CC BY
75
Шеламова С.А.1, Тырсин Ю.А.2
1 Воронежская государственная технологическая академия 2Московский государственный университет пищевой промышленности
НЕКОТОРЫЕ КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛИПАЗЫ I ЙИНОРиЭ ОЯУгЛЕ 1403
Липаза I ингибировалась л-ХМБ - Утах не изменялась, а КМ увеличивалась в 1,5 раза. РМБР вызывал снижение Утах на 63,5 % и увеличение КМна 51 %. установлены индивидуальные кинетические константы ингибирования аналогами субстратов - л-гексил-этил-хлорофосфонатом и додецилсульфонатом, соответственно: к2=4,2 с-1 и к3=7,6; к2=18,5 с-1 и к3=3,2. Это доказывает наличие двух стадий при гидролизе - аци лирования и деацилирования.
Ключевые слова: липаза, Rhizopus, серин.
К настоящему времени расшифрован сик-венс либо аминокислот, либо нуклеотидов ДНК более чем 2000 липаз. Анализ идентичности аминокислотной последовательности липаз Rh. javanicus, Rh. niveus, Rh. delemar позволил обнаружить 54 % сходство с липазой из Rhizomucor miehei [1, 2]. Сравнение трехмерных структур липаз человеческой поджелудочной железы и гриба Rhizomucor miehei выявило каталитическую триаду Ser-Asp-His, подобную сериновым протеазам. Впоследствии ренгеноструктурный анализ липаз Pseudomonas glumae, Humicola lanuginosa, Rhizopus delemar, Penicillium camembertii, Candida antarctica, и кутиназы Fusarium solani pisi указал на их схожее каталитическое строение [3-6].
В данной работе приводятся исследования модификации SH-групп и серина с целью выяснения их роли в каталитическом действии Липазы I Rhizopus oryzae 1403.
Методика
В работе использовали n-хлормеркурибен-зоат (n-ХМБ), фенилметансульфонилфторид (PMSF), n-гексил-этил-хлорофосфонат и доде-цилсульфонат, полученные из Merck (Германия). Другие реагенты были отечественного производства марки х.ч. В качестве субстрата использовали трибутирин. Модификацию фермента проводили при температуре 35 оС и рН
6,5 (если не указано).
Результаты и их обсуждение
Модификация Липазы I n-хломеркурибензо-атом.
Органические соединения ртути являются специфичными реагентами для определения и изучения функции сульфгидрильных групп. Некоторыми исследователями установлено, что
БН-группы остатков цистеина играют существенную роль в конформационных изменениях молекулы липазы, а также влияют на связывание субстрата и кофакторов [7, 8]. Ингибирующее действие п-ХМБ проявляется по-разному Установлено, что липазы молока и семян клещевины полностью им инактивируются, что, по мнению авторов, указывает на тиоло-вую природу этих ферментов [9, 10]. Частичная потеря активности под действием ингибитора наблюдалась у панкреатической липазы свиньи и грибной из Риштаgraminis [11]. Это объяснили влиянием стерических эффектов на каталитическую активность за счет блокирования сульфгидрильных групп, находящихся вблизи активного центра фермента.
В литературе имеются данные о липазе, из желудочной ткани, обработка которой дитионит-робензолом приводила к её инактивации [12]. Был изучен механизм ингибирования эндолипазы из ЯШгорт йвктаг ионами тяжелых металлов Н§2+, РЬ2+, блокирующими поверхностные БН-группы фермента. В ряде исследований п-ХМБ выступал как в качестве ингибитора, так и активатора олигомерных ферментов [13].
Нами исследовано влияние различных концентраций п-ХМБ - 510-4 2,510-4,2,510-5,110-5 М на активность липазы. На рис. 1 показано, что модификатор приводит к потере каталитической активности липазы, и тем в большей степени, чем выше его концентрация. За15 мин инкубации при концентрации ингибитора 5-10'4 М скорость ферментативной реакции снижалась на 36 %.
Для выяснения природы инактивации фермента под воздействием п-ХМБ нами была исследована кинетика этого процесса. Результаты испытаний представлены на рис. 2 (а, б). Графическая обработка данных в координатах Лай-нуивера-Берка показала, что Ушах не изменяет-
ся, а КМ увеличивается в 1,5 раза. Это говорит о том, что SH-группы Липазы I не задействованы в самом акте катализа, но влияют на сродство фермента к субстрату, а также могут участвовать в поддержании активной конформации молекулы.
Модификация Липазы I
фенилмешансульфонилфшоридом.
Многие микробные липазы являются сериновыми, так как содержат ре-акционноспобный остаток серина в активном центре [14, 15]. Такие ферменты обычно ингибируются рядом фосфоор-ганических соединений.
Исследования ингибирования липазы Aspergillus terreus в присутствии 100 мМ 3,4-дихлоризокумарина показали уменьшение активности на 40 %, а n-нитрофенилфосфата - 98 %, что свидетельствовало о принадлежности фермента к сериновым гидролазам [15].
Активность липазы Neuspora sp. полностью подавлялась диизопропилфтор-фосфатом (ДФФ) [16]. Подобные результаты наблюдали при действии фе-нилметилсульфонилфторида (PMSF) и 3,4-дихлоризокумарина на изоферменты липазы Candida rugosa [17].
Нами были проведены исследования по влиянию различных концентраций PMSF 110-4; 2,510-3; 5-10'3 М, на активность Липазы I (рис. 3). Ингибирование проводили при температуре 20 оС, рН 6,5, концентрация фермента в реакционной смеси составляла 2,21 мМ. Активность определяли при содержании субстрата 10 мМ.
В результате эксперимента было установлено, что с увеличением концентрации PMSF активность фермента снижается более чем на 40 % за 5 мин и более чем на 85 % за15 мин инкубации при максимальной концентрации реагента 510-3 М. Для выяснения природы инактивации фермента под воздействием PMSF нами была исследована кинетика этого процесса. Результаты испытаний представлены на рис. 4 (а, б). Под дей-
Время, мин
Рисунок 1. Зависимость ферментативной активности от концентрации и-ХМБ и времени воздействия; концентрация п-ХМБ: (х)1-10-5; (Д) 2,510-5; (□) 2,510-4; (0) 510-4 М.
[S]o, мМ
а)
б)
Рисунок 2. Кинетика инактивации липазы ЕН1горш отугае 1403 под действием 5-10-4 М и-ХМБ: (а) зависимость х от концентрациии субстрата: нативная (□) и модифицированная (0) и-ХМБ липаза; (б) графическое определение Утах и КМ.
Время, мин
Рисунок 3. Зависимость активности Липазы I от концентрации РМ8Р и времени инкубации. Концентрация РМ8Р: (А) 1-10"4; (□) 2,5-10-3; (◊) 5-10-3 М.
5
4,5
4
^ З,5
и к 2
3
2.5 2
1.5 1
0,5
0
9^ 1
и
а)
б)
Рисунок 4. Зависимость начальной скорости реакции гидролиза трибутирина нативной (□) и модифицированной РМ8Р (◊) липазой от концентрации субстрата: (а) данные представлены в координатах (х0, [8]0); (б) определение кинетических параметров процесса в координатах (1/х0, 1/[8]0).
ствием ингибитора V снижалась на
* тах
63,5 %, а КМ увеличивалась на 51 %. Это говорит о том, что фосфоорганическое соединение блокирует активный центр фермента, и одновременно конформация молекулы становится неблагоприятной для связывания с субстратом.
Роль остатка серина в каталитической активности Липазы I.
Для исследования роли остатка серина в катализе была проведена модификация липазы ингибиторами, которые являются аналогами субстратов -я-гексил-этил-хлорофосфонатом и доде-цилсульфонатом и проведен кинетический анализ ингибирования (рис. 5).
Согласно трехстадийному механизму [18], кинетика ферментативного гидролиза триглицеридов может быть представлена схемой К к2
Е + ЕБ ^ ЕА Рх
Липаза сначала связывается с триглицеридом в реакции с быстро наступающим равновесием. Затем освобождается диглицерид - продукт Р1 и образуется ацилферментное промежуточное соединение с константой к2. Далее вода атакует ацил-фермент, в результате чего липаза освобождается и выделяется жирная кислота с константой скорости псевдопервого порядка Так как концентрация воды превышает концентрацию триглицерида и к3 >> к4 для этого механизма, скорость можно выразить уравнением Михаэлиса
к3
-»
Е+Р2 (1)
V =
КМ + И
Максимальная скорость и константа Михаэлиса связаны со значениями индивидуальных констант схемы (1) соотношениями
V = [Е0] • к2 • к3 утах
ко + кз
Км = К
к2 + к3
4
1/[S]0, мМ-а)
1/[S]o, мМ б)
Рисунок 5. Кинетические зависимости ингибирования Липазы I (а) и-гексил-этил-хлорофосфонатом и (б) додецилсульфонатом в двойных обратных координатах; (□) нативный фермент; (0), (А) с ингибиторами.
Индивидуальные константы k2 и k3 были рассчитаны из соотношений
^cat
Km = Ks
k2 - k3 k2 + k3
ko
k2 + k3 ’
(2)
(3)
Для фосфоната они были равны: к2=4,2 с-1 и &3=7,6, то есть в данном случае ингибировалась стадия ацилирования. Для сульфоната соотношение между константами было обратным - &2=18,5 с-1 и &3=3,2, что свидетельствует о подавлении стадии деацилирования.
Таким образом, установлено, что катализ гидролиза сложноэфирной связи Липазой I проходит через две стадии - ацилирование и деацилирование.
Список использованной литературы:
1. Derewenda U., Swenson L., Green R. et al. Current progress in crystallographic studies of new lipases from filamentous fungi // Protein Engineering. - 1994. - V. 7, № 4. - P. 551-557.
2. Kohno M., Kugimiya W., Hashimoto Y., Morita Y. Purification, characterization, and crystallization of two types of lipase from Rhizopus niveus // Bioici. Siatech. Blochem. - 1994. - V. 58, № 6. - P. 1007-1012.
3. Martinez C., Geus P. D., Lauwereys M. et al. Fusarium solani cutinase is a lipolytic enzyme with a catalytic serine accessible to solvent // Nature. - 1992. - V. 356. - P. 615-618.
4. K^ler W., Kolattukudy P. E. Mechanism of action of cutinase: chemical modification of the catalytic triad characteristic for serine hydrolases // Biochemistry. - 1982. - V. 21. - P. 3083-3090.
5. Ruiz B., Farres A., Langley E. et al. Purification and characterization of an extracellular lipase from Penicillium candidum // Lipids. - 2001. - V. 36, № 3. - P. 283-289.
6. Uvarani G., Jaganatan L., Shridas P., Boopathy R. Purification and characterization of lipase from Rhizomucor miehei //Journal of Scientific & Industrial Research. - 1998. - V. 57. - P. 607-610.
7. Торчинский Ю. М. Сера в белках. - М.: Наука, 1977. - 302 с.
8. Defay T., Cohen F. Protein modelling. Molecular Biology and Biotechnology. A comprehensive desk reference. - New York. -
1995. - P. 757-762.
9. Richardson I. S. The anatomy and taxonomy of protein structure // Adv. Prot. Chem. - 1981. - V. 34. - P. 167-239.
10. Thannhauser T. W., Konishi Y., Scheraga H. A. Sensitive quantitative analysis of disulfide bond in polypeptides and proteins / / Anal. Biochem. - 1984. - V. 138, № 1. - P. 181-188.
11. Брокерхоф К., Дженсен Р. Липолитические ферменты. - М.: Мир, 1978.-396 с.
12. Moreau M., Gargouri X. Importance of sulfhydryl group for rabbit gastric lipase activity // J. Mol. Biol. - 1988. - V. 98, № 9.
- P. 1050-1054.
13. Rosenstein R., Gotz F. Staphylococcus lipases: Biochemical and molecular characterization // Biochimie. - 2000. - V. 82, № 11.
- P. 1005-1014.
14. Ogiso T., Sugiura M. Studies on Bile-sensitive Lipase. Purification and Properties of Lipase from Mucor javanicus // Chem. Pharm. Bull. - 1969. - V. 17, № 5. - P. 1025-1033.
15. Yadav R. P., Rajendra К. S., Gupta R., Davidson W. S. Purification and characterization of a regiospecific lipase from Aspergillus terreus // Biotechnol. Appl. Biochem. - 1998. -V. 28, № 3. - P. 243-249.
16. Lin S.-F., Lee J.-C., Chian C.-H. Purification and characterization of a lipase from Neurospora sp. // J. Am. Oil Chem. Soc. -
1996. - V. 73, № 6. - Р 731-741.
17. Benjamin S., Pandey A. Isolation and characterization of three distinct forms of lipases from Candida rugosa produced in solid state fermentation // Braz. Arch. Biol. a Technol. - 2001. - V. 44, № 2. - P. 213-221
18. Клесов А. А., Березин И. B. Ферментативный катализ. - М.: Изд-во МГУ, 1980. - Ч. 1. - 264 с.
