CC BY
40
Тырсин Ю.А.1, Шеламова С.А.2
1Московский государственный университет пищевой промышленности 2Воронежская государственная технологическая академия
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГИСТИДИНА В АКТИВНОМ ЦЕНТРЕ ЛИПАЗЫ I ЯИКОРив ОЯУгЛЕ 1403
Определены рК функциональных групп Липазы I - рК1=5,2 и рК2=6,9. Значение рК в щелочной зоне подтвердилось при фотоокислении липазы. Модификация липазы йБР показала увеличение светопоглощения при 242 нм, восстановление активности гидроксиламином. Порядок реакции инактивации равнялся 1,05. Утах для нативного фермента составила 4,44 мМ-мин-1-мги, после модификации 1,84; КМ практически не изменилась - 786 и 803 мМ соответственно.
Ключевые слова: липаза, Rhizopus, гистидин.
Липазы (КФ 3.1.1.3) катализируют гидролиз сложноэфирных связей в триацилглицери-нах, а в микроводных условиях - реакции синтеза. Проведены многочисленные исследования по расшифровке строения активного центра микробных липаз, особенностей механизма их действия, поверхностной активации. Для этого используются методы химической модификации [1, 2, 3], сайт-направленного мутагенеза [4, 5], молекулярного моделирования [6, 7, 8]. Установлено, что большинство липолитических ферментов действуют как сериновые гидрола-зы с триадой Ser-Gis-Asp в активном центре [9, 10, 11, 12, 13].
Липолитический комплекс Rhizopus oryzae 1403 обладает 1,3-позиционной специфичностью и высокой трансферазной активностью [14]. Поэтому представляет большой практический интерес. В данной работе представлены исследования по идентификации гистидина в активном центре одной изоформы липазы этого продуцента - Липазы I.
Методика
В работе использовали изофермент липазы Rhizopus oryzae 1403, полученный фракционированием ацетоносажденного препарата с помощью гель-фильтрации на G-150 и последующей хроматографией на ДЕАЕ-52. Гомогенность фермента подтверждена повторной гель-фильтрацией и электрофорезом. Продуцент получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов; диэтилпирокарбонат (DEP) - Sigma Chemical Co (США); другие реагенты отечественного производства марки х.ч.
В качестве субстрата использован трибу-тирин. Для определения кинетических характеристик гидролиза регистрировали накопле-
ние свободных жирных кислот (СЖК) методом рН-статирования [15]. Начальную скорость рассчитывали по тангенсу угла наклона кинетических кривых [16]. Исследования проводились в диапазоне концентраций фермента от 10 до 150 мкг/см3, дающем прямолинейную зависимость от значений начальных скоростей.
При условии начальной скорости реакцию гидролиза трибутирина можно изобразить в виде следующей схемы превращений: к2
ТАГ^ ДАГ + СЖК (1)
Эффективную константу k2 рассчитывали из уравнения Михаэлиса
Хо-к1С1о-С1о/ (Ки + С11) (2)
из зависимости (СЕ0/х0,1/С50) путем подбора в ходе интегральной обработки экспериментальных данных. Максимальную скорость гидролиза Утах и константу Михаэлиса КМ находили методом двойных обратных координат Лайну-ивера-Берка [16].
Фотоокисление липазы проводили на свету с использованием лампы накаливания на расстоянии 10 см в присутствии 5-10-6 М раствора метиленовой сини [17]. Контролем служила проба с той же концентрацией фотосенсибилизатора, выдерживаемая в темноте. В отсутствие фотосенсибилизатора на свету фермент не терял активность в течение 4 ч.
Модификацию диэтилпирокарбонатом (БЕР) проводили, рассчитывая, чтобы в реакционной смеси концентрация спирта составляла не более 1,25 % (такая концентрация спирта не влияла на активность фермента). Спектры поглощения модифицированного фермента в регистрировали на СФ-46 против раствора нативного фермента в буфере. Испытания осуществляли при температуре 20 С и рН 6,5 и кон-
центрациях БЕР (М): 2,510-5; 5,010-5; 2,5-10-4; 5,010-4; 2,510-3. Концентрация субстрата составляла 10 мМ.
Результаты и их обсуждение
Определение рК функциональных групп
активного центра Липазы I.
Значения рК групп, участвующих в акте катализа, определяется из предположения, что фермент активен только в одном состоянии ионизации, и активность будет в значительной мере зависеть от ионизации двух особых групп в активном центре или вблизи него.
Нами были проведены исследования начальной скорости реакции гидролиза трибути-рина при различных значениях рН при концентрации субстрата, далекой от состояния насыщения - 2 мМ (рис 1, а). По логарифмической зависимости эффективных констант гидролиза к2 от рН (рис. 1, б) были определены рК Липазы
I - рК1=5,2 и рК2=6,9. Первое значение близко карбоксильной группе (рК=3,0-4,7), второе - рК имидазола гистидина (рК=5,6-7,0) [18].
Идентификация имидазольной группы
Липазы I фотоокислением.
Фотоинактивация липазы в присутствии метиленовой сини возрастала с уменьшением концентрации ионов водорода в среде (рис. 2). Подобные данные получены для L-треонинде-гидратазы [17]. Фотоокислению в ферментах подвергаются также остатки тирозина, триптофана, метионина и цистеина, но в отличие от последних, гистидин выполняет роль «ловушки» протонов, а таким свойством ни фенольное кольцо тирозина, ни индольная группа триптофана не обладают [19]. Графическая обработка данных в координатах 1п и привела к спрямлению кривых инактивации (рис. 2, б). Из этого следует, что процесс фотоокисления липазы подчиняется реакции псевдопервого порядка и
10 15
Время, мин
а)
20
25
от
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1
-0,2
-0,3
^ '
п -ф 4- И
5 рКі 6 рК2 7
рн
б)
Рисунок 1. (а) Кинетические кривые процесса ферментативного гидролиза трибутирина при температуре 35 оС и различных значениях рН: (О) 4,0; (□) 4,5; (Д) 5,0; (х) 5,5; (Ж) 6,0; (о) 6,5; (+) 7,0; (■) 7,5; (ф) 8,0; (б) определение рК функциональных групп Липазы I.
Время, мин
а)
Время, мин
б)
Рисунок 2. Зависимость скорости ферментативной реакции при фотоокислении Липазы I от значения рН: (Д) - 6,5; (□) - 6,0; (0) - 5,5; (х) - 7,0; (Ж) - 7,5: (а) временные кривые скорости гидролиза субстрата при различных значениях рН; (б) те же кривые в полулогарифмических координатах для определения констант
скоростей фотоинактивации.
рн
а)
р
6,6
6,55
6,5
6,45
6,4
6,35
■ ■ ■ к
0,00295 0,003 0,00305 0,0031 0,00315 1/Т
б)
Рисунок 3. Определение рК фотоокисляемой группы Липазы I (а) и значения ее теплоты ионизации (б).
Время, мин
а)
Время, мин
б)
Рисунок 4. (а) Спектры поглощения модифицированной БЕР (2,5-10-3М) Липазы I при 242 нм и 278 нм; (б) инактивация липазы под действием БЕР (5,0 -10-4М) с последующей реактивацией 0,5 М N^0^
по тангенсу угла наклона прямых можно установить константы ингибирования к.
Полученные расчетным путем константы скоростей процесса фотоинактивации при разных значениях рН были использованы для определения значений рК группы, существенной для каталитической активности.
На рис. 3, а показано, что для фотоокис-ляемой группы значение рК равно 6,5, что близко к рК, определенной из зависимости ^ 1/к от рН.
При идентификации каталитически активных групп белков определяют значения их теп-лот ионизации [20], которые могут служить дополнительным её подтверждением. Исследования фотоинактивации Липазы I при различных температурах - 35, 25, 40 С дали соответствующие значения рК. Зависимость рК от 1/Т показана на рис. 3, б.
Теплоту ионизации ДН рассчитывали из уравнения 3 по углу наклона графика (рК, 1/Т) ДН=2.303-Я-й(рК)/й(1/Т) (3)
Найденное значение теплоты ионизации -29,1 кДж-моль4 соответствовало теплоте ионизации имидазола гистидина (28,8-31,4 кДж-моль4) [21].
Инактивация ферментов в процессе фотоокисления в зависимости от температуры и рН может происходить как вследствие разрушения остатков гистидина, так и нарушения общей молекулярной структуры белка [19, 20]. Поэтому для выяснения роли остатков имидазола гистидина в функционировании Липазы I её модифицировали диэтилпирокарбонатом (БЕР). Модификация Липазы I диэтилпирокарбонатом.
Повышение светопоглощения раствора фермента с БЕР при 242 нм и крайне незначи-
g
10
Время, мин
а)
lg[DEP]
б)
Рисунок 5. Динамика инактивации липазы I DEP: (а) временные кривые остаточной активности нри коицеитрациях DEP (М) - (^) 2,5^l0-5; (□) 5^l0-5; (Д) 2,540-4; (х) 5-10-4; (Ж) 2,540-3; (б) онределеиие
порядка реакции.
[S]o, mM
а)
б)
Рисунок 6. Зависимость начальной скорости реакции гидролиза трибутирина нативной (□) и модифицированной БЕР (^) липазой от концентрации субстрата: (а) данные представлены в координатах х от [8]; (б) определение кинетических параметров процесса в координатах 1/х-1/[8].
тельное уменьшение его при 278 нм (рис. 4, а) указывало на взаимодействие БЕР с гистидином, но не с тирозином. Восстановление активности Липазы I при добавлении гидроксила-мина исключило возможность взаимодействия с БН- и КН2- группами (рис. 4, б).
Расчеты констант инактивации фермента при различных концентрациях ингибитора и преобразование значений в полулогарифмических координатах позволило установить, что порядок реакции, определенный по тангенсу угла наклона прямой ^ в), равен 1,05 (рис. 5), что указывает на участие в реакции не более одного остатка гистидина.
Для выяснения механизма инактивации Липазы I под действием БЕР нами были определены кинетические характеристики этого процесса. В эксперименте использовалась концентрация БЕР 5,010-4 М, время выдерживания фермента с ингибитором - 5 мин. Как пока-
зали результаты, под действием DEP уменьшается только V (рис. 6).
max vr /
Максимальная скорость для нативного фермента составила 4,44 мМ-мин'1-мг'1, после модификации стала равной 1,84 мМ-мин4-мг4. Константа Михаэлиса практически не изменилась - 786 мМ и 803 мМ соответственно. Из этого можно сделать вывод о том, что гистидин оказывает влияние только на диссоциацию фер-мент-субстратного комплекса, но не на сродство фермента к субстрату.
Таким образом, проведенные исследования показали, что Липаза I Rhizopus oryzae 1403 имеет остаток гистидина в активном центре. В панкреатической карбоксиэстергидролазе гистидин был идентифицирован с помощью этоксиформольно-го ангидрида - остаточная активность составляла 40-65,8 % [3], а в липазе/ацилгидролазе из Aeromonas hydrophila - путем замены His291 на Asp - активность полностью терялась [10].
Список использованной литературы:
1. Dufour C. Semeriva M., Dessnuelle P. The role of carboxyl groups in the activity of pancreatic lipase // Biochim. Biophys. Acta.
- 1973. - V. 327. - P. 101-113.
2. K^ler W., Kolattukudy P. E. Mechanism of action of cutinase: chemical modification of the catalytic triad characteristic for serine hydrolases // Biochemistry. - 1982. - V. 21. - P. 3083-3090.
3. Lombardo D. Catalytic properties of modified human pancreatic carboxylic-ester hydrolase // Biochim. Biophys. Acta. - 1982.
- V. 700. P. 75-80.
4. .^ger S., Demleither G., G^z F. Lipase of Staphilococcus hyicus: analysis of the catalytic triad by site-directed mutagenesis // FEMS Microbiol. Lett. - 1992. - V. 100. - P. 249-254.
5. Kwon S. J., Han J. I., Rhee J. S. Produktion and in siti separation of mono- or diacylglucerol catalyzed by lipases in n-hexane // Enzyme Microb. Technol. - 1995. - V. 17, № 8.- P. 700-704.
6. Derewenda U., Swenson L., Green R.et al. Current progress in crystallographic studies of new lipases from filamentous fungi // Protein Engineering. - 1994. - V. 7, № 4. - P. 551-557.
7. Kazlauskas R. J. Elucidating structure-mechanism relationships in lipases: prospects for predicting and engineering catalytic properties // Trends Biotechnol. -1994. - V. 12. -P. 464-472.
8. Vujaklija D., Abramic M., Lescic I. et al. Steptomyces rimosus GDS (L) lipase: Production, heterologous overexpression and structure-stability relationship // Food Technol. Biotechnol. - 2003. - V. 41, № 1. - P. 89-93.
9. Benjamin S., Pandey A. Isolation and characterization of three distinct forms of lipases from Candida rugosa produced in solid state fermentation // Braz. Arch. Biol. a Technol. - 2001. - V. 44, № 2. - P. 213-221.
10. Brumlik M. J., Buckley J. T. Identification of the catalytic triad of the lipase/acyltransferase from Aeromonas hydrophila // J. Bacteriology. - 1996. - V. 178, № 7. - P. 2060-2064.
11. Herrgard S., Gibas C. J., Subramaniam S. Role of an electrostatic network of residues in the enzymatic action of the Rhizomucor miehei lipase family // Biochemistry. - 2000. - V. 39, № 11. - P. 2921-2930.
12. Van Pouderoyen G., Eggert T., Jaeger K-E., Dijkstra B. W. The crystal structure of Bacillus subtilis lipase: A minimal б/в-hydrolase fold enzyme // J. Mol. Biol. - 2001. - V. 309, № 1. - P. 215-226.
13. Yadav R. P., К. S., Gupta R., Davidson W. S. Rajendra Purification and characterization of a regiospecific lipase from Aspergillus terreus // Biotechnol. Appl. Biochem. - 1998. -V. 28, № 3. - P. 243-249
14. Шеламова С. А. Биотехнологические основы конверсии триглицеридов. - Воронеж, 2008. - 145 с.
15. Петрова Л. Л., Казанина Г. А., Селезнева А. А. Применение рН-статного метода для изучения ферментивного действия липазы Penicillium sp. // Прикл. биохим. и микроб. - 1977. - Т. 13, № 5. - С. 758.
16. Варфоломеев С. Д., Гуревич К. Г. Биокинетика: Практический курс. - М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. - 720 c.
17. Ковалева С. В., Дорожко А. И., Каган З. С. Фотоокисление и модификация диэтилпирокарбонатом «биосинтетической» L-треониндегидратазы из пивных дрожжей Sassharomyces carlsbergensis // Биохимия. - 1984. - T. 49, № 8. - С. 12531262.
18. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика; пер. с англ. В. Л. Друцы и Л. Н. Королевой. - М.: Мир, 1991. - 544 с.
19. Буник В. И., Гомазкова В. С. О функциональной роли гистидиновых остатков б-кетоглутарат-дегидрогеназы // Биохимия. - 1987. - Т. 52. - С. 1235-1247.
20. Лосева Л. П., Бендианишвили М. В., Шатилов В. Р. и др. Роль остатков гистидина в конститутивной НАД(Ф)-глутаматдегидрогеназе Chorella pirenoidosa // Биохимия. - 1986. - Т. 51. - С. 840-849.
21. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты: в 3-х т.; пер. с 3-го англ. изд. Л. Д. Гинодмана и М. И. Левянт; под ред. В. К. Антонова и А. Е. Браунштейна - М.: Мир, 1982. - 1120 с.
