CC BY
50
УДК 579.61
Новые 5-модифицированные пиримидиновые нуклеозиды -ингибиторы роста микобактерий
Л.А. Александрова1*, Э.Р. Шмаленюк1, С.Н. Кочетков1, В.В. Ерохин2, Т.Г. Смирнова2, С.Н. Андреевская2, Л.Н. Черноусова2
1 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991, Москва, ул. Вавилова, 32
2 Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН, 107564, Москва, Яузская аллея, 2
*E-mail: [email protected]
реферат Туберкулез (ТБ) является одной из важнейших проблем современного здравоохранения. В связи с появлением новых штаммов M.tuberculosis, на которые стандартные методы лечения практически не действуют, необходим поиск принципиально новых анти-ТБ агентов. Настоящая работа посвящена изучению способности новых аналогов пиримидиновых нуклеозидов ингибировать рост M.tuberculosis. Показано, что 2'-дезокси-, 3'-азидо-2',3'-дидезокси- и 3'-амино-2',3'-дидезокси- производные уридина и цитидина, содержащие в 5-м положении основания протяженные метилоксиалкильные заместители, способны ингибировать рост культуры микобактерий M.tuberculosis H37Rv in vitro. 5-метилоксидодецил-2'-дезоксиуридин продемонстрировал наиболее значительную анти-ТБ активность. В то же время 5'-монофосфаты изученных нуклеозидов не обладали проти-вомикробными свойствами. Наиболее эффективные производные нуклеозидов могут послужить прототипами для создания новых противотуберкулезных препаратов.
ключевые слова туберкулез, Mycobacterium tuberculosis, противотуберкулезные препараты, нуклеозиды, 5-за-мещенные пиримидиновые нуклеозиды, ингибиторы.
список сокращений ТБ - туберкулез, ВИЧ - вирус иммунодефицита человека, МЛУ - множественная лекарственная устойчивость, МИК - минимальная ингибирующая концентрация, КОЕ - колониеобразующая единица.
введение
Туберкулез (ТБ) представляется одной из важнейших проблем современного здравоохранения. В начале XXI в. ТБ - одно из наиболее распространенных инфекционных заболеваний, около трети мировой популяции (более двух миллиардов человек) инфицированы Mycobacterium tuberculosis. По данным ВОЗ, около 9 млн человек заболевает ежегодно, более 2 млн человек в год умирает от ТБ; из них 10 % инфицированы ВИЧ [1, 2]. Заражение ВИЧ повышает шанс реактивации латентной формы туберкулеза [3], и в то же время вызывает быстрое развитие ТБ вскоре после (ре)инфицирования [4]. Риск перехода латентной формы туберкулеза в активную для больных СПИДом достигает 50 %, а для остального населения - всего 10 %.
В начале 1950-х годов были разработаны эффективные и доступные методы лечения ТБ, основанные на использовании различных комбинаций лекарств. Иногда в схему химиотерапии может входить более десяти противотуберкулезных препаратов [5]. С этого времени широкое применение противотуберкулезных препаратов и вакцинации привели к значительному снижению смертности от ТБ. С другой стороны, использование лекарственных средств способствовало отбору штаммов, устойчивых одновремен-
но к препаратам нескольких классов. Больные СПИДом, наркоманы и пациенты, перенесшие трансплантацию, имеют крайне ослабленный иммунитет, и поэтому становятся жертвами ТБ. Все это привело к тому, что в конце 1980-х годов частота случаев ТБ в мире снова стала расти. В 1993 г. ВОЗ объявила в связи с ТБ о глобальной критической ситуации. Особо следует отметить новые штаммы Mycobacterium tuberculosis: с широкой лекарственной устойчивостью (XDR) и множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) [1], на которые стандартные схемы химиотерапии практически не действуют. МЛУ-ТБ обычно возникает как результат неправильного лечения, когда пациенты получают противотуберкулезные препараты в недостаточном количестве [6]. Кроме того, с начала терапии ТБ до выздоровления обычно проходит не менее полугода, и все это время контакты с инфицированным могут приводить к заражению [5]. Основным фактором, определяющим развитие резистентности под воздействием противотуберкулезных препаратов, является селекция лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий, несущих мутации в геноме.
Для России ТБ представляет одну из важнейших проблем, поскольку на сегодняшний день его распространен-
ность составляет 190.5 случая на 100 тысяч населения, а заболеваемость - 85.1 на 100 тысяч населения, смертность - 17.9 на 100 тысяч. При этом, согласно статистическим данным МЗ и СР РФ, в России частота МЛУ-ТБ среди впервые выявленных составляет 13.6 %, а среди больных с рецидивами - 28.8 % [7]. В связи с вышесказанным необходим поиск принципиально новых противотуберкулезных препаратов.
Терапия вирусных инфекций часто основывается на использовании производных природных нуклеозидов [8]. Противотуберкулезная активность нуклеозидов до недавнего времени не была выявлена. В последнее время появились сообщения о нескольких группах модифицированных нуклеозидов, продемонстрировавших на экспериментальных моделях заметное антимикобактериальное действие [9-14].
Недавно показано, что 5-модифицированные пирими-диновые нуклеозиды с протяженными 1-алкинильными заместителями обладают ингибирующей активностью в отношении Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis in vitro [11-14]. Наилучшую антимикобактериаль-ную активность продемонстрировали 5-(1-додециниль-ные) и 5-(1-тетрадецинильные) производные нуклеозидов. Изучение влияния модификации углеводного фрагмента на противобактериальные свойства 5-модифицированных нуклеозидов показало, что практически все 2'-дезокси-, 2',3'-дидезокси-, 2',3'-дидезокси-3'-фтор-, 2',3'-дидезокси-2'-фтор- нуклеозиды, а также ациклические и арабино-нуклеозиды с протяженными 1-алкинильными заместителями демонстрировали анти-ТБ-активность [11-14]. Настоящая работа посвящена изучению способности инги-бировать рост Mycobacterium tuberculosis синтезированными нами 2'-дезокси-, 3'-азидо-2',3'-дидезокси- и З'-амино-2',3'-дидезокси- пиримидиновыми нуклеозидами, содержащими в 5-м положении основания протяженные метилоксиалкильные заместители.
материалы и методы
Исследуемые соединения (1 - 10, рис. 1). 5-(1-додеци-нил)- и 5-(1-тетрадецинил)-2'-дезоксиуридин (1 и 2,соот-ветственно), используемые в качестве контроля, получены
по методу [11]. 5-метоксиалкильные производные пирими-диновых нуклеозидов (6-10) синтезированы по разработанному нами методу [15], 5'-монофосфаты нуклеозидов (3-5) по методу [15-16].
Микобактериальный штамм. Для проведения испытаний препаратов использовали чувствительный к противотуберкулезным препаратам лабораторный штамм M.tuberculosis H37Rv. Микобактерии были переведены в суспензию одиночных клеток в одинаковой фазе роста и стандартизованы по КОЕ [17]. В работе использовали обогащенную жидкую питательнную среду Дюбо (Difco).
Оценка эффективности препаратов. Изучение влияния препаратов на рост микобактериального штамма проводили на автоматической системе детекции роста Bactec MGIT 960 (BD, USA) в течение 24 дней. Микобактериаль-ную суспензию в объеме 500 мкл инокулировали в 7.9 мл питательной среды. Конечная концентрация M.tuberculosis в образце составляла 105-106 КОЕ/мл. Каждую из концентраций, включая контрольные пробирки без препарата, исследовали при трех повторах.
Антимикобактериальное действие препаратов оценивали по динамике роста M.tuberculosis H37Rv в присутствии различных концентраций препаратов по сравнению с ростом штамма на среде, не содержащей препаратов [17]. Детекция роста проводилась каждый час автоматически и регистрировалась с помощью программного обеспечения Epicenter (BD, USA). Рост микобактериальных клеток выражался в относительных единицах флюоресценции (ОЕФ).
результаты и обсуждение
Нами изучена способность ингибировать рост M.tuberculosis синтезированных производных 2'-дезоксинуклеозидов (6-10, рис. 1), в которых протяженный линейный алкиль-ный заместитель введен в 5-е положение пиримидинового основания через метилокси-группу, что обеспечивает большую подвижность углеводородного радикала по сравнению с 1-алкинильными производными (1 и 2), описанными в литературе [11-14]. Разработанный нами метод синтеза 5-метоксиалкильных производных пиримидиновых ну-клеозидов [15] значительно проще и дешевле предложен-
18000 16000 14000 12000
10000
Q
ш8000
О
6000 4000 2000 0
-2000
-без препарата 0.2 мкг/мл 2 мкг/мл 20 мкг/мл — 100 мкг/мл 200 мкг/мл
дни
Рис. 2. Данные типичного эксперимента по проверке антимикобак-териальной активности соединений. Диаграмма динамики роста культуры M. tuberculosis H37Rv под воздействием препарата 9 в различных концентрациях. ОЕФ — относительные единицы флюоресценции, регистрируемые с помощью программного обеспечения Epicenter (BD, USA)
ного способа получения 5-(1-алкинил)нуклеозидов [11 — 14]. Для выявления вклада З'-модификации углеводного остатка в противотуберкулезную активность 5-модифициро-ванных нуклеозидов были синтезированы производные 2'-дезоксиуридина с одинаковым заместителем в пятом положении основания: 2'-дезокси-, 3'-азидо-2',3'-дидезокси-и 3'-амино-2',3'-дидезокси-5-метилоксидодецилуридин (8-10, рис. 1).
Результаты определения бактериостатической активности (ингибирующих рост концентраций) препаратов по росту микобактерий в автоматизированной системе Bactec MGIT960 показали, что культура M.tuberculosis H37Rv, экспонировавшаяся со средой без добавления препаратов, дала рост через 3.59 сут. Кривая роста имела классический сигмоидный вид и состояла из трех фаз - фаза скрытого роста (до 3.59 сут), экспоненциальной (лог-фаза, или фаза активного деления микобактериальных клеток) - с 3.59 сут по 10.25 сут и стационарной фазы, когда количество клеток в культуре не увеличивалось - с 10.25 сут до даты окончания эксперимента (рис. 2). Продолжительность фазы активного деления составила 6.66 сут.
На первом этапе, с целью подтверждения антимикобак-териальной активности нуклеозидов и отработки условий проведения эксперимента, были исследованы 5-(1-додеци-нил) и 5-(1-тетрадецинил)-2'-дезоксиуридин (1 и 2), в концентрациях 2, 20 и 200 мкг/мл, согласно литературным данным подавлявшим рост M.bovis (МИК90 50 и 10 мкг/мл, соответственно) и на 50-70 % ингибировавших в высоких концентрациях рост M.avium [11]. Нами было показано, что оба препарата полностью подавляли рост культуры M.tuberculosis в концентрации 200 мкг/мл.
5-метоксиалкильные производные пиримидиновых ну-клеозидов (6, 7, 9 и 10) и монофосфаты нуклеозидов 3-5 тестированы в концентрациях 0.2, 2, 20, 100 и 200 мкг/мл, а 5-метилоксидодецил-2'-дезоксиуридин (8) - в концентрациях 0.2, 2, 20, 50 и 100 мкг/мл. Данные типичного экс-
перимента по проверке антимикобактериальной активности соединений приведены на рис. 2.
При исследовании антимикобактериального действия препаратов 6-10 на культуру M.tuberculosis H37Rv было показано, что препарат 6 вызывал 100 %-ное ингибиро-вание роста при концентрациях 200 и 100 мкг/мл, 7 - 200 и 100 мкг/мл, 8 - 100 и 50 мкг/мл, 9 - 200 и 100 мкг/мл, 10 - 200 и 100 мкг/мл (рис. 2). Таким образом, минимальная ингибирующая концентрация (МИК) для препаратов 6, 7, 9 и 10 составила 100 мкг/мл и препарата 8 - 50 мкг/мл.
Нуклеозиды, содержащие в 5-м положении нуклеинового основания объемные гидрофобные группы, плохо растворимы в воде. Для повышения растворимости мы синтезировали 5'-монофосфаты нуклеозидов (3-) по методу [16], однако полученные соединения не ингибировали рост микобактерий даже в высокой (200 мкг/мл) концентрации, и параметры кривых роста культуры, культивируемой с этими препаратами, не отличались от контроля без препарата.
Нами была оценена продолжительность фазы активного роста культуры, экспонируемой с тестируемыми препаратами, в концентрациях, не приводящих к 100 %-ному ингибированию роста культуры, по сравнению с контролем (рис. 3). Данные выражены в относительных единицах (ОЕ), вычисленных как отношение времени фазы активного деления культуры, растущей в присутствии препарата, к продолжительности фазы активного деления контрольной культуры (M.tuberculosis H37Rv без препаратов). Как видно из рис. 3, под действием 20 мкг 5-метилоксидодецил-2'-дезоксиуридина (8) и 5-метилоксидодецил-3'-амино-2',3'-дидезоксиуридина (10) наблюдается увеличение продолжительности фазы активного деления, достоверно отличающееся от контроля (р < 0.01), что свидетельствует о снижении интенсивности деления микобактериаль-ных клеток в культуре. Следует отметить, что для этих
3-5 " 6 7
Номера соединений
Рис. 3. Оценка эффективности препаратов, вызывающих ингибиро-вание роста культуры M.tuberculosis при различных концентрациях. ОЕ — отношение продолжительности фазы активного деления культуры M.tuberculosis H37Rv, экспонируемой с тестируемыми препаратами, к продолжительности фазы активного деления контрольной культуры, принятой за единицу
препаратов показана задержка начала роста микобакте-рий по сравнению с контролем на 24 ч (для препарата 8) и на 18 ч (для препарата 10).
заключение и выводы
Мы впервые показали, что производные 2'-дезокси-уридина и 2'-дезоксицитидина с протяженными мети-локсиалкильными заместителями способны ингибиро-вать рост культуры микобактерий M.tuberculosis H37Rv. 5-метилоксидодецил-2'-дезоксиуридин (8) можно признать наиболее активным в отношении M.tuberculosis, поскольку он имел наименьшую МИК из всех тестированных соединений (50 мкг/мл), а его воздействие в концентрации, не вызывающей 100 %-ного ингибирования, приводило к наибольшему увеличению продолжительности фазы активного деления и максимальной задержке начала роста культуры. Тем не менее нами не выявлено принципиальных различий
в ингибирующем действии пиримидиновых нуклеозидов, различающихся как структурой заместителя в 5-м положении основания (1-алкинильный или метилоксиалкильный), так и углеводным фрагментом (2-дезокси-, 2,3-дидезокси-3-азидо- и 2,3-дидезокси-3-аминорибофураноза).
Таким образом, нами продемонстрирована способность 5-метилоксиалкильных производных пиримидиновых 2'-дезоксинуклеозидов ингибировать рост M.tuberculosis in vitro, наиболее эффективные из которых могут послужить прототипами для создания новых противотуберкулезных препаратов. •
Работа частично поддержана Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 08-04-00549).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Word Health Org., http//www/who/int/mediacentre/fastsheets/fs104/en/.2005
2. Banerjee R., Schecter G.F., Flood J., Porco T.C. // Expert Rev. Anti Infect Ther. 2008. V. 6. P. 713-24.
3. Bucher H.C., Griffith L.E., Guyatt G.H., Sudre P., Naef M., Sendi P., Battegay M. // AIDS 1999. V. 13. P. 501-507.
4. Daley C.L., Small P.M., Schecter G.F., Schoolnik G.K., McAdam R. A., Jacobs W.R., Hopewell PC. // N. Engl. J. Med. 1992. P. 326. V. 231-235.
5. Ginsberg A.M., Spigelman M. // Nat. Med. 2007. V. 13. P. 290-4.
6. Tsuyuguchi I. // Tuberculosis (Edinb). 2001. V. 81. P. 221-7.
7. Туберкулез в России. ООО «РПЦ Прима». М., 2009.
8. De Clercq E. // Adv. Virus Res. 2009. V. 73. P. 1-53.
9. Van Calenbergh S. // Verh K Acad. Geneeskd Belg. 2006. V. 68. P. 223-48.
10. Gupte A., Boshoff H.I., Wilson D. J., Neres J., Labello N.P., Somu RV., Xing C., Barry III C.E., Aldrich С.С. // J. Med. Chem. 2008. 51. 7495-7507.
11. Rai D., Johar M., Manning T., Agrawal B., Kunimoto D.Y., Kumar R. // J. Med. Chem. 2005. 48. 7012-7017.
12. Rai D., Johar M., Srivastav N.C., Manning T., Agrawal B., Kunimoto D. Y., Kumar R. // J. Med. Chem. 2007. 50. 4766-4774.
13. Johar M., Manning T., Tse C., Desroches N., Kunimoto D.Y., Agrawal B., Kumar R. // J. Med. Chem. 2007. 50. 3696-3705.
14. Srivastav N.C., Manning T., Kunimoto D.Y., Kumar R. // Bioorganic & Medical Chemistry. 15. 2007. 2045-2053.
15. Alexandrova L.A., Skoblov A.Yu., Jasko M.V., Victorova L.S., Krayevsky A.A. // Nucl. Acids Res. 1998. 26. № 3. 778-786.
16. Дяткина Н.Б., фон Янта-Липински М., Минасян Ш.Х., Куханова М.К., Краев-ский А.А., Чиджавадзе З.Г., Бибилашвили Р.Ш. // Биоорган. химия. 1987. Т. 13. С. 1366-1374.
17. Андреевская С.Н., Черноусова Л.Н., Смирнова Т.Г., Ларионова Е.Е., Кузьмин А.В. // Пробл. туб.и болезн. легк. 2006. № 12.С. 43-48.
