CC BY
26
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
Наиболее очевидным объяснением этого может служить тот факт, что до 90% гепатоцитов взрослого организма изначально полиплоидны (тетра- или октаплоидны) [18]. Это означает, что несмотря на эффективность инфицирования гепатоцитов аденовирусными векторами (требуется 1—4 вектора на клетку), существует реальная опасность дисфункции клеточного генома !РБ-клеток вследствие его полиплоидное™.
В целом, обе работы показали, что !РБ-клетки могут быть получены без использования интегрирующихся векторов, хотя и в значительно меньшем количестве. Так, по данным Б. Уатапака, используя ретровирусы, можно полностью перепрограммировать более 100 из 1x108 клеток, трансфецированных генами трех факторов плюрипотентности, или более 10ОО в случае использования четырех факторов. В то же
время, новая технология позволила получить от 1 до 29 колоний !РБ-клеток, т. е. выход перепрограммированных клеток составил 0,0001^0,001%, что почти на два порядка ниже, чем при использовании интегрирующихся векторов.
Исследования К. НосИесИтдег и Б. Уатапака, несомненно, стали существенным шагом к направленному получению плюрипотентных стволовых клеток без использования методов, существенным недостатком которых является потенциальная дестабилизация клеточного генома. Таким образом, перепрограммирование соматических клеток без векторной интеграции может стать ведущим направлением в получении !РБ-клеток — одной из главных, и, несомненно, самой популярной на сегодняшний день альтернативы эмбриональным стволовым клеткам человека.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Yamanaka S. Strategies and new developments in the generation of patient-specific pluripotent stem cells. Cell Stem Cell 2007; 1(1): 39—49.
2. Takahashi K., Yamanaka S.. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006; 126(41: 663-76.
3. Бозо И.Я. Новое направление получения ЗСК. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2DD7; 11(4): 9—11.
4. Бозо И.Я. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2DD8; 111(1): 22—3.
5. Kennedy D. Breakthrough of the year. Science 2DD7; 318(5858): 1833. [Full Text]
6. Yu J., Vodyanik М., Smuga-Otto K. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2DD7; 318(5858): 1917-20.
7. Nakagawa М., Koyanagi М., Tanabe K. et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Мус from mouse and human fibroblasts. Nat. Biotechnol. 2DD8; 26(1): 101—6.
8. Huangfu D., Osafune K., Maehr R. et al. Induction of pluripotent stem cells from primary human fibroblasts with only 0ct4 and Sox2. Nat. Biotechnol. 2DD8; 26: 1269-75.
9. Liao J., Wu Z., Wang Y. et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem tiPS] cells from human somatic cells by a
combination of six transcription factors. Cell Res. 2DD8; 18(5): 600—3.
10. Park I., Zhao R., West J. et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature 2DD8; 451 [71751: 141—6.
11. Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 2DD7; 448(71511: 313—7.
12. Aoi T., Yae K., Nakagawa М.. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science 2DD8; 321 [58891: 699— 702.
13. Liu S. iPS cells: a more critical review. Stem Cells Dev. 2008; 17C3): 391-7.
14. Liu S. Towards a balanced view on iPS cells. Logical Biology 2008; 8t11: 32-8.
15. Lengner C., Camargo F., Hochedlinger K. et al. 0ct4 expression is not required for mouse somatic stem cell self-renewal. Cell Stem Cell 2007; 1 [41: 403-15.
16. Григорян A.C. Экспрессия фактора 0ct4 не требуется для самообновления соматических стволовых клеток. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2008; IIIC11: 21—2.
17. Kim J., Zaehres FI., Wu G. et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature 2008 ; 454(7204): 646-50.
18. Guidotti J., Brngerie 0., Robert A. et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. J. Biol. Chem. 2003; 278(21): 19095-101.
Подготовил А А. Лелявский
По материалам: Okita K„ Nakagawa M„ Hyenjong H„ Ichisaka T„ Yamanaka S. Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors. Science 2008; 322(5903]: 949-53. Stadtfeld M„ Nagaya M„ Utikal J„ Weir G„ Hochedlinger K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated
Without Viral Integration. Science 2008; 322(5903): 949-53
МикроРНК модулируют активность факторов плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток -Nanog, 0ct4 и Sox2
МикроРНК — это короткие последовательности из 20^25 рибонуклеотидов, основной функцией которых является подавление трансляции определенных матричных РНК (мРНК), что приводит к остановке синтеза белка (1^2). В течение многих лет они привлекают интерес научного мира, являясь одним из основных регуляторов экспрессии генов. Считается, что микроРНК связываются с нетранслируемыми областями мРНК, расположенных на З’-конце, что справедливо для большинства микроРНК (3, 4). Исключений из этого правила очень немного
(5, 6). Вместе с тем вопрос о мишенях микроРНК остается крайне важным, так как детальное знание о механизмах их действия в каждом конкретном случае совершенно необходимо для понимания регуляции экспрессии генов, что неразрывно связано со всеми процессами, происходящими в клетке — как нормальными, так и патологическими.
Научная группа У. Тау длительное время занимается изучением функциональных особенностей микроРНК. Именно в их лаборатории была предсказана возможность
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N» 4, 2008
■ И I II II
^шлп
Новости клеточных технологий
существования многочисленных специфических сайтов связывания микроРНК в пределах мРНК (7). В качестве модельных генов были выбраны папод, ой4 и зох2, которые кодируют три основных фактора плюрипо-тентности мышиных эмбриональных стволовых клеток ИСК), а также определяют начало их дифференцировки С8—11). В своей последней работе авторы индуцировали дифференцировку ЭСК линии Е14 с помощью рети-ноевой кислоты и обнаружили, что при этом, спустя некоторое время, происходит существенное повышение количества в клетке лишь трех микроРНК из всех известных: ггпВ-296, ггпВ-470 и ггнВ-134. Каждая из них, как было показано, связывается сразу с несколькими сайтами на мРНК белков 1Мапод, 0сЬ4 и Бох2, а именно:
— ггнВ-296 имеет два комплементарных участка на мРНК 1Мапод;
— ггпВ-470 связывается с шестью сайтами на мРНК |\1апод и с тремя сайтами на мРНК Ск±4;
— ггнМ 34 имеет пять последовательностей-мишеней на мРНК Бох2.
Такое количество сайтов связывания предполагает, что эти три микроРНК могут регулировать процессы поддержания плюрипотентности и дифференцировки ЗСК в разных вариантах в зависимости от уровня их экспрес-
сии и соотношений. Трансфекция ЗСК пре-ггпВ-296, пре-ггпВ-470 и пре-ггнМ 34 по отдельности, то есть искусственное увеличение в клетках концентрации одной из микроРНК, приводила к резкому снижению синтеза соответствующего белкового продукта. Интересно, что в контрольных экспериментах исследователи провели двойную трансфекцию дифференцированных клеток линии 293Т генами папод, эох2 и осЬ4 и соответствующими пре-микроРНК, показав, что в таком случае полностью дублируются события, происходящие в ЗСК. Трансфекция как ЗСК, так и клеток линии 293Т другими пре-микроРНК не влияла на экспрессию генов трех выбранных транскрипционных факторов. Внесение же мутаций в сайты связывания ггпВ-296, ггнВ-470 и ггнМ 34 на мРНК 1Мапод, Ск±4 и Бох2 приводило к невозможности подавления трансляции, и в клетке обнаруживались белковые продукты интересующих генов.
Основной вопрос, однако, оставался в индукции с помощью микроРНК дифференцировки ЗСК и изменения их морфологии. Раньше У. Тау и соавт. было показано, что ггпМ 34, подавляя экспрессию гена папод, запускает дифференцировку ЗСК (12). Относительно же двух других микроРНК до настоящего времени ничего известно не было.
МикроРНК модулируют активность факторов плюрипотентности эмбриональных стволовых клеток
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, 1У< 4, 2008
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
Трансфекция ЭСК линии Е14 пре-ггнВ-296 привела к повышению экспрессии следующих маркеров дифференцировки: Рд!5, Бох1, М!х11 и Кс)г. В присутствии рети-ноевой кислоты такая трансфекция также приводила к ускорению запуска экспрессии эктодермальных маркеров Бох1, Рд!5 и 01ж2, резкому снижению экспрессии |\1апод, а также некоторому снижению количеств мРНК белков Ск±4 и Бох2. В течение трех суток после трансфекции клетки приобретали характерные для дифференцирующихся в эктодермальном направлении ЭСК черты, распластывались по субстрату, лишались способности к синтезу щелочной фосфатазы и способности формировать колонии. При этом, что весьма логично предположить, двойная трансфекция клеток пре-ггпВ-296 и мутантным геном папод, чья мРНК не имеет сайтов связывания микроРНК, позволяла ЭСК сохранить плюрипотентность и способность к самообновлению, равно как и их морфологические характеристики.
Точно также трансфекция пре-ггпВ-470 приводила к изменению фенотипа ЭСК через трое суток, снижению экспрессии щелочной фосфатазы и повышению экспрессии несколько иного спектра эктодермальных диф-ференцировочных маркеров, а именно Рд!5, Ыеэ и 0Ьх4.
При блокировании в ЭСК функционирования микроРНК, клетки практически переставали реагировать на индукцию дифференцировки с помощью ретиноевой кислоты.
Эту работу можно по праву назвать выдающейся: авторы провели несколько серий весьма убедительных экспериментов с большим количеством контрольных опытов, показав, что микроРНК играют ключевую роль в диффе-ренцировке ЭСК и, таким образом, являются факторами, регулирующими процесс эмбрионального развития на самых ранних его этапах. Связываясь с большим числом сайтов на мРНК помимо консервативных последовательностей в ее З’-области, они могут осуществлять сложные взаимодействия со своими мишенями, реализуя, по-видимому, видоспецифическую программу развития ЭСК.
В последний год по данным US Public Library of Medicine (13) по изучению микроРНК было проведено более тысячи работ в самых разных областях — от биологии старения и фундаментальных вопросов эмбриогенеза, до онкологии и других клинических направлений. Видимо, в последующие несколько лет интерес к этим небольшим молекулам не ослабнет, так как их роль в решении фундаментальных и прикладных проблем биологии и медицины очевидна.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Bartel D.P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 2004; 116: 281-97.
2. Elbashir S.М., Lendeckel W., Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 2001; 15: 188—200.
3. Hammond S.M. Dicing and slicing: the core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 2005; 579: 5822—9.
4. Niwa H., Miyazaki J., Smith A.G. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells. Nature Genet. 2000; 24: 372-6.
5. Okumura-Nakanishi S., Saito М., Niwa H., Ishikawa F. Oct-3/4 and Sox2 regulate Oct-3/4 gene in embryonic stem cells. J. Biol. Chem. 2005; 280: 5307-17.
6. Pan G., Thomson J.A. Nanog and transcriptional networks in embryonic stem cell pluripotency. Cell Res. 2007; 17: 42—9.
7. Miranda K.C., Fluynh T., Tay Y. et al. A pattern-based method for
the identification of microRNA binding sites and their corresponding heteroduplexes. Cell 2006; 126: 1203-17.
8. Slack F.J., Basson M., Liu Z. et al. The lin-41 RBCC gene acts in the C. elegans heterochronic pathway between the let-7 regulatory RNA and the LIN-29 transcription factor. Mol. Cell 2000; 5: 659—69.
9. Lee R.C., Feinbaum R.L., Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 1993; 75: 843-54.
10. Bentwich I. Prediction and validation of microRNAs and their targets. FEBS Lett. 2005; 579: 5904-10.
11. Rajewsky N. MicroRNA target predictions in animals. Nature Genet. 2006; 38: S8-13.
12. Tay Y.M., Tam W.L., Ang Y.S. et al. MicroRNA-134 modulates the differentiation of mouse embryonic stem cells, where it causes post-transcriptional attenuation of Nanog and LRH1. Stem Cells 2008; 26: 17—29.
13. http://www.pubmed.com
Подготовила А.С. Григорян
По материалам: Tay Y„ Zhang J„ Thomson A.M., Lim B„ Rigoutsos I. MicroRNAs to Nanog, 0ct4 and Sox2 coding regions
modulate embryonic stem cell differentiation. Nature 2008:455 (7216): 1124-8
КЛИНИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ
Новые данные об эффективности трансплантации клеток печени пациентам с синдромом Криглера - Найяра
Синдром Криглера — Найяра (СКН) 1 типа является аутосомно-рецессивным заболеванием, связанным с мутацией гена 1ЮТ1А1, которая приводит к полному отсутствию активности фермента печени уридиндифос-фатглюкоронилтрансферазы (УДФГТ) и, как следствие, к накоплению неконъюгированного билирубина в крови (выше 200 мкмоль/л). Билирубин аккумулируется в ядрах серого вещества головного мозга, что является причиной судорог, опистотонуса, нистагма, атетоза и иной неврологической симптоматики. Манифестация
заболевания наступает в первые часы жизни. Больные чаще погибают в течение первого года. Изменений печени (биохимических, гистологических) как правило обнаружить не удается. Проба с фенобарбиталом не дает результата (фенобарбитал индуцирует активность УДФГТ, но в связи с отсутствием этого фермента при данном синдроме препарат не имеет точки приложения).
При синдроме Криглера — Найяра 2 типа манифестация наступает несколько позже — в первые месяцы жизни. Проявления сходны с синдромом 1 типа, но менее
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, N» 4, 2008
