity, to survivability and absolute survivability as at fresh standards of sperm so at deconservation standards of sperm, that gives an opportunity more objectively to describe quality of sperm. Results over of researches of biological quality of sperm of bulls of meat blackly-pied and red-pied suckling breed are brought depending on the method of treatment of tests. Additional descriptions of analysis sperm are entered, they can become the major criteria of estimation of full value and impregnating ability.
Key words: bulls, freshly prepared sperm, sperm Deep, Depreserve, activity, survival.
Вступ
Ефективне використання плщнишв визначаеться числом одержаного вщ них приплоду. Однак оцшка ввдтворювально! здатносп буга!в дуже складна i не завжди достатньо об'ективна, осшльки на заплщне-шсть маток можуть впливати, о^м якосп сперми, безлiч шших чиннишв, не пов'язаних iз самим плщ-ником. Оцшка буга!в за яшстю !хньо! сперми достатньо швидка.. Загальновiдомi методи дослвджень грун-туються на визначенш числа спермив в еякулят (Sherhyn, 1967; Мшгеа^, 1999), !х виживаносп (GOST 26030-83, 1984; DSTU 3535-97, 1998), актив-носп окремих ферменпв (Р1оЫшку, 1970; Ostashko, 1990) тощо.
Актуальшсть теми: на сьогодш основним методом оцшки бюлопчно! якосп сперми буга!в е ство-рення спермограм, що будуються на визначенш голо-вних фiзiологiчних показнишв, таких як рухливють, виживашсть, абсолютний показник виживаносп, концентрация спермив. Причому це стосуеться як свiжо-розбавлено!, так i деконсервовано! сперми плщнишв. Водночас варто ввдмггити, що на щ показники (^м концентраций можуть суттево впливати рядй сторонш фактори. Зокрема виживашсть живих спермив еяку-ляту може значною мiрою залежати вщ наявносп й кшькосп в середовищi мертвих спермив та шших стороншх включень.
Вивчення питания обробки сперми велико! рогато! худоби перед И технолопчною загопвлею та шсля деконсерваци е актуальним завданням.
Мета I завдання досл1дження. В зв'язку з цим нами розроблявся метод оцшки бюлопчно! якосп сперми, що передбачае поряд iз традицшними показника-ми - визначити виживашсть та iншi бюлопчш показники для !! активно! частини. Тобто тiе! функцюна-льно! частки, яка в подальшому i е вирiшальною,
щодо процесу заплiднення, або, iHaKme кажучи, е потенцiйно-фертильною фрaкцiею.
Матерiал i методи дослщжень
Роботи проводились на 6a3i племiнного шдприем-ства в 1нституп тваринництва НААН за використання буга!в-плщник1в симентальсько!, Укра!нсько! чорно-рябо! молочно! та червоно-рябо! голштинсько! породи. Сперму отримували 1-2 рази на тиждень, по 2 еякуляти з штервалом мгж садками 10-15 хвилин. Отриманий еякулят оцiнювaли органолептично Узуально) на нaявнiсть у спермi кровi, сечi, гною, що е критерiем вибраковування еякуляту. Для визначення рухливостi сперми вiдбирaли зразок та визначали пiд мiкроскопом при збшьшенш в 120-180 раз. Визначення показника концентрацп сперми проводили за допомогою приладу КФК-2. Сперму ввдбирали з кон-центрaцiю не менше шж 0,7 млрд/мл.
1снуе кшька методик видiлення активно! фрaкцi!' сперми, серед яких нами обрано метод центрифугу-вання бiомaтерiaлу у двошаровому грaдiентi як тех-нологiчний сучасний метод (Sherhyn, 1967; Mursalov, 1999).
На першому еташ проведено експерименти з метою встановлення - наскшьки вищi реальш показники свiжо! i розбавлено! захисним середовищем сперми пiсля видалення так званого дебрюа (cellular debris) стороншх i мертвих клiтин.
На другому еташ було здшснено порiвняльне визначення основних фiзiологiчних показник1в потен-цiйно-фертильно!' фрaкцi!, отримано! з деконсервова-но! сперми та порiвняно з ввдповвдними показниками бiомaтерiaлу, що не шддавався спецiaльнiй очищува-льнiй процедура
Окрiм того, нaявнiсть бaктерiй в еякуляп може впливати на заплщнювальну здaтнiсть та призводити
до зниження рухливостi та передчасно! акросомно! реакци. Важливо використовувати таку технологiчну обробку сперми, яка б дозволяла вщбирати нормальнi, активнi сперми з загально! маси в еякулятг
У дослiдах було використано гpадieнти щiльностi SpermGradient (COOK Medical Ukrainian Representative), що являють собою iзотонiчний збала-нсований фiзiологiчний соляний буферний розчин, який мае у своему склащ покрип сiланом коловдт частки кремнiю. При проведенi експериментiв засто-совували метод «роздшених еякуляпв».
Роздшення сперми на фракцii засновано на тому, що зрш сперми мають бiлыпу щiльнiсть ДНК, шж 80% розчин гращенту, тому, проходячи с^зь нього, осiдають на днi пробiрки. Для отримання потенцшно-фертильно! фракцй свiжорозбавлену або деконсерво-вану сперму тддавали центрифугацii' при 800 g у двошаровому градiентi щiльностi протягом 10 хвилин (дослiдна група). Шсля цього видаляли надосадову рiдину та додавали середовище для розрiдження i крiоконсервування сперми буга!в. Вдруге проводили центрифугування сперми протягом 10 хв i знову видаляли надосадову редину. Визначали рухливiсть та концентрацш сперми пiд мiкроскопом згiдно з ДСТУ 3535-97 «Сперма буга!в нативна» (Ostashko, 1990).
Пiсля другого центрифугування сперму розрвджу-вали середовищем для заморожування за регламентом Харкiвськоi технологii асептичного отримання сперми бугш'в-плщнишв (Plohinskij, 1970). Пiсля заморо-жування та крюзбери'ання сперми проводили ii деко-нсервацiю за температури 38 °С та центрифугували один раз у градiентi щiльностi для видалення некрю-
Таблиця.1
Порiвняльнi фшолопчш показники потенщально-фертильно'1 (фракцй св1жоотримано! сперми (n = 18)
резистентних статевих клггин. Таким чином шсля розморожування отримували найбшьш активнi -придатнi до заплвднення сперми.
Перевiрку деконсервованих зразкiв сперми, яка попередньо зберталась у зрщженому азотi, проводили з використанням вiзуального методу та ГОСТ 26030-83. «Сперма быков замороженная».
Результати дослщжень опрацьовували методом варiацiйноi статистики на основi розрахунку серед-ньо! арифметичноi (M), вiдхилення показникiв серед-ньоi арифметично!, похибки (m). Для визначення рiвня достовiрностi (Р) використано значення крите-рiю вiрогiдностi за Стьюдентом при трьох рiвнях: * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001, яш мають величину середньоi арифметичноi похибки, що дослщжу-ються при малш та великiй кшькосп об'ектiв.
В процесi експериментiв було задiяно 27 еякулятiв вiд бугш'в-плщнишв.
Результати та ix обговорення
Порiвняно з традицiйним методом обробки сперми було зафжсовано вiдсутнiсть епiтелiальних клггини, суттеве зменшення неактивних та пошкоджених спе-рмпв, якi можуть негативно впливати на яшсш показники сперми, знижуючи точнiсть оцiнки. Метод показав, що при центрифугуванш рiзнi клiтини займають вiдповiдне положення, в якому !х плавуча щшьшсть вiдповiдае щiльностi градiенту. Результати порiвня-льно! оцiнки фiзiологiчних показникiв потенщально-фертильно! фракцй' свiжорозбавленоi сперми буга'в наведено у таблицi 1.
Показники бюлопчно! якост сперми Потенцiйно-фертильна фракщя свiжорозбавленоl сперми (дослщ) Свiжорозбавлена сперма (контроль)
Рухливють, бали (%) 9,02 ± 0,06 (90,2% ± 0,6%) 7,52 ± 0,04 (75,2% ± 0,4%)
Виживашсть (годин) 21,62 ± 2,80* 12,0 ± 1,50
Показник абсолютно! виживаност (Sa,умовн.одн.) 123,2 ± 4,70* 81,53 ± 4,87
1з наведених даних бачимо, що виживашсть сперми при ii шкубуванш за температури 38 °С шсля видалення дербку складала 21,62 год, тобто була на 9,62 год бшьшою.
Термш виживаностi отримано! потенцшно-фертильно! фракцй був у 1,75 раза бшьшим, нiж у необроблено! сперми. Це позначилося i на показнику абсолютно' виживаностi, що характеризуе динам^ зниження рухливостi сперми. Так, у отримано! очищено' активно' частини сперми показник виживаносп склав 123,2 умов. од. перевершуючи контрольний показник на 41,7 умов. од. (Р < 0,001). Треба також ввдмггити i бiльш високий показник стартово! рухли-востi в дослщнш групi, яка складала 9,02 бала, тобто бшьше нiж 90% спермив проявляли прямолшшно-поступовий рух. У ввдносному вимiрюваннi це вище за контроль на 16,6%.
В другому експериментi дослiджено зразки замо-рожено-вiдталоi сперми, отриманi з 9 серш (серiя -
парпя спермодоз, вироблених iз одного еякуляту). Результати оцiнки потенцiйно-фертильноi' фракцй' порiвняно з показниками деконсервовано! сперми наведено у таблиц 2.
З наведених в таблищ даних видно, що отримана потенцшно-фертильна фракцiя заморожено-вiдталоi' сперми, як i в першому дослщ, значно перевершува-ла контрольнi зразки. Так, виживашсть i'i' в середньо-му складала 8,75 год, що довше майже на 3,00 год. У вщносному вимiрюваннi потенцiйно-фертильна фрак-цiя сперми перевершуе контрольнi зразки за вижива-нiстю на 32,80%. Динамша зниження рухливостi у потенцшно-фертильно! фракцй' також суттево вiдрiз-нялось вiд необроблено! деконсервовано! сперми, що характеризуеться показником абсолютно' виживанос-■ri, який був на 8,19 умовн. од. бшьшим на користь контролю.
Таблиця 2
Фiзюлоriчш показники отриманоТ мотенщально-фертильноТ фракци мор1вмямо з показниками _деконсервованоТ сперми, що не була смещально оброблена (n = 9)._
Показники бюлопчно! якосп сперми Потенцiйно-фертильна фракцiя деконсервовано! сперми (дослщ) Деконсервована сперма (контроль)
Рухливгсть, бали (%) 6,50 ± 0,16 (65,0% ± 1,6%) 4,38 ± 0,13 (43,8% ± 1,3%)
Виживашсть (годин) 8,75 ± 0,16* 5,88 ± 0,23
Показник абсолютно! виживаносп (Sa, умовн. одн.) 24,00 ± 0,50* 15,81 ± 0,42
Отримана р1зниця м1ж дослщною та контрольною групами щодо виживаносп та показника абсолютно! виживаносп була статистично достов1рна (Р < 0,001) як для св1жоотримано!, так i для деконсервовано! сперми.
Таким чином, проведеними дослвдженнями створено базу для подальшого розвитку методiв оцiнки бiологiчно! якостi сперми буга!в, спрямованих на прогнозування !! фертильносп. На нашу думку, за-пропоноваш додатковi характеристики спермограм буга!в, а саме: «виживашсть потенцшно-фертильно! фракци сперми», «показник абсолютно! виживаностi потенцiйно-фертильно!' фракци сперми» можуть стати важливими критерiями оцiнки якостi сперми свiжоот-риманих еякулятiв буга!в.
Висновки
Потенцiйно-фертильна фракция як св1жоотримано!, так i деконсервовано! сперми, суттево вiдрiзняeться вiд бюлопчних показник1в сперми, що робить необ-хiдним введення в показники спермограми додатко-вих характеристик. Показник виживаносп потенцш-но-фертильно! фракцi! деконсервовано! сперми шд-вищився майже на 3 год, або на 32,8%. Показник абсолютно! виживаносп потенцшно-фертильно! фракци шдвищився на 8,19 умов.одн.
Перспективи подальших до^джень. Запропоно-вана система оцшки сперми буде сприяти тдвищен-ню ефективностi використання заморожено-вiдталого бiоматерiалу. Введенi додатковi характеристики спермограм - «виживашсть потенцшно-фертильно! фра-
кци cnepMH», Ta «noKa3HHK a6couoTHoi BH^HBaHOcri n0TeH^HH0-$epTHUbH0i ^pa^ii cnepMH», MO^yTb cra-th Ba^^HBHMH KpurepiaMH оцiнкн. Ee3yMOBHO, ^o npoBegeHa po6oTa e nepmuM kpokom i orpHMaHi xapaK-TepHcrHKH norpe6yoTb o6rpymyBaHHH nepe3 BH3HaneH-hh KopejuiTHBHoro 3B'ii3Ky 3 3anjri1gHioioxioio 3garrncTio cnepMH.
EiS^iorpa^inm iIOCII. lanim
Mursalov, B.Je. (1999). Sposob poluchenija kletochnyh frakcij dlja iskusstvennogo razmnozhenija zhivotnyh. № 2142226 (in Russian). Sherhyn, N.P. (1967). Byokhymyya spermu Selskokho-zyaystvennukh zhyvotnukh [Biochemistry Of domestic animal spermatozoa] (in Russian). Ofitsiinyi sait kompanii COOK Medical Ukrainian Representative [Elektronnyi resurs].-Rezhym dostupu: http://stoik.com.ua/work_with_culture/30-rabota-s-gametami.html (in Ukrainian). DSTU 3535-97 (1998). Sperma buhaiv natyvna. Tekhnichni umovy. K.: Derzhspozhyvstandart Ukrainy, 24 (in Ukrainian). GOST 26030-83 (1984). Sperma bykov zamorozhennaja.
Tehnicheskie uslovija. M., 6 (in Russian). Ostashko, F.I. (1990). Har'kovskaja tehnologija asepticheskogo vzjatija i kriokonservacii spermy bykov proizvoditelej: Metodicheskie rekomendacii (in Russian).
Plohinskij, N.A. (1970). Biometrija. M.: Izdat Mosk. Univer (in Russian).
Cmammn nadiumm do peda^ii 20.02.2017
