CC BY
44
■ И I II II
■TD
Новости клеточных технологий
Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека впервые получены без использования интегрирующейся в геном ДНК
Пролиферативный и дифференцировочный потенциалы эмбриональных стволовых клеток (ЗСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ПРБ-клеток) человека позволяют получить в лабораторных условиях все типы специализированных клеток, присутствующих во взрослом организме человека [1—3]. Однако в случае ЗСК аутогенный материал, как правило, недоступен, в то время как ¡РБ-клетки, созданные с помощью генноинженерных методик из соматических клеток, могут стать ключом для массового применения клеточной терапии различных заболеваний, при которых необходимо восстановить поврежденные в результате травмы или патологического процесса ткани и органы пациента.
Индукция плюрипотентности как у мышиных, так и у человеческих соматических клеток была впервые достигнута интеграцией в их геном комбинаций факторов ой4, зох2, с-Мус, №4, папод и Нп8 [2—4]. В первых разработанных методиках перепрограммирования применялись вирусные векторы, встраивающиеся в ДНК клетки-реципиента [2, 3]. Такие векторы могут провоцировать инсерционные мутации, которые нарушают функции клеток, влияют на дифференцировку в определенных направлениях [2], в некоторых случаях приводят к канцерогенезу [5]. На сегодняшний день существуют экспериментальные работы по получению ¡РБ-клеток животных с помощью аденовирусных векторов, не интегрирующихся в геном, и плазмид [6,7], но эффективность этих методов крайне мала [2, 3].
Недавно появились сообщения сразу о двух способах получения ¡РБ-клеток мыши и человека с последующим удалением из них трансгена. В одном из подходов была применена СгеДохР рекомбинация [8]. Однако рекомбиназа Сге, вырезая из ДНК клетки трансген, оставляет в ней часть вектора, что нежелательно. Во втором случае в качестве носителя генов плюрипотентности использовался транспозон Р1ддуВас, затем схожим образом удалявшийся из дифференцированного потомства ¡РБ-клеток [9]. Несмотря на то, что этот подход — весьма многообещающий, удаление из клеток большого числа копий транспозона, встраивающихся в геном, довольно сложная задача, вряд ли совместимая с клиническими нуждами.
Затем авторы работы отобрали несколько ¡РБ-клонов, которые в процессе пролиферации спонтанно потеряли
эписомный вектор oriP/EBNA1, и подвергли их субклонированию. У субклонов вектор с трансгеном отсутствовал как в хромосомной ДНК, так и в эписомной фракции, что было подтверждено Саузерн-блот-гиб-ридизацией. Морфологически субклоны не отличались от ЗСК, имели нормальный кариотип, экспрессировали специфические для ЗСК маркерные гены (oct4, sox2, папод, Iin28 и проч.) и соответствующие белки. Также они эффективно дифференцировались в производные трех зародышевых листков. Промоторы генов oct4 и папод в этих клетках были деметилированы, как в нормальных ЗСК, в отличие от дифференцированных клеток. В течение семи месяцев культивирования клетки продолжали делиться, не теряя своих свойств и не демонстрируя признаков репликативного старения. С помощью метода DNA-fingerprinting было подтверждено, что клетки произошли из фибробластов кожи.
На данный момент эффективность перепрограммирования и последующего получения клеток со стабильно экспрессирующимся вектором очень низкая — из 106 фибробластов можно получить лишь 3^6 колоний iPS-клеток. Тем не менее, этого достаточно для получения больших количеств плюрипотентных клеток. К тому же, фибробласты легко выделить и культивировать in vitro.
Разные клетки с разной эффективностью подвергаются перепрограммированию [14], поэтому есть вероятность, что будет найден другой тип соматических клеток человека, на основе которого будет проще получить плюрипотентные iPS-клетки с помощью эписом-ных векторов. Также повысить эффективность перепрограммирования возможно добавлением в культуру определенных химических соединений [15]. Руководитель лаборатории Джеймс Томсон считает, что, учитывая стремительный прогресс в этой области клеточной биологии, в скором времени следует ожидать появления сразу нескольких альтернативных методик по получению iPS-клеток, свободных от чужеродного генетического материала. Тогда перед учеными встанет вопрос о том, какой из методов наиболее воспроизводим и при этом не провоцирует генетических или эпигенетических аномалий, поскольку любые аномалии негативно скажутся как на результатах фундаментальных исследований, так и на возможном клиническом применении iPS-клеток.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science 1998; 282: 1145-7.
2. Yu J., Vodyanik M.A., Smuga-Otto K. et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2DD7; 318: 1917-2D.
3. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M. et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2DD7; 131: 861-72.
4. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2DD6; 126: 663-76.
5. Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature 2DD7; 448: 26D-2.
6. Stadtfeld M., Nagaya M., Utikal J. et al. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science 2DD8; 322: 945.
7. Okita K., Nakagawa M., Hyenjong H. et al. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science 2DD8; 322: 949.
8. Kaji K., Norrby K., Paca A. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature 2DD9; In print.
9. Woltjen K., Michael I.P., Mohsen P. et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature 2DD9; In print.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 2, 2009
■ ИМИ!
Новости клеточных технологий
1D. Leight E.R., Sugden B. Establishment of an oriP Replicon Is Dependent upon an Infrequent, Epigenetic Event . Mol. Cell. Biol. 2001; 21: 4149-61.
11. Yates J.L., Guan N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 1991; 65: 483-8.
12. Liao J., Wu Z., Wang Y. et al. Enhanced efficiency of generating induced pluripotent stem tiPS] cells from human somatic cells by a combination of six transcription factors. Cell Res. 2008; 18: 600—3.
13. Evan G.I., Wyllie A.H., Gilbert C.S. et al. Induction of apoptosis in fibroblasts by c-myc protein. Cell 1992; 69: 119—28.
14. Aasen T., Raya A., Barrero M.J. et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 2008; 26: 1276-84.
15. Shi Y., Desponts C., Do J.T. et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic Fibroblasts by 0ct4 and Klf4 with Small-Molecule Compounds. Cell Stem Cell 2008; 3: 568-74.
Подготовила А.С. Гоигорян
По материалам: Yu J„ Hu КSmuga-Ott К. et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector
and transgene sequences. Science 2009; 324 (5928): 797-801
Обнаружены стволовые клетки в яичниках у мышей
До недавнего времени считалось, что образование овогоний в яичниках млекопитающих прекращается до рождения [1—5], однако еще в 2004 г. было показано, что у новорожденных и взрослых мышей яичники способны к восстановлению численности овогоний после экстремальных воздействий [6]. Впоследствии появились предположения о том, что источником этой регенеративной способности могут быть клетки костного мозга и периферической крови, мигрирующие в яичник [7]. Но эти предположения были опровергнуты [8]. Исследователи до сих пор не утвердились во мнении относительно того, какие именно клетки ответственны за восстановление численности фолликулов, и существуют ли в яичниках камбиальные элементы, способные восстанавливать популяцию ОВОГОНИЙ [6, 8—11].
Научная группа К. Zou из Шанхайского Университета (Китай) провела исследование, подтвердившее, что в яичниках мышей, и, возможно, других млекопитающих, присутствуют стволовые клетки, способные к самообновлению и дифференцировке в функциональные овоциты. С помощью иммуногистохимического анализа было показано, что в тканях яичников новорожденных и взрослых мышей присутствуют клетки, положительные по маркеру MVH (mouse vasa homologue), который экспрессируется исключительно в клетках зародышевого пути. По крайней мере, часть этих клеток постоянно и активно пролиферировала: через 1 час после введения пятидневным и взрослым животным маркера пролиферации 5’-бромдезоксиуридина (BrdU) из эпителия их яичников были выделены клетки, несущие двойную метку - BrdU и MVH.
Используя магнитную клеточную сепарацию (MACS), исследователи получили из яичников новорожденных и взрослых мышей MVH+ клетки (при этом количество таких клеток в яичнике новорожденной мыши составило от 200 до 300, а в яичнике взрослого животного — от 50 до 100 клеток). Это были крупные клетки со сферическим ядром диаметром от 12 до 20 мкм, содержащим большое количество нуклеоплазмы, морфологически напоминающие сперматогонии типа А [12]. Чтобы определить, содержит ли популяция MVH+ клеток in vitro делящиеся клетки, в среду их культивирования был добавлен BrdU. Оказалось, что BrdU-позитивные клетки действительно присутствуют. В течение 7 пассажей количество клеток в культуре существенно увеличивалось, при этом формировались компактные колонии.
Морфология клеток и их пролиферативный потенциал никак не изменились по прошествии 25 пассажей. Клетки культивировали на фидере из инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов в присутствии рекомбинантных факторов LIF, трансферрина, путрес-цина, EGF, GDNF и bFGF.
Анализ экспрессии генома, иммуногистохимический и ПЦР -анализ показали, что в выделенных клетках активно экспрессируются гены и продуцируются белки Dazl (специфический для первичных половых клеток РНК-связывающий белок [13]), 0ct4 (характерный для первичных половых клеток транскрипционный фактор [14]) и MVH, но в то же время в них не присутствуют транскрипты и продукты генов дифференцированных половых фолликулов, такие как ZP3 (ген белка блестящей оболочки яйцеклетки 3). Помимо этого, в клетках был высок уровень активности теломеразы, что характерно для стволовых клеток [15]. После культивирования в течение года у 65-80% из них был диплоидный кари-отип (какой кариотип имели остальные клетки, авторы не указывают). В описанных клетках была зарегистрирована активность щелочной фосфатазы — несколько меньшая, чем характерно для эмбриональных стволовых клеток.
Помимо подробной характеристики in vitro, авторы оценили функции данных клеток in vivo. Клетки, транс-фецированные геном флуоресцентного белка GFP, были трансплантированы в яичники самок мышей, предварительно стерилизованных с помощью химиотерапевтических препаратов бусульфана и циклофосфамида, вызывающих гибель клеток зародышевого пути, находящихся на премейотическом и постмейотическом этапах клеточного цикла [7, 16]. Два месяца спустя после трансплантации в яичниках животных с помощью гистологического анализа и анализа флуоресценции было показано присутствие овоцитов на разных стадиях развития, экспрессирующих GFP. У животных из группы контроля яичники после стерилизации не восстанавливались.
Трансплантация стволовых клеток яичников стерилизованным при помощи химиотерапии самкам мышей в 82% случаев в течение 75-110 сут. восстанавливала их фертильность. Потомство, полученное от этих мышей, как показали авторы, не имело никаких аномалий и также было фертильно. В геномной ДНК 29 из 108 новорожденных мышат первого поколения обнаруживался трансген GFP, что было продемонстрировано
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 2, 2009
