CC BY
39
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
Трансфекция ЭСК линии Е14 npe-miR-296 привела к повышению экспрессии следующих маркеров дифферен-цировки: Fgf5, Sox1, Mixll и Kdr. В присутствии рети-ноевой кислоты такая трансфекция также приводила к ускорению запуска экспрессии эктодермальных маркеров Sox1, Fgf5 и Otx2, резкому снижению экспрессии Nanog, а также некоторому снижению количеств мРНК белков 0ct4 и Sox2. В течение трех суток после трансфекции клетки приобретали характерные для дифференцирующихся в эктодермальном направлении ЭСК черты, распластывались по субстрату, лишались способности к синтезу щелочной фосфатазы и способности формировать колонии. При этом, что весьма логично предположить, двойная трансфекция клеток npe-miR-296 и мутантным геном nanog, чья мРНК не имеет сайтов связывания микроРНК, позволяла ЭСК сохранить плюрипотентность и способность к самообновлению, равно как и их морфологические характеристики.
Точно также трансфекция npe-miR-470 приводила к изменению фенотипа ЭСК через трое суток, снижению экспрессии щелочной фосфатазы и повышению экспрессии несколько иного спектра эктодермальных диф-ференцировочных маркеров, а именно Fgf5, Nés и 0tx4.
При блокировании в ЭСК функционирования микроРНК, клетки практически переставали реагировать на индукцию дифференцировки с помощью ретиноевой кислоты.
Эту работу можно по праву назвать выдающейся: авторы провели несколько серий весьма убедительных экспериментов с большим количеством контрольных опытов, показав, что микроРНК играют ключевую роль в диффе-ренцировке ЭСК и, таким образом, являются факторами, регулирующими процесс эмбрионального развития на самых ранних его этапах. Связываясь с большим числом сайтов на мРНК помимо консервативных последовательностей в ее З’-области, они могут осуществлять сложные взаимодействия со своими мишенями, реализуя, по-видимому, видоспецифическую программу развития ЭСК.
В последний год по данным US Public Library of Medicine (13) по изучению микроРНК было проведено более тысячи работ в самых разных областях — от биологии старения и фундаментальных вопросов эмбриогенеза, до онкологии и других клинических направлений. Видимо, в последующие несколько лет интерес к этим небольшим молекулам не ослабнет, так как их роль в решении фундаментальных и прикладных проблем биологии и медицины очевидна.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Bartel D.P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 2004; 116: 281-97.
2. Elbashir S.М., Lendeckel W., Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 2001; 15: 188—200.
3. Hammond S.M. Dicing and slicing: the core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 2005; 579: 5822—9.
4. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nature Genet. 2000; 24: 372-6.
5. Okumura-Nakanishi S., Saito М., Niwa H., Ishikawa F. Oct-3/4 and Sox2 regulate Oct-3/4 gene in embryonic stem cells. J. Biol. Chem. 2005; 280: 5307-17.
6. Pan G., Thomson J.A. Nanog and transcriptional networks in embryonic stem cell pluripotency. Cell Res. 2007; 17: 42—9.
7. Miranda K.C., Fluynh T., Tay Y. et al. A pattern-based method for
the identification of microRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell 2006; 126: 1203-17.
8. Slack F.J., Basson M., Liu Z. et al. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Mol. Cell 2000; 5: 659—69.
9. Lee R.C., Feinbaum R.L., Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 1993; 75: 843-54.
10. Bentwich I. Prediction and validation of microRNAs and their targets. FEBS Lett. 2005; 579: 5904-10.
11. Rajewsky N. MicroRNA target predictions in animals. Nature Genet. 2006; 38: S8-13.
12. Tay Y.M., Tam W.L., Ang Y.S. et al. MicroRNA-134 modulates the differentiation of mouse embryonic stem cells, where it causes post-transcriptional attenuation of Nanog and LRFI1. Stem Cells 2008; 26: 17—29.
13. http://www.pubmed.com
Подготовила А.С. Григорян
По материалам: Tay Y., Zhang J„ Thomson A.M., Lim B„ Rigoutsos I. MicroRNAs to Nanog, 0ct4 and Sox2 coding regions
modulate embryonic stem cell differentiation. Nature 2008; 455 (7216): 1124-8
КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ
Новые данные об эффективности трансплантации клеток печени пациентам с синдромом Криглера - Найяра
Синдром Криглера — Найяра (СКН) 1 типа является аутосомно-рецессивным заболеванием, связанным с мутацией гена 1ЮТ1А1, которая приводит к полному отсутствию активности фермента печени уридиндифос-фатглюкоронилтрансферазы (УДФГТ) и, как следствие, к накоплению неконъюгированного билирубина в крови (выше 200 мкмоль/л). Билирубин аккумулируется в ядрах серого вещества головного мозга, что является причиной судорог, опистотонуса, нистагма, атетоза и иной неврологической симптоматики. Манифестация
заболевания наступает в первые часы жизни. Больные чаще погибают в течение первого года. Изменений печени (биохимических, гистологических) как правило обнаружить не удается. Проба с фенобарбиталом не дает результата (фенобарбитал индуцирует активность УДФГТ, но в связи с отсутствием этого фермента при данном синдроме препарат не имеет точки приложения).
При синдроме Криглера — Найяра 2 типа манифестация наступает несколько позже — в первые месяцы жизни. Проявления сходны с синдромом 1 типа, но менее
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, Ni 4, 2008
■ И I II II
Новости клеточных технологий
тяжелые, т.к. УДФГТ присутствует в гепатоцитах, хотя активность ее значительно снижена. Уровень неконъюгиро-ванного билирубина в крови не достигает 200 мкмоль/л. Достаточно эффективны фенобарбитал и фототерапия.
В настоящее время использутюся несколько способов лечения синдрома Криглера — Найяра 1 типа. Наиболее эффективным является ортотопическая трансплантация печени. Ограничение количества донорских органов, их высокая стоимость делают его недоступным для большей части больных. Кроме того, 15% пациентов перенёсших операцию нуждаются в повторной пересадке органа, в связи с отторжением трансплантата или развитием инфекционных заболеваний, вынуждающих остановить иммуносупрессию [1].
Некоторые успехи были достигнуты при использовании генной терапии в экспериментах на животных. Им инъецировали лентивирус, который способен экспрессировать в клетках печени под действием специфического промотора фермент УДФГТ. Однако в настоящее время данный метод ограничивается выработкой у реципиента фермент-специфичных антител, в связи с чем продолжительность эффекта не превышает года [2—4].
Терапия клетками печени появилась как альтернативное направление в лечении синдрома Криглера — Найяра 1 типа, и занявшая промежуточное место между генной терапией и ортотопической пересадкой органа. Преиму-
щества данного метода состоят в том, что клетки могут быть доставлены в печень без лишнего операционного вмешательства, и обеспечить достаточную выработку фермента для поддержания непрямого билирубина в сыворотке крови в норме. Помимо этого, проблема донорства не стоит здесь так остро как при трансплантации целого органа. Новые данные об эффективности данного метода были опубликованы минувшим летом бельгийскими врачами под руководством Е.М. Бока!.
К настоящему времени уже накоплен некоторый опыт в данной области. Он включает в себя как многочисленные эксперименты на животных, так и клинические исследования. В качестве объекта для эксперимента используются ген-модифицированные животные с мутацией гена 1ЮТ1А1. Наилучшие результаты были достигнуты, когда трансплантации клеток предшествовало запланированное повреждение печени, что создавало регенеративный стимул для клеток [5, 6]. При этом наблюдалось снижение билирубина сыворотки крови на 13—38% в течение месяца.
Первая демонстрация клинической эффективности метода относится к 1998 г., когда в Английском Королевском госпитале 7,5x108 жизнеспособных клеток печени были инъецированы пациенту с СКН 1 типа в возрасте 10 лет [1 ]. После этого в течение 11 мес. наблюдалось снижение уровня неконъюгированного билирубина в
УДФГТ - уридиндифосфатглюкоронилтрансфераза БМГ - билирубинмоноглюкоронид
УДФ - уридиндифосфат БДГ - билирубиндиглюкоронид
Механизмы «утилизации» билирубина в печени
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N» 4, 2008
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
плазме крови на 27%. В желчи был также идентифицирован прямой билирубин, что свидетельствует о наличии ферментативной активности УДФГТ.
В 2008 г. были проведены новое клиническое исследование, в котором лечение получили два пациента — девочки в возрасте года и 9 лет. Первая пациентка получила 14 трансфузий гепатоцитов, взятых от одного донора. Установлено, что уровень непрямого билирубина у нее снизился с 375 ммоль/л до 207 ммоль/л, но через 4 мес. он стал стремительно расти. Девочке была произведена ортотопическая пересадка печени.
Пациентке 9 лет было проведено 18 трансфузий, полученных от 3 различных доноров. После трансплантации клеток печени уровень непрямого билирубина опустился с 370 ммоль/л до 220 ммоль/л. Однако, спустя 6 мес. его концентрация снова возросла до предоперационного значения, в связи с чем была произведена ортотопическая пересадка печени.
Показано отсутствие ранних послеоперационных осложнений, что свидетельствует в пользу безопасности данного метода. Вместе с тем, отмечается короткая продолжительность лечебного эффекта, что может быть связано с неблагоприятными аутоиммунными реакциями, недостаточной функциональной активностью трансплантируемых клеток и их низкой репопуляционной способностью. Одним из важнейших направлений в данной области является разработка средств иммуннокоррекции
реакций «хозяин-трансплантат». Как было выяснено такие иммуносупрессоры как Такролимус, Рапамицин и многие другие оказывают негативное воздействие на пролиферативные возможности трансплантируемых клеток печени, что ограничивает их использование [7]. Наиболее перспективным решением данной проблемы остаётся использование инкапсулированных клеток [8]. Однако, здесь учёные сталкиваются с проблемой создания адекватного интракапсулярного микроокружения, позволившего бы надолго сохранить функциональную активность клеток [9].
Следовательно, на данном этапе своего развития введение гепатоцитов как способ лечения синдрома Криг-лера-Найяра является эффективным методом для поддержания жизнеспособности пациентов ожидающих ортотопическую пересадку печени. После трансплантации гепатоцитов, у пациентов значительно улучшаются показатели функциональной активности органа, снижается необходимость в других процедурах (фототерапия, кровопускания, обменные переливания крови, альбумина, плазмаферез), что улучшает их качество жизни. Возможно в будущем трансплантация клеток печени будет являться одним из наиболее эффективных способов лечения не только синдрома Криглера — Найяра, но и иных метаболических нарушений печени, таких как гиперхо-лестеролемия, нарушения синтеза факторов свёртывания крови и др.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Fox I.S., Chowdhury J.R., Kaufman S.S. et al. Treatment of the Crigler-Najjar syndrom type I with hepatocyte transplantation. Engl. J. Med. 1998; 338: 1422-6.
2. Kautman S.S., Wood R.P., Show P.W. jr., Markin R.S. Orthotopic liver transplantation for type I Crigler-Najjar syndrome. Flepatology 1986; 6: 1259-62.
3. Sokal E.M., Silva E.S., Flermans D. Orthotopic liver transplantation for Crigler-Najjar type I disease in six children. Traspant. 1995; 6D: 1035—58.
4. Evans Fl.M., Kelly D.A., Me Kierman P.S., Flubscher S. Progressive histological damage in liver allografts following pediatric liver transplantation. Flepatology 2DD6; 43: 1109—17.
5. Makouka L., Falk J.A., Falk R.E. Allogenic intrasplenic hepatocyte transplantation. Transplant. Proc. 1987; 19: 1002—3.
6. Cubero E.S., Maganto P., Ortiz A. Flepatic proliferation in Gunn rats transplanted with hepatocytes. Cell Prolis. 2005; 38; 134—46.
7. Wu Y.M., Joseph B., Gupta S. Immunosupression using mTOR inhibition mechanism affects replacement of rat liver with transplanted cells. Flepatology 2006; 44: 410—9.
8. Dixit V., Darnasi R., Arthur M. et al. Cryopreserved microencapsulated hepatocytes-transplantation stadies in Gunn rats. Transplant. 1993; 55: 616—22.
9. Liu Z.C., Chang T.M. Coencapsulation of hepatocytes and bone marrow stem cells. Int. J. Artif. Organs 2003; 26: 491—7.
Подготовил И.Л. Плакса
По материалам: Lysy РА., Najimi М., Bourgols A. et al. Liver cell transplantation for type I Crigler-Najjar syndrome. Update and perspectives. World J. Gastroenterol. 2008:14(22): 3464-70
Трансплантированные фетальные клетки вовлечены в патологический процесс при болезни Паркинсона
Болезнь Паркинсона — хроническое прогрессирующее дегенеративное заболевание центральной нервной системы, проявляющееся, главным образом, нарушением произвольных движений в виде гипокинзии, мышечной ригидности, тремора кистей рук, нижней челюсти, языка, головы и постуральных расстройств [1 ]. Кроме того, клиническая картина заболевания включает речевые расстройства (мягкость, хриплость, монотонность речи), нарушения глотания и связанные с ними слюнотечение. Больных отличает маскообразное лицо (гипомимия), бесконтрольные непроизвольные движения даже в сидячем положении (акатизия), депрессивное состояние и расстройство когнитивных функций [1, 2].
До настоящего времени этиология болезни Паркинсона в полной мере не ясна. Определённую роль играют повреждения головного мозга — травмы, инсульты. К настоящему времени наибольшее значение отводится генетическим дефектам, наличие которых обусловливает повышение восприимчивости нейронов к токсическому действию ряда веществ (пестицидов, соединений марганца и железа), индуцирущих генерацию активных форм кислорода [3] или связывающих нейромеланин [4].
В любом случае, ключевым звеном патогенеза заболевания является снижение уровня дофамина в экстра-пирамидной системе и гибель дофаминэргических нейронов черной субстанции среднего мозга, связанных со
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, Ni 4, 2008
