CC BY
26
69. Judson P.L., Habermann E.B., Baxter N.N., Durham S.B., Virnig B.A. Trends in the Incidence of Invasive and In Situ Vulvar Carcinoma. Obstet Gynecol 2006;107:1018-22.
70. Johnson L.G., Madeleine M.M., Newcomer L.M., Schwartz S.M., Daling J.R. Anal cancer incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results experience, 1973--2000. Cancer 2004;101:281-8.
71. Schottenfeld D., Winawer S. Cancers of the large intestine. In: Schottenfeld D, Fraumeni J, eds. Cancer epidemiology and prevention. New York, NY: Oxford University Press; 1996:813-40.
72. Greer C.E., Wheeler C.M., Ladner M.B., et al. Human papillomavirus (HPV) type distribution and serological response to HPV type 6 virus-like particles in patients with genital warts. J Clin Microbiol 1995;33:2058-63.
73. Winer R.L., Kiviat N.B., Hughes J.P., et al. Development and duration of human papillomavirus lesions, after initial infection. J Infect Dis 2005;191:731-8.
74. Chuang T.Y., Perry H.O., Kurland L.T., Ilstrup D.M. Condyloma acuminatum in Rochester, Minn., 1950-1978. I. Epidemiology and clinical features. Arch Dermatol 1984;120:469-75.
75. Insinga R.P., Dasbach E.J., Myers E.R. The health and economic burden of genital warts in a set of private health plans in the United States. Clin Infect Dis 2003;36:1397-403.
76. Reeves W.C., Ruparelia S.S., Swanson K.I., Derkay C.S., Marcus A., Unger ER. National registry for juvenile-onset recurrent respiratory papillomatosis. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2003;129:976-82.
77. Armstrong L.R., Preston E.J., Reichert M., et al. Incidence and prevalence of recurrent respiratory papillomatosis among children in Atlanta and Seattle. Clin Infect Dis 2000;31:107-9.
78. CDC. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2002. MMWR 2002;51(No. RR-6).
79. Winer R.L., Hughes J.P., Feng Q., et al. Condom use and the risk of genital human papillomavirus infection in young women. N Engl J.
Некоторые характеристики процесса получения препаратов рестриктаз ЕеоШ, ВатН1, BglII, Рэ11, РтИ и использование рестриктаз РтП и PstI для изучения хромосомных ДНК из менингококков
И.Э. Борисова, В.А. Юркив
ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва
Изучение характера гидролиза хромосомных ДНК из патогенных штаммов микроорганизмов с помощью рестрикционных эндонуклеаз имеет важное значение для эпидемиологического анализа патогенных бактерий. Поскольку менин-гококковая инфекция еще встречается в виде эпидемий в разных странах мира, изучение штаммов Neisseria meningitidis, осуществленное с помощью рестрикционного анализа хромосомных ДНК, позволит усовершенствовать эпидемиологический надзор за возбудителем менингококковой инфекции и профилактику менингококковой инфекции.
Специфические эндонуклеазы (рестриктазы) II класса применяются для картирования генома различных микроорганизмов, расшифровки первичной структуры ДНК, выделения индивидуальных генов и конструирования гибридных молекул.
Целью настоящего исследования стало описание некоторых характеристик методов очистки, предложенных для рестриктаз EcoRI, BamHI, BglII, PstI, PmiI [1, 2, 4], и использование рестриктаз PmiI и PstI для изучения хромосомных ДНК менингококков.
Материалы и методы
Для выделения специфических эндонуклеаз были использованы штаммы-продуценты Escherichia coli (K-12 1100 NM182), Bacillus amyloliquefaciens HI, Bacillus globigii, Providencia stuartii, Proteus mirabilis 1667. Хромосомные ДНК менингококков были выделены из клеток Neisseria meningitidis. Штаммы N. meningitidis (восемь штаммов) были выделены как возбудители менингококковой инфекции, один штамм не вызывал инфекции. Для очистки рестриктаз использовали коммерческие Р-11-фосфоцел-люлозу (Whatman, Великобритания), DE-52-целлюло-зу (Whatman, Великобритания), голубую сефарозу
(Pharmacia, Швеция) и некоторые широко употребляемые реактивы. Для тестирования препаратов рестриктаз была использована ДНК фага X.
Культивирование штаммов-продуцентов рестриктаз проводили методом глубинного культивирования с использованием отечественных питательных сред (бульона Хоттингера, мясопептонного бульона).
Выделение препаратов хромосомных ДНК из штаммов N. meningitidis осуществляли по модифицированному методу Мармура [9].
Обработку ДНК специфическими эндонукле-азами проводили в течение 1 - 3 часов в присутствии 1 - 10 единиц активности фермента на 0,5 - 5 мкг ДНК. Объем пробы составлял 20 -200 мкл. При гидролизе использовали инкубационные среды, предложенные Грином и соавт. [8], Боливаром и соавт. [6]. Электрофоретический анализ препаратов ДНК проводили в блоках 0,8 - 1,4%-ного агарозного геля на трисацетат-ном буфере [6].
Результаты и обсуждение
В ранее проведенных исследованиях Н.В. Цветковой и соавт. предложена схема очистки для рестриктаз EcoRI и BamHI [4]. Процесс очистки включал следующие этапы:
1) разрушение микробных клеток;
2) удаление нуклеиновых кислот 10%-ным раствором сульфата стрептомицина;
3) удаление балластных белков (двухступенчатое фракционирование сульфатом аммония);
4) ионообменная хроматография на Р-11-фосфо-целлюлозе (использование градиента NаСl);
5) концентрирование препаратов рестриктаз на DE-52-целлюлозе и против буфера с глицерином.
В данном исследовании охарактеризован процесс очистки с использованием рисунка 1, на котором представлен хроматографический профиль элюции на Р-11-фосфоцеллюлозе диализата, содержащего рестриктазу ЕсоRI (пики, соответствующие проскоку и промывке, на рисунке не показаны). На рисунке 2 представлена электрофоре-тическая картина разделения фрагментов, образующихся при гидролизе ДНК фага X посредством фракций из градиента. Специфическая активность была обнаружена во фракциях с 15-й по 55-ю, что соответствовало молярности NaCl 0,4 - 0,6 М. Максимальное поглощение при 280 нм на хрома-тографическом пике соответствовало 20-й фракции. Значение этого поглощения было близко к величине 2,0 по оптической плотности. Активные фракции объединяли. Тотальный объем созданного пула активных фракций концентрировали на DЕ-52-целлюлозе для повышения стабильности фермента EcoRI при хранении. Специфическая активность была обнаружена во фракциях с 1-й по 4-ю. Фракции, содержащие рестриктазу ЕсоRI, объединяли и дополнительно концентрировали против буфера с глицерином. На рисунке 3 представлен хроматографический профиль элюции на Р-11-фос-фоцеллюлозе диализата, содержащего рестриктазу ВатН1 (пики, соответствующие проскоку и промывке, на рисунке не показаны). Специфическая активность была обнаружена во фракциях с 5-й по 25-ю. Этим фракциям соответствовала моляр-ность NaCl 0,25 - 0,46 М. Максимальное значение поглощения при 280 нм соответствовало 12-й фракции. Значение этого поглощения было близко величине 1,3 по оптической плотности. Активные фракции объединяли. Тотальный объем созданного пула активных фракций концентрировали на DЕ-
Рисунок 2.
Специфическая активность (Есой1) во фракциях градиента (хроматография на Р-11-фосфоцеллюлозе)
1 - проба из фракции 15
2 - проба из фракции 23
3 - проба из фракции 31
4 - проба из фракции 39
5 - проба из фракции 47
1 2 3 4 5
52-целлюлозе для повышения стабильности фермента ВатН1 при хранении. Специфическая активность была обнаружена во фракциях со 2-й по 6-ю. Фракции, содержавшие рестриктазу ВатН1, объединяли и дополнительно концентрировали против буфера с глицерином. Данный метод позволил получить препараты рестриктаз EcoRI и ВатН1, специфически фрагментирующие ДНК фага X и не содержащие примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз.
В ранее проведенных исследованиях И.Э. Семина предложила схему очистки рестриктазы BgШ на аффинном сорбенте - голубая сефароза [2]. На рисунке 4 представлен хроматографический профиль элюции на ней супернатанта, содержащего рестриктазу BgШ. Специфическая эндонуклеаза BgШ элюировалась во фракциях с 23-й по 40-ю. Этим фракциям соответствовала молярность NaCl 0,2 - 0,4 М. Препарат рестриктазы BgШ после очистки вполне пригоден для физического карти-
Рисунок 1.
Хроматографический профиль элюции с Р-11-фосфоцеллюлозы (очистка рестриктазы Есой1)
А280о.е.
2,0 -
1,0 -
Рестриктаза EcoRI 0,35 - 0,55 M NaCl
2-й белковый пик
NaCl, M
0,8
0,7 0,6
0,5 0,4
20
40
60
80
100 120
№ фракций
Рисунок 3.
Хроматографический профиль элюции с Р-11-фосфоцеллюлозы (очистка рестриктазы BamHI)
А280о.е.
1,3 -1,2 -1,1 1,0 -0,9 -0,8 -0,7 -0,6 -0,5 -0,40,3 0,2 0,1 -
Рестриктаза BamHI 0,25 - 0,46 M NaCl
NaCl, M
№ фракций
рования ДНК. В предложенном методе отсутствовали стадии осаждения сульфатом стрептомицина, фракционирования сульфатом аммония, процессы диализа. Метод являлся простым и технологичным и мог использоваться для мелкосерийного производства препаратов некоторых ферментов рестрикции. Одностадийную хроматографию на голу-Рисунок 4.
Хроматографический профиль элюции с голубой сефарозы (очистка рестриктазы BglII)
бой сефарозе применяли Дж. Чирикьян, а также К. Бакси с соавт. для получения препаратов рест-риктаз HinfI и ВаmНI, не содержащих неспецифических нуклеаз [7, 5]. В экспериментах, проведенных ранее И.Э. Семиной, по выделению рестриктазы PstI из биомассы Providencia stuartii, собранной в начале стационарной фазы роста, не получилось
А280о.е.
Рестриктаза BglII 0,23 - 0,40 M NaCl
NaCl, M
0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 № фракций
ЦЦ Эпидемиология
удалить значительную часть неспецифических нук-леаз при фракционировании на голубой сефарозе супернатанта, содержавшего рестриктазу PstI [2]. Для дополнительной очистки применили ионообменную хроматографию на Р-11-фосфоцеллюлозе [2]. Такая же схема, как для PstI, была использована Н.Л. Бахом и соавт. для очистки рестрик-тазы Pmil из штамма Proteus mirabilis 1667 [1]. Двухстадийная очистка на голубой сефарозе и Р-11-фосфоцеллюлозе позволила получить препараты рестриктаз BglII, PstI и Pmil, не содержащие примесей неспецифических нуклеаз и фосфатаз.
Рестриктазы Pmil и PstI были использованы для гидролиза препаратов хромосомных ДНК, выделенных из различных штаммов менингококков. При гидролизе рестриктазой Pmil препаратов хромосомных ДНК из штаммов-возбудителей менингококковой инфекции образовалось значительное количество рестрикционных фрагментов с различными молекулярными массами. Электро-форетическая картина разделения фрагментов, образовавшихся после гидролиза с помощью рестриктазы Pmil хромосомной ДНК из штамма, не вызывающего инфекции, представляла картину частичного гидролиза при значительной степени недогидролиза. В треке 10 представлена картина стандартного гидролиза ДНК фага X рестриктазой Pmil. Характер гидролиза указывал на наличие высокой активности у рестриктазы Pmil. Рестриктаза Pstl практически не гидроли-зовала ни один из исследованных препаратов хромосомных ДНК. В треке 20 представлена картина гидролиза препарата хромосомной ДНК из штамма Bordetella pertussis 305 с помощью рестриктазы Pstl. Характер гидролиза указывал на наличие высокой активности у рестриктазы Pstl. Рестриктазы, полученные по схемам Н.В. Цвет-
ковой и соавт., И.Э. Семиной, Н.Л. Баха и соавт. [4, 2, 1], были использованы для изучения характера гидролиза хромосомной ДНК из штамма Bordetella pertussis 305 [3]. В данной работе рестриктазы, полученные по этим схемам, были использованы для изучения хромосомных ДНК менингококков. Таким образом, следует предположить, что рестрикционный анализ хромосомных ДНК может быть применен для установления различий между патогенными и непатогенными штаммами микроорганизмов и для изучения детерминант вирулентности. Для рестрикцион-ного анализа необходимы препараты рестриктаз достаточной степени чистоты. Схемы, описанные в данной работе, могут использоваться для получения препаратов рестриктаз, пригодных для исследований хромосомных ДНК патогенных и непатогенных штаммов микроорганизмов, а также для исследований препаратов ДНК другого типа. Дальнейшие исследования, направленные на усовершенствование схем очистки рестрик-таз, позволят разработать новые, сокращенные технологичные схемы, с помощью которых исследователи будут выделять и очищать рестриктазы, пригодные для рестрикционного анализа различных препаратов ДНК.
Выводы
1. При гидролизе с помощью рестриктазы Pmil препаратов хромосомных ДНК из восьми штаммов возбудителей менингококковой инфекции образуется набор значительного числа рестрикцион-ных фрагментов с различными молекулярными массами.
2. Рестриктаза Pstl не гидролизует препараты хромосомных ДНК, полученные из различных штаммов менингококков. Ш
Summary
Two schemes of the purification of restriction endonuclease EcoRI, BamHI, BglII, PstI and PmiI are presented. Chromatographic profiles of the elution of restriction endonucleases EcoRI, BamHI and BglII are presented and are described. Restriction endonucleases PmiI and PstI were used for the study of chromosomal DNAs of meningococci. The results suggested that the preparations of restriction endonucleases, which have neccessary level of the purification, may be use for the study of the differences between pathogenic strains and nonpathogenic strains of microorganisms.
Литература
1. Бах Н.Л., Цветкова Н.В., Семина И.Э. и др. Выделение и очистка рес-трикционной эндонуклеазы Pmil из штамма Proteus mirabilis 1667. -Антибиотики и медицинская биотехнология. 1985. Т. XXX, № 5. С. 342, 343.
2. Семина И.Э. Оптимизация процесса получения препаратов рестриктаз и их использование для клонирования ДНК Bordetella pertussis: Дис. ... к.б.н. - М., 1982.
3. Семина И.Э., Цветкова Н.В., 1араев М.М. Изучение ДНК возбудителя коклюша Bordetella pertussis // ЖМЭИ. 1982. № 7. C. 65 - 68.
4. Цветкова Н.В., Жданова Л.Г., Грубер И.М. и др. Выделение и очистка бактериальных эндонуклеаз // Тезисы III Всесоюзной конференции по методам получения и анализа биохимических препаратов. - Рига, 1979. С. 89 - 90.
5. Baksi K., Rogerson D.L., Rushizky C.W. Rapid, single-step purification of restriction endonucleases on Cibacron Blue F3GA-agarose // Biochemistry, 1978. V. 17. № 20. P. 4136 - 4139.
6. Bolivar F., Rodrihuez R., Betlach M. et al. Construction of new vehicles. I Ampicilin-resistance derivatives of the plasmid pMB9 // Gene, 1977. V. 2. P. 75 - 93.
7. George J., Chirikjian G. Biospecific fractionation matricks for sequence specific endonuclease // Nucleic Acids Research. 1978. V. 5. № 7. P. 2223 - 2232.
g.. ...Green RJ.;- Heyneker- M.L.v ■ Bolivar ■ F.- et al.- General ■ method for -purification of restriction endonucleases // Nucleic Acids Research. 1978. V. 5, 7. P. 2373 - 2380.
9. Marmur J. A procedure for isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms // Journal of Molecular Biology. 1961. V. 3. P. 208 - 218.
