CC BY
29
УДК 612.616.2:599.735.52.612.663
Шаран М. М., д.с.-г.н. (тт sharan@yahoo.com) Гримак Х. М., астрант 1нститут бюлогп тварин НААН Украгни, м. Львгв
ВПЛИВ БСА I В1ДНОВЛЕНОГО ГЛУТАТ1ОНУ У СКЛАД1 СЕРЕДОВИЩА ДЛЯ ЗАМОРОЖУВАННЯ СПЕРМИ БАРАН1В НА ЯК1СТЬ ДЕКОНСЕРВОВАНИХ СПЕРМПВ
Наведено результати дослгджень з вивчення впливу вгдновленого глутатюну та бичачого сироваткового альбумту (БСА) у лактозо-жовтково-трю-цитрато-глщериновому середовищ1 (ЛЖТЦГС) на якгснг показники деконсервованог сперми барангв-плгдникгв. Свгжоодержанг еякуляти барашв украгнськог ггрськокарпатськог породи з активтстю 80-90 % розбавляли 1:3 ЛЖТЦГС з додаванням вгдновленого глутатюну (5 цМ) г бичачого сироваткового альбумту (15 мг/мл). У контролг сперму розбавляли ЛЖТЦГС. Згодом сперму фасували у пайети мютюстю 0,25мл, еквшбрували за температури 4°С протягом 3 годин г заморожували над парами азоту (-120°С). На кожному технолог1чному етат заморожування визначали активтсть спермпв г кглькгсть ТБК-активних продуктгв, а також виживатсть та показник абсолютного виживання. Встановлено, що введення до складу ЛЖТЦГС 5 цМ вгдновленого глутатюну та 15 мг/мл БСА сприяло тдвищенню активност1 деконсервованих спермпв на 11,0 %, стткост1 гх до крюконсервування - на 6,0 %, збереженост1 акросом - на 9,5 %, виживаност1 спермпв - на 23,9 %, показника абсолютного виживання - на 21,8 %, що вказуе на позитивний вплив введених у середовище бгологгчно активних речовин на ятст показники деконсервованог сперми. За додавання глутатюну з БСА до ЛЖТЦГС кглькгсть ТБК-активних продуктгв у плазм1 сперми тсля еквтбрацп була меншою на 22,2 % (р<0,01), тсля розморожування - на 27,4 % (р<0,01) пор1вняно з контролем.
Ключовi слова: барани-пл1дники, крюконсервування, деконсервована сперма, вгдновлений глутатюн, бичачий сироватковий альбумт, ТБК-активн1 продукти.
УДК 612.616.2:599.735.52.612.663 Шаран М. М., доктор сельскохозяйственных наук, Гримак Х. М., аспирант
Институт биологии животных НААН Украины, г.. Львов
ВЛИЯНИЕ БСА И ВОСТАНОВЛЕННОГО ГЛУТАТИОНА В СОСТАВЕ СРЕДЫ ДЛЯ ЗАМОРАЖИВАНИЯ СПЕРМЫ БАРАНОВ НА КАЧЕСТВО ДЕКОНСЕРВИРОВАННЫХ СПЕРМИЕВ
Приведены результаты исследований по изучению влияния восстановленного глутатиона и бычьего сывороточного альбумина (БСА) в лактозо-желтково-трис-цитрат-глицериновй среде (ЛЖТЦГС) на качественные показатели деконсервированной спермы баранов-производителей. Свежополученные эякуляты баранов украинской горнокарпатской породы с активностью 80-90% разбавляли 1: 3 ЛЖТЦГС с
227
добавлением восстановленного глутатиона (5 ¡иМ) и бычьего сывороточного альбумина (15 мг/мл). В контроле сперму разбавляли ЛЖТЦГС. Впоследствии сперму фасовали в пайеты вместимостью 0,25 мл, эквилибрировали при температуре 4°С в течение 3 часов и замораживали над парами азота (-120С). На каждом технологическом этапе замораживания определяли активность спермиев и количество ТБК-активных продуктов, а также выживаемость и показатель абсолютного выживания. Установлено, что введение в состав ЛЖТЦГС 5 ¡М восстановленного глутатиона и 15 мг / мл БСА способствовало повышению активности деконсервированных спермиев на 11,0%, устойчивости их к криоконсервированию - на 6,0%, сохранности акросом - на 9,5%, выживаемости спермиев - на 23,9%, показателя абсолютного выживания - на 21,8%, что указывает на положительное влияние введенных в среду биологически активных веществ на качественные показатели деконсервированной спермы. При добавлении глутатиона с БСА в ЛЖТЦГС количество ТБК-активных продуктов в плазме спермы после эквилибрации было меньше на 22,2% (p <0,01), после размораживания - на 27,4% (p <0,01) по сравнению с контролем.
Ключевые слова: бараны-производители, криоконсервирование, деконсервированная сперма, восстановленный глутатион, бычий сывороточный альбумин, ТБК-активные продукты.
UDC 612.616.2:599.735.52.612.663
Sharan M., PHG hab, Grymak C.
Institute of animal biology NAAS, Lviv
THE EFFECT OF BSA AND REDUCED GLUTATHIONE AS PART OF THE ENVIRONMENT FOR FREEZING THE RAM SPERM ON THE FROZEN-THAWED SPERM QUALITATIVE CHARACTERISTICS
The research findings on the determination of the optimal concentration of reduced glutathione and bovine serum albumin in the lactose-yolk-tris-citrate-glycerine diluent (LYTCGD) with ram-sires sperm cryopreservation are revealed. The obtained ejaculate of rams sperm of the Ukrainian Carpathian Mountain breed with the activity of 80-90% was diluted 1:3 with lactose-yolk-tris-citrate-glycerine diluent with the concentration of glutathione (5иМ) and BSA (5 mg/ml). In the control group the sperm was diluted with the LYTCGD. After that, 0,25ml straws were filled with the diluted sperm, equilibrated at the temperature of 4 °С for 3 hours and frozen above nitrogen vapour for (-120°С). The activity of sperm, amount of TBARS, surviving and absolute survival indicator were determined at the itch steps of the freezing. It is established that the addition of 5 иМ of reduced glutathione and 15 mg/ml of bovine serum albumin into the LYTCGD contributed to the increase in frozen-thawed sperm activity by 11,0 %, its resistance to cryopreservation by 6,0 %, intact acrosome by 9,5 %, sperm surviving rate by 23,9 %, absolute survival indicator by 21,8 %, which indicates a positive effect of the added bioactive substances into the diluent on the qualitative characteristics of frozen-thawed sperm. After the addition of 5 иМ of reduced glutathione and 15 mg/ml of bovine serum albumin into the LYTCGD the amount of TBARS in the seminal plasma after
228
equilibration was lower by 22,2 % (p<0,01), after thawing— by 27,4 % (p<0,01) than that in the control one.
Key words: ram-sires, cryopreservation, frozen-thawed sperm, reduced glutathione, bovine serum albumin, TBARS.
Вступ. Одним i3 визначальних чинниюв результативност штучного оЫменшня е удосконалення методу крюконсервування та збер^ання сперми у глибокозамороженому сташ, що дозволяе рацюнально використовувати найщншших барашв-плщниюв незалежно вiд сезону року, вщд^ та клiматичних умов. Ефективнiсть крюконсервування сперми значною мiрою залежить вщ складу синтетичних середовищ, завданням яких е забезпечення належного захисту спермив вiд несприятливих чинникiв пiд час крюконсервування, викликаних дiею низьких i наднизьких температур.
У середовищах для розбавлення сперми з метою збереження акросом, як основш компоненти використовують лактозу, жовток курячого яйця i глщерин. З метою запоб^ання надмiрного накопичення токсичних продуктiв пероксидацiï лшвдв у спермi баранiв у процес еквiлiбрацiï та зберiгання в охолодженому та глибокозамороженому сташ ряд дослщниюв пропонують використовувати в складi середовищ рiзнi антиоксиданти, якi володiють
захисними властивостями, що значно тдвищуе результатившсть осiменiння [15].
У лiтературi наявнi повiдомлення про позитивний вплив бичачого сироваткового альбумшу (БСА) i тюлових сполук на збереження бiологiчноï повноцiнностi спермiïв тварин. Автори вказують, що макромолекула БСА чинить протекторну дш на ферменти спермiïв [6]. Застосування БСА в складi середовища для сперми баранiв, яку збер^али за температури 16°С, сприяло тдвищенню рухливостi i виживаностi спермiïв [7].
Враховуючи вищенаведене, метою наших дослщжень було вивчення якiсних показникiв спермив барашв украшсько1' гiрськокарпатськоï породи за використання вщновленого глутатiону та бичачого сироваткового альбумшу в складi лактозо-жовтково-трк-цитрато-глщеринового середовища.
Матер1ал i методи. Дослщження з вивчення впливу вiдновленого глутатюну i бичачого сироваткового альбумiну у складi лактозо-жовтково-трiс-цитрато-глiцеринового середовища на якюш показники сперми та ïï заплiднювальну здатнiсть проводили на баранах украшсько!' гiрськокарпатськоï породи (УГКП) селянсько-фермерського господарства «Салдобош» Хустського району Закарпатськох' областi.
Свiжоодержанi еякуляти сперми барашв УГКП з актившстю 80-90 % розбавляли 1:3 у ЛЖТЦГС з концентращею вщновленого глутатюну 5 цМ та БСА 15 мг/мл. У контролi сперму розбавляли лише ЛЖТЦГС. Згодом на обладнанш фiрми «Minitub» пайети мiсткiстю 0,25мл заповнювали розбавленою спермою, помiщали у холодильник за температури 4°С та еквiлiбрували протягом 3 годин, а поим утримували 20 хв над парами азоту (-120°С) у спещальнш посудинi. Шсля чого пайети фасували в касети й опускали в рщкий азот бюсховища.
229
У заморожено-розмороженш спермi визначали: актившсть спермпв тсля еквшбраци i крiоконсервування, стiйкiсть спермив до заморожування, виживашсть спермпв i показник абсолютного виживання. Стiйкiсть спермив до заморожування визначали у вщсотковому вщношенш кiлькостi активних гамет з прямолшшно-поступальним рухом пiсля розморожування, до кшькосп спермив з прямолiнiйно-поступальним рухом до заморожування тсля еквшбраци.
Виживатсть спермпв за температури +38°С визначали тд мжроскопом при збiльшеннi 200 раз до цшковито! загибелi статевих кл^ин. Показник абсолютного виживання за температури +38°С вираховували за спрощеною формулою : Sa = а!/2 + X ( а ■ t) ■ п, де
Sa - показник абсолютного виживання ; X - сума; а - оцшка спермпв за рухливютю у балах; t - показник промiжку часу мiж попередньою i наступною перевiркою сперми; п - кшьккть проведених дослiджень.
Кшьшсть ТБК-активних продукив визначали за методом Коробейникова С.Н. (1989), описаним у «Довщнику» [8].
Результати дослщження. Порiвняльною оцiнкою яккних показникiв спермпв баранiв-плiдникiв удосконаленого середовища з контрольним ЛЖТЦГС встановлено, що комплексне введення вщновленого глутатiону i БСА у дослiдне середовище сприяло пщвищенню якостi спермив пiсля еквшбраци в середньому на 10,6 вщсотка ( р< 0,01; табл.).
Таблиця
Вплив глутатiону та БСА у склад1 середовища для заморожування сперми
барашв на яккш показники спермi'lв, М±т, п= 10
Середовище
дослщне
Показники контрольне (ЛЖТЦГ+5 цМ
(ЛЖТЦГ) глутатюну+ 15 мг/мл БСА)
Актившсть св1жоодержаних спермив, % 90,15±1,65 90,15±1,65
Актившсть спермпв тсля еквшбраци, % 73,82±2,35 84,46±1,52**
Актившсть деконсервованих спермив, % 41,24±1,31 52,26±2,13***
Стшшсть спермпв до заморожування, % 55,86±3,41 61,87±2,36
Кшьшсть деконсервованих спермив з ушкодженою акросомою, % 27,50±2,85 18,00±1,65*
Виживашсть спермпв, год 7,10±0,48 8,80±0,47*
Показник абсолютного виживання, ум.од. 13,24±0,96 16,12±1,15*
Примтка1: у данш таблиц *р<0,05; ** р<0,01; *** р<0,001;
Актившсть деконсервованих спермпв в удосконаленому середовищi становила 52,26±2,13 % i була вищою порiвняно з контрольним середовищем на 11,0 % (р<0,001). Додавання до середовища вщновленого глутатюну i БСА пщвищило стiйкiсть спермпв до заморожування на 6,0 % та збережешсть акросом — на 9,5 вщсотка (р<0,05). Виживашсть спермив в удосконаленому середовищi становила 8,80±0,47 год, що на 23,9 % (р<0,05) бшьше порiвняно з
230
контролем. Показник абсолютного виживання спермив теж був вищим в удосконаленому середовищi порiвняно з контрольним на 21,8 % (р<0,05).
Отже, отримаш даш свщчать про позитивний вплив комбiнованого використання у складi ЛЖТЦГС вiдновленого глутатюну i БСА у вказаних концентращях на дослiджуванi якiснi показники деконсервовано! сперми.
Дослiдженням пероксидаци лiпiдiв спермив за рiвнем !х кiнцевих продукив метаболiзму встановлено, що за додавання глутатюну з БСА до середовища кшьккть ТБК-активних продуктiв у плазмi сперми пiсля еквшбраци була меншою на 22,2 % (р<0,01), тсля розморожування — на 27,4 % (р<0,01) порiвняно з контролем.
8т
7 6 5 4 3 2 1
У—71
_
/С.
розр1дження еквШбрацц розморожування
□ контроль Шдослщ
0
Рис. Вмкт ТБК-активних продукт1в у плазм1 сперми барашв за дй' глутат1ону та БСА у склад1 ЛЖТЦГС
Таким чином, встановлено позитивний вплив вщновленого глутатюну з бичачим сироватковим альбумшом у складi ЛЖТЦГС на актившсть i виживанiсть деконсервованих спермив барашв-плщниюв, що, очевидно, зумовлено !х антиоксидантною дieю на мембраннi структури спермив, що призвело до зниження окиснення сульфгщрильних груп мембранних бшюв i шактиваци виходу ферментiв iз спермив.
Висновки.
1. Додавання до складу ЛЖТЦГС 5 цМ вщновленого глутатюну та 15 мг/мл БСА вiрогiдно пщвищуе актившсть деконсервованих спермив, збережешсть акросом, виживашсть спермив та показник абсолютного виживання, що вказуе на позитивний вплив введених у середовище бюлопчно активних речовин на якiснi показники деконсервовано1 сперми.
2. За введення глутатюну з БСА до ЛЖТЦГС юлькють ТБК-активних продукив у плазмi сперми пiсля еквшбраци зменшуеться на 22,2 % (р<0,01), пiсля розморожування - на 27,4 % (р<0,01) порiвняно з контролем.
3. Одержан результати пiдтверджують ефективнiсть використання удосконаленого середовища для глибокого заморожування сперми барашв-плiдникiв.
231
Л1тература
1. Наук В. А. Криоконсервация семени животных. Консервация генетических ресурсов / В.А. Наук // Пущино.— 1982. — 48 с.
2. Варнавский А. Н. Новые среды для замораживания спермы баранов / А. Н. Варнавский, В. А. Варнавская, В. В. Зайцев // Зоотехния.— 1989. — №9.
— С.46-49.
3. Ерохин А. С. Криозащитное действие новых синтетических антиоксидантов при криоконсервации спермы баранов / А. С. Ерохин, Т. М. Епишина, А. Г. Никифоров // Сельскохозяйственная биология. — М.: 1996.
— №6. — С.19-21.
4. Ерохин А. С. Изучение защитного влияния хитозана при криоконсервации семени быков и баранов / А. С. Ерохин, Ю. П. Фомичев, Н. И. Федина, Т. М. Епишина // Научно-производственный журнал. Аграрная Россия. — 2004. — № 5. — С. 17-20.
5. Деряженцев. В.И. Новый криопротектор синтетической среды для разбавления и криоконсервации спермы баранов / В. И. Деряженцев, Т. М. Епишина // Ветеринарная патология. — 2008. — № 3.
— С. 36-38.
6. Kheradmand A. Babaei H., Abshenas J. 2006. Comperative evaluation of the effect of antioxidants on the chilled-stored ram semen Iranian Journal of veterinary research, University of Shiraz. 7. (4). 40-43.
7. Ерохин А. С. Влияние бычьего сывороточного альбумина на фертильность семени хряков / А. С. Ерохин, Т. М. Епишина // Свиноводство.
— 2007.— № 4. — С. 26-27.
8. Лабораторш методи дослщжень у бюлогп, тваринництвi та ветеринарнш медицин^ довщник / В. В. Влiзло, Р. С. Федорук, I. Б. Ратич та ш.; за ред. В. В. Влiзла. — Львiв: СПОЛОМ, 2012. — 202 с.
Рецензент - д.вет.н., професор Стефаник В.Ю.
232
