CC BY
22
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ УДК 577.15
НОВЫЕ КОРМОВЫЕ ФЕРМЕНТНЫЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ НЕКРАХМАЛЬНЫХ ПОЛИСАХАРИДОВ И ФИТАТОВ
1 2 Ольга Генриховна Короткова , Александра Михайловна Рожкова , Валерий
Юрьевич Кислицин3, Ольга Аркадьевна Синицына4, Юрий Андреевич
Денисенко5, Мария Александровна Марочкина6, Иван Никитич Зоров7,
Игорь Александрович Шашков8, Айдар Дамирович Сатрутдинов9, Аркадий
Пантелеймонович Синицын10
1 з, 5, 7 ш Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской академии наук 2' 4' 6' 7' 10 Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет
Автор, ответственный за переписку: Александра Михайловна Рожкова [email protected]
Аннотация. Созданы новые рекомбинантные штаммы Pénicillium verruculosum с высоким уровнем экспрессии гомологичной эндо-Р-1,4-глюканазы II и гетеро-логичной фитазы А А. niger, а также гетерологичных эндо-1,4-Р-ксиланазы E P canescens и фитазы А А. niger, позволяющие получить высокоактивные кормовые ферментные препараты (ФП), способные одновременно значительно снизить вязкость некрахмальных полисахаридов, а также увеличить биодоступность фосфора и минеральных веществ кормов на основе зерновых культур и таким образом увеличить усвояемость питательных веществ кормов селскохозяйственных животных и птицы. Изучена удельная активность ФП по специфическим субстратам (ксиланау, Р-глюкану, фитату), определен качественный и количественный компонентный состав новых ФП. На основе нового ферментного препарата, содержащего гомологичную эндо-Р-1,4-глюканазу II и гетерологичную фитазу А А. niger, получен штамм-реципиет niaD , в который была успешно клонирована гетероло-гичная эндо-1,4-Р-ксиланаза E P. canescens и получен перспективный продуцент одновременно трех целевых ферментов.
Ключевые слова: некрахмальные полисахариды (НПС), фитаза, эндо-Р-1,4-глюканаза, эндо-1,4-р-ксиланаза, ферментный препарат
DOI: 10.55959/MSU0579-9384-2-2023-64-2-178-186
Список сокращений: НПС - некрахмальные полисахариды, ФП - ферментный препарат, КМЦ - натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы.
Финансирование. Работа выполнена при поддержке Министерства науки и высшего образования (Соглашение № 075-15-2021-1071 от 28.09.2021).
Для цитирования: Короткова О.Г., Рожкова А.М., Кислицин В.Ю., Синицына О.А., Денисенко Ю.А., Марочкина М.А., Зоров И.Н., Шашков И.А., Сатрутдинов А.Д., Синицын А.П. Новые кормовые ферментные препараты для деструкции некрахмальных полисахаридов и фитатов // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. Т. 64. № 2. С. 178-186.
© Короткова О.Г., Рожкова А.М., Кислицин В.Ю., Синицына О.А., Денисенко Ю.А., Марочкина М.А., Зоров И.Н., Шашков И.А., Сатрутдинов А.Д., Синицын А.П., 2023
ORIGINAL ARTICLE
NEW FEED ENZYME PREPARATIONS FOR THE DESTRUCTION OF NON-STARCH POLYSACCHARIDES AND PHYTATES
1 2 3
Olga G. Korotkova , Alexandra M. Rozhkova , Valery Y. Kislitsin , Olga A. Sinit-syna4, Yuri A. Denisenko5, Maria A. Marochkina6, Ivan N. Zorov7, Igor A. Shash-kov8, Aidar D. Satrutdinov9, Arkady P. Sinitsyn10
1-3, 5, 7-10 gach Institute of Biochemistry, Federal Research Centre "Fundamentals of Biotechnology" of the Russian Academy of Sciences, Moscow, Russian Federation 2' 4' 6' 7' 10 Department of Chemistry, Lomonosov Moscow State University, Moscow, Russian Federation
Corresponding author: Alexandra Mikhailovna Rozhkova [email protected] Annotation. New recombinant strains of Penicillium verruculosum have been created with a high level of expression of homologous endo-P-1,4-glucanase II and heterologous phytase A A. niger, as well as heterologous endo-1,4-P-xylanase E P. canescens and phytase A A. niger, allowing to obtain highly active feed enzyme preparations (AF) capable of simultaneously significantly reducing viscosity non-starch polysaccharides, as well as increase the bioavailability of phosphorus and minerals of grain-based feed and, thus, increase the digestibility of nutrients of agricultural animal and poultry feed. Specific AF activities for specific substrates (xylanau, P-glucan, phytate) were studied, the qualitative and quantitative component composition of new AF was determined. On the basis of a new enzyme preparation containing homologous endo-P-1,4-glucanase II and heterologous phytase A A. niger, a recipient strain Ania D - was obtained, into which heterologous endo-1,4-P-xylanase E P. canescens was successfully cloned and, thus, a promising producer of three target enzymes was obtained simultaneously.
Keywords: non-starch polysaccharides (NPS), phytase, endo-P-1,4-glucanase, en-do-1,4-P-xylanase, enzyme preparation
Financial Support. The work was carried out with the support of the Ministry of Science and Higher Education (Agreement No. 075-15-2021-1071 dated 09/28/2021).
For citation: Korotkova O.G., Rozhkova A.M., Kislitsin V.Yu., Sinitsyna O.A., Denisenko Yu.A., Marochkina M.A., Zorov I.N., Shashkov I.A., Satrutdinov A.D., Sinitsyn A.P. New feed enzyme preparations for the destruction of non-starch pol-ysaccharides and phytates // Vestn. Moscow. un-ta. Ser. 2. Chemistry. T. 64. № 2. P. 178-186.
Зерновые корма для сельскохозяйственных животных и птицы характеризуются наличием в них антипитательных компонентов, таких как некрахмальные полисахариды (НПС) и фита-ты. К НПС относятся целлюлоза, Р-глюканы и ксиланы, их содержание варьирует от 7-10% в пшенице до 17% в ячмене. НПС не усваиваются в желудочно-кишечном тракте в связи с тем, что в организме не вырабатываются соответствующие ферменты, при этом они ухудшают переваривание основных питательных веществ, поскольку повышают вязкость химуса, замедляют транзит корма в пищеварительном тракте и снижают всасывание переваренных продуктов [1-2]. Фитиновая кислота или фитат (соль фитиновой кислоты) - это химическое соединение шестиатомного спирта инозитола, к которому
присоединены 6 остатков молекул фосфорной кислоты. Неорганический фосфор (РО содержится в виде фитиновой кислоты в злаках, бобовых и масличных культурах, что делает его недоступным для метаболических процессов в живых системах. Кроме того, отрицательно заряженная фитиновая кислота образует комплексы с двухвалентными катионами, крахмалом и белками [3].
Наиболее распространенным способом уменьшения негативного влияния НПС и фита-тов кормов является использование ферментных препаратов (ФП). Включенные в корм ферменты, дополняя пищеварительную систему сельскохозяйственных животных и птицы, обеспечивают конверсию НПС и высвобождение фосфора из фитатов, что в результате способствует улуч-
шению использования питательных веществ рациона. В связи с этим актуально создание комплексных ферментных добавок для кормов, имеющих в своем составе три необходимых фермента: эндо-Р-1,4-глюканазу, эндо-1,4-Р-ксиланазу (для разрушения НПС) и фитазу (для высвобождения неорганического фосфора из фитиновой кислоты).
В качестве компонентов комплексной кор-мовой добавки нами были выбраны следующие ферменты.
Эндо-1,4-Р-ксиланаза Е P. canescens. Преимущество этого фермента заключается в высокой удельной активности по отношению к глюкуро-ноксилану и арабиноксилану; он не ингибиру-ется белковыми ингибиторами злаков и имеет оптимальные операционные характеристики для функционирования в качестве кормовой добавки [4-6].
Эндо-Р-1,4-глюканаза II P. verruculosum, обладающая высокой удельной активностью по отношению к растворимым Р-глюканам. Характеризуется высокой термостабильностью, устойчива к действию пищеварительных про-теаз [7]. Совместно эти ферменты (эндо-1,4-Р-ксиланаза Е P. canescens и эндо-Р-1,4-глюканаза II P. verruculosum) способны «разрыхлять» клетчатку за счет расщепления ксиланов и Р-глюканов, уменьшая их вязкость и превращая их в олигосахариды, что способствует росту полезной микрофлоры в кишечнике и увеличивает перевариваемо сть НПС.
Фитаза А Aspergillus niger, обладающая высокой удельной активностью по отношению к фитатам и устойчивостью к действию протеоли-тических ферментов [8].
Мицелиальный гриб Penicillium verruculosum (природный продуцент целлюлаз и ксиланаз) используется как платформа для получения ком -плексных ферментных препаратов, обладающих активностью по отношению к различным субстратам. На основе реципиентного штамма P. verruculosum 537 (AniaD) создана экспресси-онная система [9], позволяющая использовать этот гриб как основу для получения рекомби-нантных штаммов - продуцентов ферментов и их комплексов для практического применения в разных областях промышленности и сельского хозяйства [10].
Для создания продуцента трех целевых ферментов требуется использование трех плазмид. Однако трансформация мицелиальных грибов, в том числе P. verruculosum, имеет ограничения
по нагрузке вносимой ДНК в протопласт гриба [11], поэтому одновременное использование трех плазмид возможно только при снижении количества каждой из экзогенных ДНК, что приводит к снижению статистической вероятности встройки нескольких генов в хромосомный материал реципиентного штамма [12].
Цель работы состояла в создании новых ре-комбинантных штаммов P verruculosum с высоким уровнем «дуплетной» экспрессии фитазы А. niger / эндо-Р-1,4-глюканазы и фитазы А. niger / эндо-Р-1,4-ксиланазы P canescens, создание на их основе штаммов-реципиентов с помощью системы СШ8РЯ-СА8 и внесение третьей ферментативной активности в секретируемый ком -плекс P. verruculosum, что позволило получить комплексный «триплетный» ФП, способный к деструкции всех видов НПС и фитатов.
Экспериментальная часть
Амплификация генов и получение рекомбинантных штаммов
Гены phy A, egII и ху1, кодирующие целевые белки - фитазу А А. niger, эндо-1,4-Р-глюканазу II P verruculosum и эндо-1,4-Р-ксиланазу Е Р. canescens соответственно, были аплифицирова-ны с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров:
СБН1-РНУА-Ь1С5 caaacagaagcaaccgac
acaatgggcgtctctgctgttctacttcc
СБН1-РНУА-Ь1С3 gaggagaagcccggtcta
agcaaaacactccgcccaatca
СБН1-ХУЬЕ-Ь1С5 ggcaacagcaggagctcc
tcacttgcccggcaacaaggac
СБН1-ХУЬЕ-Ь1С3 agaggagggcgacacagt
ctagcacacactgcaaggctttccctc
СБН1-ЕОП-Ь1С5 caaacagaagcaaccgac
acaatgaaggccagtatcattcctgtcgt
СБН1-ЕОП-Ь1С3 gaggagaagcccggttaa
aaataagtctccaaaatcgaca
Полученные ПЦР-продукты были лигирова-ны в вектор рИС-СБШ [9], содержащий нукле-отидные последовательности, соответствующие промоторной и терминаторной области гена сЪЫ Р. verruculosum путем лигаза-независимого (Ь1С) клонирования [13].
В результате попарной котрансформации реципиентного штамма Р. verruculosum 537 плазмидами р8ТА10 и смесями плазмид рСБН1-рИуА/рСБН1^12 или рСБШ-рИуА/рСБШ-хуШ с последующим скринингом трансформантов
в колбах Эрленмейера в 100 мл ферментационной среды, содержащей (г/л): KH2PO4 - 1,5; (NH4)2SO47H2O - 0,5; MgSO4-7H2O - 0,03; CaCl2-2H2O - 0,03; глюкозу - 1,0; дрожжевой экстракт - 1,0; пшеничные отруби - 1,0; микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) - 40,0, были отобраны два штамма P. verruculosum PhyEg76 и P. verruculosum PhyXyl41, согласно критерию наибольшей ферментативной активности по фи-тату натрия, Na-соли карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) и ксилану бука.
Получение сухих ферментных препаратов
Штаммы-продуценты P. verruculosum PhyEg76 и P. verruculosum PhyXyl41 культивировали в ферментерах объемом 3 л («Проинтех», Москва, Россия) на среде, содержащей (г/л): КН2РО4 - 7,0; (NH4)2SO4 - 5,0; MgSO47H20 -0,3; CaCl2-2H20 - 0,23; глюкозной патоки - 57,0; дрожжевого экстракта - 10,0; пшеничных отрубей - 10,0; МКЦ - 40,0. Культивирование проводили при 30 °С и pH 4,8-5,0 в течение 6 суток, затем культуральную жидкость концентрировали и лиофильно высушивали для получения сухих ФП. Таким образом, были получены сухие ФП на основе рекомбинантных штаммов, продуцирующих: 1) фитазу А A. niger и эндо-1,4-в-глюканазу II P. verruculosum -PV-Phy-EG-36; 2) фитазу А A. niger и эндо-1,4-в-ксиланазу E P. canescens - PV-Phy-Xyl-41.
Электрофорез в денатурирующих условиях (ДДС-электрофорез)
Для проведения ДДС-электрофореза использовали пластины с полиакриламидным гелем (4% концентрирующего и 12% разделяющего геля). Растворы ферментов предварительно обрабатывали 1%-м додецилсульфатом натрия и 5%-м в-меркаптоэтанолом при 100 °С в течение 15-20 мин. Окраску белковых полос в гелях проводили красителем Coomassie-Brilliant Blue G-250 фирмы «Helicon» (Россия). В качестве стандарта молекулярных масс применяли белковый маркёр фирмы «Thermo Scientific» (США) с диапазоном 14,4-116,0 кДа (#26610).
Идентификация ферментов методом масспектрометрии
Исследования осуществляли по методике, изложенной в [14, 15]. Масс-спектрометрию проводили в ЦКП ФИЦ Биотехнологии РАН на приборе «MALDI-TOF/TOF UltrafleXtreme»
фирмы «Bruker» (Германия). Полученные значения массы пептидов анализировали с помощью MASCOT (http://www.matrixscience.com), а также сопоставляли с теоретически рассчитанными значениями молекулярной массы возможных пептидов, полученных с помощью программы PeptideMass (http://expasy.org/tools/peptide-mass.html) на основании известных аминокислотных последовательностей фитазы А А. niger, эндо-в-1,4-глюканазы II P. verruculosum и эндо-1,4-в-ксиланазы E P. canescens.
Получение реципиентного штамма P. verruculosum PhyEG36 (\niaD) методом CRISPR/CAS и трансформация его плазмидой рCBHI-xylЕ
Для нокаута гена niaD A. niger, который используется для восстановления генотипа niaD+ при получении рекомбинантных штаммов P. verruculosum проводили трансформацию штамма P. verruculosum PhyEG36 плазмидой pGCS, несущей ген нуклеазы Cas9 и последовательность, кодирующую sgPHK, по ранее описанной методике [16, 17]. Трансформанты c генотипом P. verruculosum AniaD отбирали на селективной среде (СМ) с добавлением 10 мМ NH4Cl в качестве источника азота и 0,7 М NaClO3 в качестве селективного агента. Колонии, выросшие на этой среде, пересевали на минимальную среду (МС) с NH4Cl или NaNO3 в качестве источника азота. Клоны, способные расти на NaNO3, исключали из дальнейшего анализа.
Из отобранных на селективной среде клонов выделяли геномную ДНК с помощью набора DNeasy Plant Mini Kit («Qiagen», Нидерланды). Выделенную ДНК использовали для амплификации фрагментов гена AnniaD с помощью праймеров:
pSTA3500R gatgctcacctgccaataggc
pSTA2950F gtgatcaggacggagatcctcg
Полученные фрагменты ДНК использовали для секвенирования и поиска мутаций.
Получение плазмиды pGCS
Последовательность протоспейсера для нокаута гена AnniaD (5'-tcaaaggcttcgcactccgt-3') была подобрана в программе ChopChop (https:// chopchop.cbu.uib.no/). Плазмиду pGCS (рис. 1) получали путем лигирования по рестрикцион-ным сайтам BamHI и SalI в плазмиду pGpdCas9 [18] фрагмента, кодирующего sgРHК со спейсером для нокаута гена AnniaD из предварительно по-
Рис. 1. Схема получения плазмиды pGCS
лученной плазмиды p5SAnn. Плазмида p5SxlnR была получена из плазмиды p5SniaD [18] в результате замены последовательности спейсера sgPHK c помощью ПЦР-мутагенеза при использовании праймеров:
pSTAF tcaaaggcttcgcactccgtgttttagagctagaa atagcaag
pSTAR acggagtgcgaagcctttgactattcgtcctttca tacaacag
Для молекулярного клонирования использовали штамм Escherichia coli XL 1-Blue (recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relAl lac [F'proAB lacIqZAM15 Tn10 (Tetr)]). Полимераз-ную цепную реакцию (ПЦР) для клонирования проводили с использованием ДНК-полимеразы Phire Hot Start II DNA Polymerase («Thermo Fisher Scientific Inc.», США) в соответствии с рекомендациями производителя. Все праймеры были разработаны с помощью программного обеспечения SnapGene 3.2.1.
Определение концентрации белка
Содержание белка в ФП определяли по методу Лоури, используя в качестве стандарта БСА [19].
Определение активности фитазы
Метод определения фитазной активности основан на скорости образования свободного фосфата при гидролизе фитата натрия из риса (ГОСТ 31487-2012). Для определения фитазной активности использовали 1,4 мМ раствор фита-та натрия в 0,1 M Na-ацетатном буфере, рН 5,0. Раствор субстрата (300 мкл) смешивали с 33 мкл
раствора фермента и инкубировали 30 мин при 37 °С. Реакцию останавливали добавлением 335 мкл 10%-го раствора ТХУ (трихлоруксусной кислоты). Концентрацию свободного фосфата (Р1) определяли с помощью аммоний-молибденового реагента (13 мМ Ре8047Н20 / 8,1 мМ (НН4)6Мо2024ЧН20/0,533 М Н2804). Реакционную смесь инкубировали с 665 мкл свежеприготовленного реагента в течение 30 мин при комнатной температуре. Светопоглощение измеряли при 750 нм. Концентрацию Р1 определяли исходя из калибровочного графика, полученного с помощью КН2Р04 (0-0,2 г/л). За единицу активности принимали количество фермента, способного высвободить 1 мкмоль Р1 за 1 мин [20].
Определение активности эндо~р~1,4-глюканазы и эндо-в-1,4-ксиланазы
Для определения эндоглюканазной (КМЦ-азной) и ксиланазной активности использовали метод, основанный на измерении скорости образования восстанавливающих сахаров (ВС) методом Шомоди-Нельсона при гидролизе полиса-харидных субстратов - Р-глюкана ячменя, КМЦ и ксилана из древесины бука соответственно. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль ВС за 1 мин при рН 5,0 и 50 °С [21].
Результаты и обсуждение
С помощью методов генетической инженерии были созданы плазмиды, содержащие один или два целевых гена (phyA и/или egШ и ху1Е).
Проведена трансформация штамма реципиента Р. verruculosum с последующим отбором наилучших трансформатов согласно критерию наибольших активности по отношению к фитату натрия, КМЦ и ксилану. Таким образом, были отобраны два наиболее активных продуцента ферментов, а на их основе получены два сухих ФП.
Исследование сухих ФП, полученных на основе новых штаммов Р. verruculosum РУ-РИу-БО и РУ-РИу-Ху1 с помощью ЭФ-ПААГ (рис. 2, 3), показало, что по сравнению с ФП на основе контрольного штамма реципиента В-537 для рекомбинантных ФП наблюдается заметное увеличение белковых полос в районе 63, 37 и 40 кДа (соответствующих, как предполагалось, фитазе А, эндо-1,4-Р-глюканазе II и эндо-1,4-Р-ксиланазе Е). Эти белковые полосы были вырезаны из геля и обработаны трипсином. Полученные гидролизаты исследованы с помощью МЛЬВЬТОБ масс-спектрометрии. Было установлено, что полосы на электрофореграмме (рис. 2), соответствующие 63, 37 и 40 кДа принадлежат целевым ферментам - фитазе А, эндо-1,4-Р-глюканазе II и эндо-1,4-Р-ксиланазе Е.
Следует отметить, что фитаза А и эндо-1,4-Р-глюканаза II, а также фитаза А и эндо-1,4-Р-ксиланаза Е являлись «мажорными» компонентами рекомбинантных ФП РУ-РИу-БО и РУ-РИу-Ху1 по сравнению с контрольным ФП РУ-контроль, полученным с помощью штамма-реципиента (рис. 2), при этом в полученных рекомбинантных ФП присутствовали также и ферменты исходного ферментного комплекса, продуцируемого реципиентным штаммом В1-537 (табл. 1). ФП РУ-РИу-БО содержал 25% рекомбинантной фитазы А, а содержание ЭГ II было почти в 5 раз больше по сравнению с содержанием в исходном штамме (14 и 3% соответственно). ФП РУ-РИу-Ху1 содержал 44% рекомбинантных белков с своем составе, а именно: 9% фитазы А А. niger и 36% эндо-1,4-Р-ксиланазы Е Р. canescens.
Активность полученных новых ФП была определена по отношению к растворимым по-лисахаридным субстратам - КМЦ, Р-глюкану, ксилану и фитату натрия (табл. 2). Оба ФП обладали высокой фитазной активностью (от 24 000 до 34 000 ед./г) по сравнению с контрольным
Рис. 2. Электрофореграммы полученных ферментных препаратов Р. verruculosum: РУ-РИу-Бв (А) и РУ-РИу-Ху1 (Б), К - контрольный ФП на основе исходного штамма, М - белковый маркер
Т а б л и ц а 1
Содержание целевых белков в сухих ФП, %
Ферментный препарат Фитаза А, A. niger ЭГ II, P verruculosum Ксиланаза Е, P canescens Другие белки
PV-Phy-EG 25 14 - 61
PV-Phy-Xyl 9 2 36 53
PV-контроль - 3 - 97
Т а б л и ц а 2
Активность (ед./г) по отношению к разным субстратам и содержание белка (мг/г) в ФП, полученных с помощью рекомбинантных штаммов-продуцентов и штамма-реципиента P. verruculosum 537 niaD
Ферментный препарат Белок, мг/г КМЦ ед./г Р-Глюкан, ед./г Ксилан, ед./г Фитат, ед./г
PV-Phy-EG 694±21 3105±93 2837±104 5621±169 43134±1294
PV-Phy-Xyl 638±19 663±20 663±20 18996±570 31208±936
PV-Phy-EG-Xyl 605±17 3361±118 3020±90 14540±436 39461±1183
PV-контроль 850±20 7150±150 5230±110 12600±900 -
ФП, не обладающим фитазной активностью. Значения общей активности по отношению к КМЦ и Р-глюкану новых ФП различались. Для ФП РУ-РИу-ЕО эти показатели были выше, чем для контрольного ФП, а в случае ФП РУ-РИу-Ху1 они были существенно ниже контроля, что согласуется с ферментным составом ФП, представленным в табл. 1.
Общая ксиланазная активность для ФП РУ-РИу-Ху1 с рекомбинантной ксиланазой была в 1,5 раза выше, чем у контрольного ФП, но ксиланазная активность ФП РУ-РИу-ЕО была ниже контроля, что также согласуется с составом ФП (табл. 1). Поскольку активность по отношению к КМЦ и Р-глюкану характеризует эндоглю-каназную активность, а по отношению к кси-
лану - ксиланазную, то приведенные в табл. 2 данные свидетельствуют о возрастании содержания в новых ФП соответствующих целевых экспрессируемых ферментов.
Для получения ферментных препаратов, содержащих три рекомбинантных фермента было необходимо создать штамм-реципиент на основе полученного дуплета. Для этого был выбран штамм, продуцирующий рекомбинантные фитазу и эндо-1,4-Р-глюканазу - PV-Phy-EG (PhyEG36). Для этого был применен современный метод геномного редактирования CRISPR/CAS, адаптированный нами ранее для создания реципиентных штаммов [16]. Был осуществлен дизайн направляющей РНК для гена niaD Aspergillus niger, поскольку
AnniaD Клон 1 Клон 3
Клон 4
protospacer |РАМ|
tttcctcaaaggcttcgcactccgtaggatatctgc
tttcctcaaaggcttcgcac tttcctcaaaggcttcgcac tttcctcaaaggcttcgcact
ccgtaggatatctgc ccgtaggatatctgc accgtaggatatctg
Рис. 3. Выравнивание фрагментов гена АппгаВ, содержащих мутации в районе протоспейсера, у клонов, отобранных после трансформации плазмидой рвС8
схема трансформации исходного штамма P. verruculosum 537, используемого для получения «дуплетных» вариантов PhyEG и PhyXyl предполагала использование плазмиды pSTA10 с геном нативной нитратредуктазы A. niger для восстановления протототрофности штамма после трансформации.
После трансформации штамма P. verruculosum PhyEG36 по описанной выше методике было получено около тридцати колоний, не способных к росту на МС с нитратом натрия в качестве источника азота. Девять трансформантов были проверены на наличие мутации в рекомбинантном гене Annia D. В результате в трех случаях были обнаружены мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания (рис. 3). Таким образом, нами был получен штамм-реципиент, экспрессирующий рекомбинантные фитазу и
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bautil A., Verspreet J., Buyse J., Goos P., Bedford M.R., Courtin C.M. // Poult Sci. 2020. Vol. 99. N 5. P. 2555-2565 (DOI: 10.1016/j.psj.2019.12.041).
2. Гильмуллина Л.Ф., Пономарева М.Л., Пономарев С.Н., Маннапова Г.С. // Химия растительного сырья. 2021. № 1. С. 27-43.
3. Bohn L., Meyer A.S., Rasmussen S.K. // J. Zheijang Univ. Sci. 2008. B. 9. P. 165-191.
4. Синицына О.А., Гусаков А.В., Окунев О.Н., Серебряный В.А., Вавилова Е.А., Винецкий Ю.П., Синицын А .П. // Биохимия 2003. Т. 68. Вып. 12. C. 1631-1638.
5. Синицын А.П., Зоров И.Н., Короткова О.Г., Мерзлов Д.А. // Птицеводство. 2016. № 1. С. 1924.
6. Денисенко Ю.А., Мерзлов Д.А., Гусаков А.В., Чекушина А.В., Синицын А.П. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2015. Т. 56. № 6. С. 348.
7. Morozova V.V., Gusakov A.V., Andrianov R.M. et al. // J. Biotechnol. 2010. Vol. 5. P. 871.
8. Wyss M., Brugger R., Kroneneberger A., Remy R., Fimbel R., Oesterhelt G., Lehmann M., van Loon A.P.G.M. // Appl. Environ. Microbiol. 1999. Vol. 65. Р. 367-373.
9. Пат. РФ 2378372 С2, опубл. 10.01.2010. Бюл. № 1.
10. Синицын А.П., Синицына О.А., Зоров И.Н., Рожкова А.М. // Прикл. биохим. микробиол. 2020. T. 56. № 6. С. 551-560.
эндо-1,4-Р-глюканазу для последующего использования в получении многокомпонентных ферментных комплексов.
На основе нового реципиентного штамма Р. verruculosum РИуБО36 ДшаЭ с помощью метода плазмидной трансформации был получен штамм-продуцент трех рекомбинантных ферментов РУ-РИу-БО-Ху1, продуцирующий одновременно фитазу, эндо-1,4-Р-глюканазу и эндо-1,4-Р-ксиланазу. Показано, что новый штамм обладает целевой активностью по отношению к ксилану бука, КМЦ, Р-глюкану ячменя и фита-ту натрия (табл. 2). В дальнейшем планируется проведение прикладных экспериментов, включающих опытные испытания новых комплексных ферментных препаратов на основе новых штаммов в кормлении моногастричных животных и птицы.
11. Dandan Li, Yu Tang, Jun Lin and Weiwen Cai Methods for genetic transformation of filamentous fungi // Microb Cell Fact. 2017. Vol. 16. P. 168.
12. Ruiz-Diez B. // J. Appl. Microb. 2002. Vol. 92. P. 189-295.
13. Aslanidis C., de Jong, P.J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR) // Nucleic Acids Res. 1990. Vol. 18. P. 6069-6074 (DOI: 10.1093/ nar/18.20.6069).
14. Proteome Research: Mass Spectrometry - Principles and Practice. Ed. James P. Heidelbeg, 2001.
15. Gusakov A.V., Semenova M.V., Sinitsyn A.P. // J. Anal. Chem.. 2010. Vol. 65. N 14. P. 1446-1461.
16. Kislitsin V.Yu., Chulkin A.M., Zorov I.N., Denisenko Y.A., Sinitsyn A.P., Rozhkova A.M. // Biores. Technol. Rep. 2022. Vol. 18. P. 1010-1023.
17. Aleksenko A., Makarova N., Nikolaev I., Clut-terbuck A. // Curr. Genet. 1995. Vol. 28. P. 474-478.
18. Kislitsin V.Yu., Chulkin A.M., Zorov I.N., Denisenko Y.A., Sinitsyn A.P., Rozhkova A.M. // Biores. Technol. Rep. 2022. Vol. 18. P. 101023.
19. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика // М., 1991. C. 544.
20. Engelen A.J., van der Heeft F., Randsdorp P.H., Smit E.L. // J. AOAC Int. 1994. Vol. 77. P. 760-764.
21. Синицын А.П., Гусаков А .В., Черноглазов В.А. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов // М., 1995. 144 с.
Информация об авторах
Короткова Ольга Генриховна - науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. хим. наук, [email protected];
Рожкова Александра Михайловна - ст. науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, науч. сотр. кафедры химической энзимологии МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук, [email protected];
Кислицин Валерий Юрьевич - мл. науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, аспирант, [email protected];
Синицына Ольга Аркадьевна - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук, [email protected];
Денисенко Юрий Андреевич - науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. хим. наук, [email protected];
Марочкина Мария Михайловна - студентка химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, [email protected];
Зоров Иван Никитич - ст. науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии МГУ имени М.В. Ломоносова, канд. хим. наук, [email protected];
Шашков Игорь Александрович - науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. хим. наук, [email protected];
Сатрутдинов Айдар Дамирович - науч. сотр. лаборатории биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. биол. наук, [email protected];
Синицын Аркадий Пантелеймонович - зав. лаб. на кафедре химической энзимологии МГУ имени М.В. Ломоносова и зав. лаб. биотехнологии ферментов Федерального исследовательского центра «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, докт. хим. наук, профессор, [email protected].
Вклад авторов
Все авторы сделали эквивалентный вклад в подготовку публикации. Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Статья поступила в редакцию 05.09.2022; одобрена после рецензирования 12.10.2022; принята к публикации 14.10.2022.
