CC BY
32
УДК 579.843.1
НЕКУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ФОРМЫ
VIBRIO CHOLERAE O1/O139: ИТОГИ И ПЕРСПЕКТИВЫ
А.В. Соколенко, А.Ю. Миронов НИИ Биологии Южного федерального университета, г. Ростов-на-Дону Россия, 344090, г. Ростов-на-Дону, Просп. Стачки 194/1; [email protected]
ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. ГабричевскогоРоспотребнадзора, Россия, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. 10. Тел.: (495) 452-18-16
В работе приведены результаты многолетних исследований некультивируемых форм (НФ) Vibrio cholera€ O1/O139 в экспериментальных условиях, моделирующих средние географические широты. Изучены механизмы и закономерности образования НФ, влияние различных экологических факторов на обратимость процесса (реверсию), биологические свойства НФ и ревертантов, возможные молекулярно-биохимические механизмы некультивируемости. Разработаны методы индикации и идентификации НФ V. cholerae, оценки их эпидемической значимости и жизнеспособности. Полученные результаты позволили сформулировать парадигму НФ патогенных бактерий, позиционировать НФ в ряду функционально дифференцированных бактерий, сформулировать специфические критерии некультивируемости.
Ключевые слова: Vibrio choleraе O1/O139, некультивируемые формы, экологические факторы, реверсия.
UNCULTIVABLE FORMS OF VIBRIO CHOLERAE O1/O139: SUMMARY AND OUTLOOK
A.V. Sokolenko, A.Y. Mironov Research Institute of Biology of the Southern Federal University, Rostov-on-Don; FBSI G.N. Gabrichevsky's MNIIEM of Moscow Rospotrebnadzor
The results of long-term studies of viable but nonculturable forms (VBNC) Vibrio cholerae O1/O139 under experimental conditions simulating the average geographic latitude are present in this work. The mechanisms of the formation of the VBNC and the influence of different environmental factors on the reversibility of the process (resuscitation), and biological properties of the VBNC and of the revertants also as possible molecular and biochemical mechanisms of nonculturable state was studied. The methods of indication and identification of VBNC of V. cholerae, assessing their relevance and viability of the epidemic, have been proposed. The obtained results allowed us to formulate a paradigm of VBNC pathogenic bacteria and their position among functionally differentiated bacteria and also to formulate specific criteria of nonculturable state.
Keywords: Vibrio cholera£ O1/O139, non-culturable forms, environmental factors, reversion.
По данным ВОЗ ежегодно в мире регистрируется 3-5 миллионов случаев заболевания холерой, из них 100-120 тыс. со смертельным исходом [1]. Сохраняется риск завоза возбудителя на территорию РФ, чем обусловлен неблагоприятный прогноз по холере [2]. Экологические особенности V. cholerae указывают на возможное участие НФ в реализации жизненного цикла вида в эндемичных по холере районах [7]. Роль НФ в циркуляции возбудителя в неэндемичной зоне не изучена.
Некультивируемое состояние (НС) известно более чем у 80 видов микроорганизмов, большинство из которых - патогенные. НФ сравнивают со спорами или цистами [8], проапоптозом [5],
стохастическими изменениями [6], «альтруистической» гибелью клеток [4]. Сообщается об угрозе НФ для здоровья человека [9]. В разных условиях один вид бактерий может образовывать разные функционально дифференцированные формы: старвирующие клетки, споры, цисты, цистоподоб-ные покоящиеся клетки (ЦПК), L-формы. Функциональная принадлежность и физиологический статус НФ остаются дискуссионными.
Цель работы - экспериментальное изучение возможности поддержания популяции в межэпидемический период в НС в условиях умеренного климата, всесторонняя характеристика биологических свойств некультивируемых вибрионов
Эпидемиология, экология, специфическая диагностика, профилактика
для решения фундаментальных и прикладных вопросов о биологической и эпидемической значимости НФ. В широком смысле - формирование научной парадигмы НФ.
Указанная цель исследования положена в основу единственной в РФ работы, проведённой коллективом авторов под руководством профессора Ломова Ю.М. в РостНИПЧИ в период 1997-2006 гг. (экспериментальная часть), в НИИ биологии Южного федерального университета в 2006-2014 гг. под руководством проф. Миронова А.Ю. (аналитическая часть), что позволило сформулировать новые теоретические положения о механизмах образования НФ, биологическом значении НС, его роли в экологии бактерий, позиционировать НФ в ряду других изменённых форм бактерий.
Материалы и методы. В работе применяли бактериологические (культивирование микрокосмов, получение и характеристика чистых бактериальных культур), биохимические (определение активности твиназы, протеазы, лецитиназы, нейра-минидазыгемолизина, супероксиддисмутазы, ката-лазы, протеазы), биофизические (определение активности рибулозодифосфаткарбоксилазы РДФК и активности синтеза ДНК, иммунологические (Дот-ИФА, твёродофазный ИФА со специфическими моноклональными антителами к О-антигену ли-пополисахарида), молекулярно-генетические методы исследования (ДНК-зондирование, ПЦР). Анализ полученных результатов проведён с помощью статистических методов. Достоверность различий средних величин оценивали по t-критерию Стью-дента. «Нулевая гипотеза» об отсутствии различий между сравниваемыми выборками отвергалась при уровне значимости р<0,05. При корреляционном анализе использовался коэффициент Юла.
Результаты. В экспериментальных экологических условиях средних географических широт ведущим индуктором НС У. cholerae O^O^g является t<+6°C. Фитогормоны ауксин и эпин, натив-ные водоросли Scenedesmus quadricauda, в меньшей степени - простейшие Paramecium caudatum при t<+6°C индуцируют НС. Присутствие в водной среде азотных, калийных удобрений, аминокислот, интермедиатов цикла Кребса, высокая исходная концентрация бактерий продлевают период старвации, но не индуцируют НС.
Вегетативные и НФ У. cholerae O/O^g в экспериментальных микрокосмах, имитирующих умеренные географические широты, формируют биоплёнки на частицах речного ила или песка, способствующие выживанию в неблагоприятных условиях среды.
Переходные и НФ более чувствительны, чем вегетативные к кратковременному тепловому
шоку, УФ излучению, гентамицину, хлорамину В, раствору Н2О2, мертиоляту Na в концентрациях, применяемых в лабораторной практике.
НФ У. cholerae O/O13g в зависимости от возраста и условий микроксмов при повышение t до 20-22 оС, внесение denovo токоферола или ката-лазы, низких концентраций пептонной воды или разрушенных клеток P. caudatum могут реверсировать. Реверсия in vivo на лабораторной модели не эффективна. Ревертанты сохраняют основные генетические детерминанты патогенности, биологические свойства восстанавливают при пассажах через восприимчивый организм. Чувствительность к диагностическим фагам ХДФ-3, ХДФ-4, ХДФ-5 утрачивается необратимо.
В процессе перехода в НС снижается активность ферментов, ассоциируемых с вирулентностью (протеазы, лецитиназы, твиназы, ней-раминидазы) вплоть до утраты, параллельно происходит экспрессия активности РДФК - ключевого фермента цикла Кальвина, характерного для сапрофитов.
В зависимости от возраста НФ и среды микрокосма изменяется топология эпитопов О-ан-тигена ЛПС в составе соматического комплекса клетки, снижается плотность экспонирования эпитопов. Консервативные детерминанты О-ан-тигена регистрируются в течение всего времени наблюдения пока клетки остаются интактными, лабильные - только в период сохранения способности к реверсии.
В основе физиолого-биохимического механизма образования НФ У. cholerae лежат физиологические процессы ответа клетки на окислительный стресс. Интенсификация дыхания в НС, экзогенные/эндогенные свободные радикалы ведут к накоплению цитотоксичной H2O2, остановке деления клеток, изменению их размера и морфологии, гиперактивности СОД, каталазы, пероксидазы.
В НС (минимум 24 мес.) и у ревертантов сохраняются основные и дополнительные генетические детерминанты вирулентности, входящие в состав VPI-1 и VPI-2. Интенсивность и динамика синтеза ДНК снижается в ряду: переходные^ве-гетативные^НФ. Динамика синтеза ДНК, утрата чувствительности к диагностическим фагам могут быть следствием изменённого состояние ДНК.
Выявленное индуцирующее реверсию влияние метаболитов S. quadricauda, суспензий разрушенных P. caudatum, умеренное действие ауксина, могут быть использованы для совершенствования питательных сред. Изучение стимуляции роста вегетативных форм V. cholerae арбидолом и интерфероном перспективно для наиболее полного раскрытия механизмов патогенеза холеры.
Обнаруженное специфическое состояние ДНК требует изучения молекулярных механизмов явления и может быть использовано в биотехнологии. Дальнейшее изучение чувствительности НФ к антибиотикам и дезинфектантам позволит скорректировать существующие схемы лечения и уменьшить воздействие химических веществ на организм человека иокружающую среду. Сформулированные фундаментальные основы некульти-вируемости могут быть использованы в исследованиях промышленно значимых штаммов.
Получен патент РФ на изобретение № 2287824 С2 от 20.11.2006 «Способ обнаружения некуль-тивируемых форм Vibrio cholerae и О139 се-рогруппы». Получено положительное решение о выдачи патента РФ на изобретение по заявке № 2013134371/15(051397) «Способ определения жизнеспособности некультивируемых форм Vibrio cholerae O/O139 по экспрессии рибулозодифосфат-карбоксилазы» с приоритетом от 22.07.2013.
Заключение. Сформулирована парадигма некультивируемости патогенных бактерий: НС - уникальная, отличная от других функционально дифференцированных бактерий, динамично развивающаяся форма выживания на грани жизнеспособности [3]. Переход в НС увеличивает экологическую пластичность вида, что может обеспечить циркуляцию возбудителя с изменёнными свойствами на неэндемичной территории. Наличие патологических признаков у НФ не позволяет рассматривать НС как полноценную форму покоя. Возможности выживания, которые клетка получает благодаря НС, с точки зрения эволюции являются преадаптацией.
Специфические критерии НС как основы парадигмы некультивируемости:
1. Эффективные методы обнаружения и идентификации НФ - прямая микроскопия (прижизненная и постмортальная), ИФА со специфическими МКА, молекулярно-генетические методы (ПЦР со специфическими праймерами, секвени-рование). Для прогнозирования эпидемической значимости по соотношению цена исследования/ качество/время наиболее эффективно применение МКА к лабильным эпитопам О-антигена.
2. Образованию НФ предшествует длительный период старвации.
3. Некультивируемая трансформация затрагивает все системы и структуры бактериальной
клетки: уменьшается размер, форма, изменяется топология эпитопов О-антигена ЛПС, истинные дополнительные защитные оболочки отсутствуют, функционируют альтернативные метаболические пути, ДНК и генетический материал в целом в изменённом состоянии.
4. Реверсия НФ - мультифакторный процесс с низкой частотой, достаточной для восстановления популяции в благоприятных условиях. Окно реверсии ограничено во времени нарастающими патологическими процессами в клетке.
5. НФ более чувствительны к химическим и физическим воздействиям, чем вегетативные формы и формы покоя.
6. Адаптация на уровне популяции: большая часть клеток гибнет, а оставшиеся утрачивают культивируемость и формируют биоплёнки.
7. В основе утраты роста на питательных средах лежат физиолого-биохимические механизмы ответа клетки на окислительный стресс.
8. Изменённое состояние ДНК в НС - потенциальный источник внутригеномных перестроек и/или регуляторного переключения активности генов, ведущих к формированию новых клонов и смене популяционного состава, повышающих экологическую пластичность вида и выживаемость в окружающей среде.
9. Физиологический статус НФ низкий, биологическое значение - выживание в меняющихся условиях существования экологически пластичного вида.
Точки перехода между вегетативной/переходной/ некультивируемой стадиями являются точками бифуркации: при наступлении благоприятных условий переходные и способные к реверсии НФ возобновляют рост. Если не происходит улучшение условий, в зависимости от стадии развития, условий культивирования, характера и интенсивности индуцирующего воздействия вероятно двойственное развитие событий:
- признаки окислительного стресса нарастают, некультивируемые клетки в состоянии планктона гибнут;
- в определённых условиях формируются биоплёнки, которые способствуют выживанию клеток с ограниченными физиологическими возможностями.
Длительность, специфика и условия этого процесса - тема отдельной работы.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИМ СПИСОК
1. Информационный бюллетень WHO. - 2014. - № 107. Февраль. - URL: http://www.who.int/ mediacentre/factsheets/fs107/ru/
2. Назаретян А.А., Москвитина Э.А. Холера: Эндемичные территории стран мира. 2007-2011 гг. // Холера и патогенные для человека вибрионы: матер. совещ.
специалистов Роспотребнадзора. - Ростов-н/Д., 2013.
- Вып. № 26. - С. 16-21.
3. Соколенко А. В., Миронов А. Ю. Некультивируемые формы холерных вибрионов: парадигма функциональной дифференциации патогенных бактерий: монография.
- Ростов-на-Дону: ООО «Азов Печать», 2013. - 372 с.
Эпидемиология, экология, специфическая диагностика, профилактика
4. Barcina I., Arana I. The viable, but nonculturable phenotype: a crossroads in the life-cycle of non-differentiating bacteria? // Reviews in environmental science and biotechnology. - 2009. - Vol. 8(3). - P. 245-255
5. Bloomfield S. F., Stewart G. S. A. B., Dodd C. E. R. The viable but non-culturable phenomenon explained? // Microbiology. - 1998. - Vol. 144. - P. 1-3.
6. Buerger S., Spoering A., Gavrish E. Microbial scout hypothesis, stochastic exit from dormancy, and the nature of slow growers.// Appl. Environ. Microbiol. - 2012. -Vol. 78 (9). - P. 3221-3228
7. Mishra A., Taneja N., Sharma M. Demonstration of viable butnonculturable Vibrio cholera O1 in fresh water environment of India using ciprofloxacin DFA-DVC method.//Lett. ApplMicrobiol.- 2011. - V. 53(1). -P. 124-126.
8. Oliver J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. // FEMS Microbiol. Rev. - 2010. - Vol. 34 (4). - P. 415-425.
9. Powers L. S., Snyder R. W., Wardell L. J. Rapid microbial quantification of disinfected contact lens surfaces // Curr. Eye. Res. - 2012. - Vol. 37 (9). - P. 850-852.
Соколенко Анна Васильевна - канд. биол. наук, старший научный сотрудник лаборатории биомедицины НИИ Биологии Южного федерального университета.
Миронов андрей Юрьевич - д-р мед. наук, профессор, заведующий отделом микробиологии ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора.
©А.В. Соколенко, А.Ю. Миронов, 2014 Статья поступила в редакцию 10 сентября 2014 г.
УДК 619: 616.9 - 036. 2: 616. 981. 42: 636
ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ОПТИМИЗАЦИИ ПРОТИВОБРУЦЕЛЛЕЗНЫХ МЕРОПРИЯТИЙ У ЖИВОТНЫХ В СОВРЕМЕННЫХ УСЛОВИЯХ
П.К. Аракелян1, С.К. Димов2 ТНУ Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных Рос-
сельхозакадемии, Омск 644001 г. Омск ул. Лермонтова, 93; [email protected] 2ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии, Новосибирск 630501, Новосибирская область, р. п. Краснообск; [email protected]
Рассматривается необходимость оптимизации противобруцеллезных мероприятий у животных применительно к современным условиям их содержания. Подчеркивается важность разработки и реализация региональных целевых долгосрочных научно обоснованных программ по борьбе с бруцеллезом при тесном медико-ветеринарном сотрудничестве. Доказана противоэпизоотическая и противоэпидемическая эффективность конъюнктивальной иммунизации мелкого рогатого скота против бруцеллеза вакциной из штамма B. abortus 19 в малой дозе.
Ключевые слова: мелкий рогатый скот, бруцеллез, эпидемическая ситуация, неблагополучны пункт, вакцина из штамма 19, конъюнктивальный метод, РА, РСК, РИД, О-ПС А- и М-антигены.
EPIDEMIOLOGICAL ASPECTS OF OPTIMIZATION OF ANTIBRUCELLAR MEASURES IN ANIMALS IN MODERN CONDITIONS P.K. Arakelyan1, S.K. Dimov2 :RAAS Russian Research Institute of Animal Brucellosis and Tuberculosis, Omsk 2RAAS Institute of Experimental Veterinary of Siberia and Far East, Novosibirsk
Difficult brucellosis' epidemiological situation in some regions of our country demands the optimization of antibrucellar measures in animals applied to the current conditions of their containment. Positive results were obtained in this field. It is extremely important to develop and implement the long-term regional science-based programs aimed at the eradication of brucellosis in close cooperation of medical and veterinary specialists.
Keywords: small cattle, brucellosis, epidemiological situation, disadvantaged point, the vaccine from the strain 19, the conjunctival method, RA, DGC, RID, O-PS A - and M antigens.
