CC BY
135
УДК 577.153.2
ИНДУКЦИЯ БИОСИНТЕЗАЛИПАЗ МИКРОМИЦЕТОМ RHIZOPUS ORYZAE1403
С.А.Шеламова1, Ю.А.Тырсин2
I Воронежский государственный университет инженерных технологий, Россия, 394017,
г. Воронеж, пр. Революции, 19
E-mail: [email protected] 2Московский государственный университет пищевых производств, Россия, 125080, г. Москва, Волоколамское шоссе,
II
Биосинтез липазы Rh. отугае 1403 индуцируется триацилглицерола-ми, жирными кислотами и их производными - твинами. Самый высокий эффект дали оливковое масло, твин 80 и олеиновая кислота. Этот продуцент способен синтезировать два липолитических фермента. Молекулярная масса была одинаковой у двух изоферментов и равнялась 44±2 кДа. Между изоформами наблюдалось большое соответствие в аминокислотном составе.
Ключевые слова: липаза, Rhizopus, биосинтез.
Введение
Синтез липолитических ферментов микроорганизмами, за некоторыми исключениями [i], является индуцибельным. Для каждого продуцента необходим выбор индуктора [2-5]. Эффективность индукции, кроме того, зависит от состава питательной среды [6]. По данным многих исследователей биосинтез липазы стимулируют жиры, масла, жирные кислоты и их полиоксиэтиленовые эфиры на основе сорбита - твины [i, 7-11]. Есть данные по добавлению твинов в среды как отдельного компонента, так и вместе с маслами (в качестве поверхностно-активных веществ). В первом случае увеличение активности составляет от 2.5 до 6 раз [12,13]; во втором - на 25% [14].
Для некоторых продуцентов липаз установлено наличие нескольких изоформ этого фермента [15-18]. Они отличаются структурой, молекулярной массой, каталитическими свойствами, стабильностью. Количество работ, посвященных связи между условиями культивирования штаммов-продуцентов липаз и профилем изоферментов, ограничено. Однако это имеет очень большое значение для надежности оценки свойств неочищенных препаратов одного и того же продуцента, так как они могут содержать различное соотношение изоформ.
Объекты и методы исследования
Продуцент получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов. Набор калибровочных белков «Amercham» (США), твины Sigma Chemical Co (США), реагенты для электрофореза «Sigma» (США); масла: оливковое «Aceites Borges Pont» (Испания), подсолнечное и хлопковое «ЭФКО», льняное «Эколен», горчичное «Родос ТД», касторовое «Тульская фармацевтическая фабрика» (Россия); другие реагенты отечественного производства марки х.ч.
Выращивание продуцента проводили глубинным способом на лабораторной качалке (скорость вращения 1.7-1.8 с-1) в колбах Эрленмейера объемом 500 см3, содержащих 100 см3 питательной среды; 72 ч при температуре 30°С и рН 7.0.
Для выявления множественности форм липазы препараты, полученные из фильтрата культуральной жидкости осаждением ацетоном в соотношении i : 2.5 об./об., подвергали электрофорезу в ПААГ в градиенте концентраций геля 5-20%. Полосы с липазной активностью обнаруживали по цветной реакции [19].
Определение молекулярной массы липаз проводили методами гель-фильтрации на колонке с Sephadex G-100 Superflu (Pharmacia, Щвеция) [20] и электрофореза в полиакриламид-ном геле в присутствии SDS [19].
Аминокислотный состав липаз определяли на автоматическом аминокислотном анализаторе ААА-339Т МИКРОТЕХНА (Чехословакия).
Гидролитическую активность липазы определяли модифицированным методом Yamada и Machida [21]. Субстрат - оливковое масло. За единицу активности липазы принимали такое количество фермента, которое освобождает i ^моль жирной кислоты за i мин.
Результаты и их обсуждение
Индуцированность биосинтеза липазы Rh. oryzae 1403 исследовалась в присутствии твинов (они были взяты в качестве источников жирных кислот, которые являются твердыми при температуре 30°С); растительных масел, жирных кислот. Исследования проводились на
Компонент Массовая доля, % ЛА, ед./см3 ЛА, %
Среда без индуктора - 12.0 100
Олеиновая кислота 0.5 41.8 350
Линолевая кислота 0.5 27.8 230
Твин 20 1.0 33.6 280
Твин 40 1.0 43.7 360
Твин 60 1.0 39.3 330
Твин 80 1.0 47.4 395
среде с пептоном (3%) и солями (%): (NH4)2HPO4 - 0.5; MgSO4 - 0.05; FeSO4 - 0.01; KH2PO4 -
0.1. Из представленных результатов видно (табл. 1 и рис. 1), что биосинтез липазы Rh. oryzae
1403 индуцируется как субстратами - триацилглицеролами, так и продуктами их гидролиза -
жирными кислотами и их производными - твинами.
„ , Активность увеличивалась в
Таблица 1 j , ,
ту 2.3-4.0 раза. Самый высокии эффект
Влияние жирных кислот и твинов ° ^ ^ ^«^шп DU"A'1V"" ^^л^гч
на биосинтез липазы Rh. oryzae 1403 дали оливковое масло, твин 80 и
олеиновая кислота. По всей вероятности, химическая структура жирной кислоты имеет значение: по мере возрастания длины углеводородной цепи от 12 : 0 (Твин 20) до 18:0 (Твин 80) индукция усиливалась. Полиненасыщенные жирные кислоты и оксикис-лоты на этом фоне выделялись меньшим положительным влиянием: льняное масло давало увеличение активности по сравнению с пептонно-солевой средой в 2.7 раза, а касторовое -в 1.4 раза. На среде с соевой мукой наблюдалось даже уменьшение активности в присутствии касторового масла. Глицерин на биосинтез липазы стимулирующего действия не оказывал.
На биосинтез липаз микроорганизмами могут оказывать влияние поверхностно-активные вещества. Однако эти сведения весьма противоречивы [3, 4, 12, 22]. Даже у одного и того же продуцента - Acinetobacter calсoacеticus ПАВ из одной - полиэтоксилатной -группы вызывали повышение активности до 15 раз или полное подавление роста. Имеет значение концентрация: в присутствии твина 80 при 0.008% активность увеличивалась в 2.5 раза, а при 1% снижалась более чем на 50% [13]. При культивировании Pseudomonas sp., штамма 109 добавление соевого масла или неионного детергента (Noigen HC) приводило к увеличению содержания внеклеточной липазы в 56 раз [23].
ПАВ в составе питательной среды при культивировании продуцентов липаз могут оказывать разностороннее действие: и непосредственно на клетки, и на доступность нерастворимого в воде липидного индуктора для микроорганизма, и на процесс выделения фермента из клеток, и, возможно, на сам фермент.
Нами было исследовано влияние различных ПАВ на биосинтез липазы Rh. oryzae 1403 на фоне среды (%): соевый жмых - 2; кукурузный экстракт - 1.0; (NH4)2HPO4 - 0.5 и подсолнечное масло - 0.5. Результаты, представленные в табл. 2, показывают, что ПВС и фосфатид-ный концентрат оказывали слабое влияние на биосинтез липазы грибом. Отрицательное действие проявлял бридж. Тритоны сильно отличались по эффекту. При добавлении тритона Х-100 удалось повысить активность фермента в 1.35 раза.
Исследования состава липолитического комплекса Rh. oryzae 1403 при культивировании на средах с добавлением различных индукторов и без них показали, что на пептонно-солевой среде и с твином 20 образовывалась одна форма липазы. При введении в питательную среду оливкового масла, олеиновой кислоты и других твинов синтезировалась еще одна форма липазы (рис. 2).
Для Candida rugosa А.Т.С.С. 14830 также показано, что профиль изоформ сильно зависит от состава среды. На питательной среде без липидов была обнаружена одна форма липазы, при добавлении твина 20 выявилась еще одна форма фермента, а в присутствии твина 80 идентифицирована совершенно иная липаза [16].
45 40 35 30 25 20 15 10 5 0
Рис. 1. Липазная активность при культивировании Rhizopus oryzae 1403 на пептонно-солевой среде (1) и с добавлением масел (0.5%): оливкового (2); горчичного (3); подсолнечного (4); хлопкового (5); льняного (6); касторового (7)
Таблица 2
Влияние ПАВ на биосинтез липазы грибом Rh. oryzae 1403
Наименование ПАВ Массовая доля ПАВ, % ЛА, ед./см3 ЛА, %
Среда без ПАВ - 66.8 100
ПВС 0.1 70.5 105
Фосфатидный концентрат 0.1 69.7 104
Тритон Х-100 0.1 76.8 115
0.01 90.2 135
Тритон Х-405 0.1 59.3 89
0.01 63.5 95
Бридж 35 0.1 16.7 25
0.01 23.4 35
Бридж 58 0.1 13.0 20
0.01 20.1 30
1 2 3 4 5
6 7
Разносторонние исследования образования множественности изоформ липазы проведены для Candida rugosa. Сначала у этого продуцента было описано два, а позже -семь генов, кодирующих липазы и эстеразы (пять из них - липазы). Они в настоящее время полностью оха-растеризованы [18]. Geotrichum can-didum F0401B образует внеклеточные липазы А и С, которые предпочтительно расщепляют связи по положениям sn-1.3- и sn-2-триацилглицерола соответственно [24]. Множественность изоформ липаз может быть обусловлена изменениями в экспрессии генов, различным количеством ковалентно связанных углеводов, частичным протеолизом и другими трансляционными модификациями. Отмечается, что гетерогенность изоформ липаз, обнаруженных у грибов и дрожжей, может быть частично связана с ге-терогликозилированием и нековалентными ассоциациями гли-козидных примесей с липазным компонентом [25, 26]. Липазы Rhizopus oryzae 1403 были получены в гомогенном виде с помощью последовательных стадий гель-фильтрации на Sephadex G-150 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭЦ ДЕ-52. Гомогенность ферментов подтверждена повторной гель-фильтрацией и электрофорезом. Удельная активность составила для Липазы I 3600 и Липазы II 2150 ед./мг белка.
Рис. 2. Выявление липазы после электрофореза фильтрата культуральной жидкости при выращивании Rh. oryzae 1403 на различных средах: 1 - пептонно-солевая; 2 - с соевым жмыхом без тритона; 3 - то же, с тритоном Х-305; 4 - пептон-но-солевая с твином 80; 5 - то же с твином 60; 6 - то же с тви-ном 40; 7 - то же с твином 20
■ ... . : ■ кДа 1 95 66
23
10
9
М
8
7 -6 -5 -
4 3 2 -1 -
0
Фракции I, II
0
0,4 0,6 0,8
Rf
Рис. 3. Определение молекулярной массы липаз: а) - электрофорез: 1 - маркерные белки; 2 - Липаза I; 3 - Липаза II; б) - калибровочный график: 1 - лизоцим; 2 - соевый ингибитор трипсина; 3 - карбоангидраза; 4 - овальбумин; 5 - сывороточный альбумин; 6 - целлюлаза
0,2
1
Молекулярная масса Липаз I и II, определенная гель-фильтрацией на Sephadex G-150, находилась в пределах 40-45 кДа. Исследования молекулярной массы методом электрофореза в присутствии SDS показали, что она практически была одинаковой у двух изоферментов и равнялась 44±2 кДа (рис. 3).
Аминокислотный состав Липазы I и Липазы II представлен в таблице 3.
В обоих изоферментах содержание неполярных аминокислот (35,77 и 35,50%) было невысоким. Подобные данные сообщены для липазы Rh. delemar и Humicola lanuginosa [27], Mucor hiemalis [28], Candida parapsilosis [29]. Гидрофобных аминокислот в изоферментах было больше в 1.34-1.4 раза, чем полярных заряженных. У липаз Rh. microsporus количество неполярных остатков было больше полярных в 1.3-1.6 раза [30, 31]; для панкреатических липаз свиньи и крысы оно практически одинаково [32].
Между изоформами наблюдалось большое соответствие в аминокислотном составе за исключением Asx, Pro, Gk, Arg, Ser и Val. Подобие состава аминокислот наблюдается иногда не только между изоферментами, но и видами, принадлежащими к одному роду грибов. Высокое сходство (около 50 %) у липаз Rh. oryzae 1403 наблюдается с липазой Rhizomucor miehei [33].
Заключение
Таким образом, доказано, что биосинтез липаз микромицетом Rh. oryzae 1403 носит индуцибельный характер. С большой достоверностью можно утверждать, что этот продуцент способен синтезировать два липолитических фермента. По всей видимости, в данном случае происходит контроль на уровне экспрессии генов липазы.
Список литературы
1. Zhang Y., Liu J., Qiu L., Shi Y., Su Z., Xia Y., Li F. Optimisation of cultivation conditions of a mutant of Trichosporon laibachii CBS 5791 for enantioselective resolution of ketoprofen ester // Ann. Microbiol. - 2005. -Vol. 55. - № 2. - P. 101-106.
2. Iwai M., Tsujisaka Y., Okamoto Y., Fukumoto Y. Lipid reguirement for lipase production by Geotri-chum candidum // Agr. Biol. Chem. - 1973.- Vol. 37. - № 4.- Р. 929-931.
3. Рубан Е. Л. Микробные липиды и липазы. - М.: Наука, 1977. - 216 с.
4. Вецозола А. О., Лука В. Т. Сравнительное изучение влияния растительных масел и ПАВ на биосинтез липазы дрожжами Candida paralipolytica 739 // Влияние условий культивирования на активность продуцентов.- Рига, 1980.- С. 156-159.
5. Yang X.-h., Yin C.-h., Fu S.-z., Wang B.-w., Tan T.-w. Оптимизация культуральной среды для продукции липазы иммобилизованными клетками Rhizopus arrhizus и свойства липазы // Zhongguo youzhi = China Oils and Fats. - 2004. - Vol. 29. - № 7. - P. 29-32.
6. Ксандопуло Г. Б. Влияние некоторых жиров и поверхностно-активных веществ на липазную активность грибов рода Geotrichum // Микробиол. - 1974.- Т. 43. - № 6. - С. 1001-1004.
7. Dalmau E., Montesinos J. L., Lotti M., Casas C. Effect of different carbon sources on lipase production by Candida rugosa // Enzyme Microb. Technol. - 2000. - Vol. 26. - № 9-10. - P. 657-663.
8. Yasser Refaat A.-F. Optimization of thermostable lipase production from a thermophilic Geobacillus sp. using Box-Behnkenexperimental design // Biotechnol. Lett. - 2002. - Vol. 24. - № 14. - P. 1217-1222.
9. Zhang L. Y., Wei D. Z., Tong W. Y. Effective inducers for lipase production by Candida rugosa // Ann. Microbiol. - 2003. - Vol. 53. - № 4. - P. 499-504.
10. Dai D., Xia L. Enhanced production of Penicillium expansum PED-03 lipase through control of culture conditions and application of the crude enzyme in kinetic resolution of racemic allethrolone // Biotechnol. Progr. - 2005. - Vol. 21. - № 4. - P. 1165-1168.
11. Hasan F., Shah A. A., Hameed A. Influence of culture conditions on lipase production by Bacillus sp. FH5 //Ann. Microbiol. - 2006. - Vol. 56. - № 3. - P. 247-252.
Tаблица 3
Аминокислотный состав (%) липаз Rhizopus oryzae 1403
Аминокислота Rhizopus oryzae 14Q3 Rhizomucor miehei [258]
Липаза I Липаза II
Ala 6.19 6.6Q 5.43
Cys 1.13 1.63 1.91
Asx ю.56 9.43 Ю.78
Glx 9.78 7.99 8.94
Phe 7.61 7.36 5.22
Gly 4.91 5.38 3.89
His 2.11 2.25 2.Ш
Ile 6.53 7.17 6.21
Lys 2.92 3.38 3-3Q
Leu 7.23 7.85 8.88
Met 1.75 1.15 1.68
Pro 4.98 7.74 6.23
Arg 3.43 4.56 5.27
Ser 9.52 8.14 9.Ш
Thr 8.86 9.Ю 8.86
Val 8.21 6.52 8.52
Tyr 3.38 2.66 7.36
Trp q.88 1.Q5 1.84
12. Султанова И. Г., Зубенко Т. Ф. Влияние некоторых поверхностно-активных веществ на биосинтез липазы грибом штамм Rhizopus microsporus УзЛТ-1 // Узбекский биолог. журн.- 1976.- № 5.-С. 71-72.
13. Haperburg D., Kleber H.-P. Exracellulare lipase aus Acinetobacter calcoaceticus // Acta Biotechnologica. - 1982. - Vol. 2. - № 4. - P. 337-342.
14. Условия синтеза липазы Plancoccus migula in vitro / Wang H.-j., Mei Z.-q., Liu X.-z., Huang Y.-b., Piao Z.-s. // Jilin daxue xuebao. Lixue ban = J. Jilin Univ. Sci. Ed. - 2002. - Vol. 40. - № 4. - P. 430-432.
15. Cloning and nucleotide sequence of two lipase genes from Candida cylindracea / Longhi S., Fusetti F., Grandon T., Lotti M., Vanoni M., Alberghina M. // Biochim. Biophys. Acta. - 1992. - Vol. 1131. - P. 227-232
16. Chang R.-C., Chou S.-J., Shaw J.-F. Multiple forms and functions of Candida rugosa lipase // Bio-technol. Appl. Biochem. - 1994. - Vol. 19. - P. 93-97.
17. Ibrik A., Chahinian H., Rugani N. et al. Biochemical characterization of triacylglycerol lipase from Penicillium cyclopium // Lipids. - 1998. - Vol. 33. - P. 377-384.
18. Characterization of the lipase and esterase multiple forms in an enzyme preparation from a Candida rugosa pilot-plant scale fed-batch fermentation / Sanchez A., Ferrer P., Serrano A., Pernas M. A., Valero F., Rúa M. L., Casas C., Sola C. // Enzyme Microb. Technol. - 1999. - Vol. 25. - № 3-5. - P. 214-223.
19. Гааль Э. Электорофорез в разделении биологических макромолекул. - М.: Мир, 1982. - 446 с.
20. Детерман Г. Гель-хроматография. - М.: Мир, 1970. - 320 с.
21. Yamada K., Machida H. // Nippon N5geikagaku Kaishi (in Japanese). - 1992. - Vol. 36. - P. 858-860.
22. Lin S.-F., Chion C.-M., Tsai Y.-C. Effect of triton X-100 on alkaline lipase production by Pseudomo-naspseudoalcaligenes F-111 // Biotechnol Lett. - 1995. - Vol. 17. - № 9. - P. 959-962/
23. Increased production of lactonizing lipase (Lip I) from Pseudomonas sp. strain 109 by lipids and detergents / Tanaka J., Sudo T., Ihara F., Nihira T., Yamada Y. // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 1999. - Vol. 63. -№ 5. - P. 900-904.
24. Ota Y., Sawamoto T., Hasuo M. Tributyrin specifically induces a lipase with a preference for the sn-2 position of triglyceride in Geotrichum sp. FO401B // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2000. - Vol. 64. - № 11. -
P. 2497-2499.
25. Purification, characterization, and crystallization of two types of lipase from Rhizopus niveus / Kohno M., Kugimiya W., Hashimoto Y., Morita Y. // Bioici. Siatech. Blochem. - 1994. - Vol. 58. - № 6. -P. 1007-1012.
26. Variability within the Candida rugosa lipases family / Lotti M., Tramontane A., Longhi S, Fusetti F., Brocca S., Pizzi E., Alberghina L. // Protein Engineering. - 1994. - Vol. 7, № 4. - P. 531-535.
27. Conformational lability of lipases observed in the absence of an oil-water interface: crystallographic studies of enzymes from the fungi Humicola lanuginosa and Rhizopus delemar / Derewenda U., Swenson L., Green R. et al. // J. Lipid Res. - 1994. - Vol. 35. - P. 524-534.
28. Production, purification and characterization of an extracellular lipase from Mucor hiemalis f. hiemalis / Hiol A., Jonzo M. D., Druet D., Comeau L. // Enzyme Microb. Technol. - 1999. - Vol. 25. - № 1-2. -P. 80-87.
29. The lipase/acyltransferase from Candida parapsilosis: molecular cloning, purification and characterization of purified recombinant enzymes / Neugnot V., Moulin G., Dubreucq E., Bigey F. // Eur. J. Biochem. -2002. - Vol. 269. - P. 1734-1734.
30. Некоторые свойства внеклеточной липазы Rhizopus microsporus УзЛТ-3 / Давранов К.Д., Куйлибаев И.Т., Розмухамедова Б.Х., Махсумханов А.А. // Прикл. биох. и микробиол. - 1995. - Т. 31. -№ 4. - С. 405-411.
31. Очистка и свойства внутриклеточных липаз гриба Rhizopus microsporus / Диеров Ж.Х., Цио-менко А.Б., Давранов К.Д., Кулаев И.С. // Биотехнол. - 1993. - № 7. - С. 26-30.
32. Брокерхоф К., Дженсен Р. Липолитические ферменты. - М.: Мир, 1978.-396 с.
33. Herrgard S., Gibas C. J., Subramaniam S. Role of an electrostatic network of residues in the enzymatic action of the Rhizomucor miehei lipase family // Biochemistry. - 2000. - Vol. 39. - № 11. - P. 2921-2930.
INDUCTION OF BIOSYNTHESIS LIPASES RHIZOPUS ORYZAE 1403
SA Shelamova',Y .А. Tyrsin2
1 Voronezh State Engineering Technology University, RevolutsiiSt., 19, Voronezh, 394017, Russia
E-mail: [email protected]
2Moscow State of Food Production University, Volokolamskoe St., 11, Moscow, 125080, Russia
Biosynthesis lipases Rh. oryzae 1403 induced triglycerides, greasy ac- ids and their by derivative - twins. The activity was increased in 2,3-4,0 times. The highest effect have given olive oil, twin 80 and olein acid. The not polysated greasy acids and oxiacids on this background were allocated with smaller positive influence: the linen oil gave increase of activ- ity in comparison with pepton-salt environment in 2,7 times, and castor oil
- in 1,4 times. Superficial-active substances strongly differed on effect. This продуцент is capable to synthesize two lipases. Molecular weight was iden- tical at two izoenzymes and was equaled 44 кДа. Between izoenzymes the large conformity in aminoacid structure behind exception Asx, Pro, Glx, Arg, Ser и Val.
Keywords: lipase, Rhizopus, biosynthesis.
