CC BY
15
УДК 577.21.577.151
КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ БИОХИМИЧЕСКИХ И КИНЕТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ Ml.BspACI
М.В. Тарасова12, В.В. Кузнецов3, Н.А. Нетесова3, Д.А. Гончар1, С.Х. Дегтярев1
(Научно-производственное объединение "СибЭнзим", г. Новосибирск;
2Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск;
3ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Роспотребнадзора, Колъцово, Новосибирская обл.; e-mail: tarasovamv@sibenzyme.ru)
Гены ДНК-метилтрансфераз системы рестрикции-модификации BspACI из Bacillus psychrodurans AC клонировали в клетках E. coli. Анализ аминокислотных последовательностей белков, кодируемых этими генами, показал, что они оба относятся к классу С5 ДНК-метил-трансфераз. Ген M1.BspACI субклонировали в составе экспрессирующего вектора pJW2. Препарат высокоочищенного рекомбинантного фермента получали с помощью хроматографии на различных носителях. Установлено, что M1.BspACI модифицирует первый цито-зин в последовательности 5'-CCGC-3'. Определены кинетические параметры реакции метилирования ДНК ферментом и показано, что каталитическая константа оказалась равной 0,095 ± 0,002 мин-1, Km ДНК фага х - 0,053 ± 0,007 мкМ, Km SAM - 5,1 ± 0,3 мкМ.
Ключевые слова: ДНК-метилтрансфераза, клонирование генов, Bacillus psychrodurans, ферментативная кинетика.
ДНК-метилтрансферазы (метилазы, М) — сайт-специфические ферменты, катализирующие перенос метильной группы от донора, S-аденозил-Ь-метио-нина (SAM), на адениновое или цитозиновое основание в определенной нуклеотидной последовательности. У прокариотических организмов, как правило, эти ферменты вместе с эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами, R) образуют системы рестрикции-модификации (RM-системы), основной функцией которых является защита клетки от чужродной ДНК. Большинство RM-систем с несимметричными узнаваемыми последовательностями (подтип IIS) включают чаще всего две ДНК-метилтрансферазы, каждая из которых модифицирует лишь одну из цепей ДНК.
Ранее нами был выявлен штамм Bacillus psychrodurans AC, который продуцирует эндонуклеазу рестрикции, узнающую непалиндромную последовательность 5'-CCGC-3' [1]. В представленной работе описано клонирование, выделение, биохимические и субстратные свойства рекомбинантной ДНК-ме-тилтрансферазы Ml.BspACI.
Методы исследования
Клонирование генов метилтрансфераз РМ системы BspACI выполнялось согласно стандартным методам [2]. Суммарная плазмидная ДНК, состоящая из PstI- и Zsp2I-фрагментов хромосомной ДНК Bacillus psychrodurans AC в составе плазмидного вектора pUC19, обрабатывалась рестриктазой BspACI и трансформировалась в клетки E. coli ER2267. Плазмида одного из полученных таким
образом клонов использовалась для субклонирования гена метилтрансферазы в составе вектора pJW2 по сайтам рестрикции FauNDI и BamHI. Полученные клоны подвергали термоиндукции и наблюдали появление полосы, соответствующей целевому белку, в 10%-м SDS-полиакриламидном геле.
Выделение рекомбинантной Ml.BspACI проводили путем последовательной хроматографической очистки на колонках с использованием следующих носителей: фосфоцеллюлозы P-11, гидроксилаппати-та — для второй и пятой стадий, гепарин-сефарозы, сефакрила S-200. Наличие активной Ml.BspACI в профиле определяли по защите ДНК фага X от гидролиза рестриктазой BspACI (инкубированной с алик-вотами из фракций). Отсутствие примесных белков в готовом препарате контролировали с помощью электрофореза в 10%-м SDS-полиакриламидном геле. Оптимальную температуру, рН и концентрацию ионов калия и натрия определяли по интенсивности включения меченного SAM за 60 мин реакции.
Определение метилируемого основания в сайте узнавания Ml.BspACI проводилось с помощью оли-гонуклеотидного дуплекса М1АС (рисунок).
Структура синтетического олигонуклеотидного дуплекса М1АС. Жирным шрифтом выделен сайт узнавания МЬВярАСГ, в сплошной рамке сайт узнавания Я.Рок1, в пунктирной — места расщепления ДНК указанными фер-
ментами обозначены соответственно сплошными и пунктирными стрелками
Значения каталитических параметров некоторых ДНК-метилтрансфераз IIS типа
Фермент, сайт узнавания Субстрат kcat, мин-1 Km ДНК нМ Km SAM, мкМ Ссылка
EcoRII CCWGG ДНК фага X 2,52 0,22 — [4]
EcoHK31I YGGCCR плазмида pWM2372 3,0 2 0,58 [5]
MspI CCGG ДНК фага X 10,2 1,8 0,013 [6]
M1.BspACI CCGC ДНК фага X 0,095 53 5,1 Данная работа
Дуплекс метилировали Ml.BspACI с использованием меченого тритием SAM, делили на две равные части и расщепляли рестрикта-зами FokI и AlwI. Затем для каждого фрагмента подсчитывали количество включенной метки.
Определение стационарных кинетических параметров реакции метилирования ДНК по каждому из субстратов проводилось при насыщении по другому субстрату. Реакцию проводили с использованием меченого тритием SAM в течение 1 ч при оптимальных условиях работы фермента. Определение наличия неканонического метилирования проводилось в условиях реакции одного оборота.
Результаты и их обсуждение
Клонирование генов метилаз РМ системы BspACI. В результате отбора клонов, несущих вектор pUC19 со встроенными фрагментами хромосомной ДНК B. psychrodurans AC, была получена плазмида pMBspACI, содержащя вставку длиной около 4 т.п.н., обладающая защитой к гидролизу рест-риктазой BspACI. Анализ аминокислотных последовательностей двух открытых рамок трансляции длиной 320 и 455 аминокислотных остатков, обнаруженных во вставке, показал их принадлежность к классу С5-метилтрансфераз. Плазмида pMBspACI была использована для дальнейшего субклонирования одного из генов метилаз в составе экспресси-рующего вектора pJW2. В итоге была получена ре-комбинантная плазмида pM1BspACI, несущая функционально активный ген bspAC1M1.
Выделение препарата ДНК-метилтрансферазы. Из 4,5 г сырой биомассы было получено 4,5 мл гомогенного препарата фермента с концентрацией 0,35 мкг/мкл. Были определены оптимальные условия работы рекомбинантного фермента: максимальная его активность проявлялась при температуре 30°, pH 8 и отсутствии ионов калия и натрия в реакционной среде.
Определение метилируемого основания. После расщепления Н-меченого дуплекса M1AC отдельно рестриктазами FokI и AclWI было получено восемь
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Тарасова М.В. и др. Новая сайт-специфическая эндонуклеаза BspACI из Bacillus psychrodurans AC узнает последовательность 5'-CCGC-3'/3'-GGCG-5' // Вестн. био-технол. и физ.-хим. биол. 2010. Т. 5. № 1. С. 16—24.
2. Sambrook J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 1659 с.
3. Чернухин В.А. и др. Рекомбинантная ДНК-метилт-рансфераза M2.BstSEI из никазно-метилазной системы NM.BstSEI: получение и свойства // Мол. биол. 2009. Т. 43. № 1. С. 10—18.
одноцепочечных фрагментов ДНК. Максимальные значения количества радиоактивной метки были зафиксированы для фрагментов длиной 21 и 20 нук-леотидов, что может наблюдаться только в том случае, если Ml.BspACI образует 5'-(5mC)CGC-3'.
Определение стационарных кинетических параметров реакции метилирования ДНК. Значение константы Михаэлиса, вычисленное регрессионным анализом на основе данных, полученных при измерении скорости реакции метилирования от концентрации ДНК фага X, составило 0,053 ± 0,007 мкМ. Константа Михаэлиса для второго субстрата, SAM, оказалась равной 5,1 ± 0,3 мкМ. Значение каталитической константы составило 0,095 ± 0,002 мин-1. Ранее в нашей лаборатории было показано, что Km днк У IIS метилтрансфераз более чем на порядок выше, чем Ктднк У ферментов, узнающих симметричные последовательности [3]. Полученное нами значение Кт днк Ml.BspACI согласуется с данной закономерностью (таблица). Также мы показали, что каталитическая константа M2.BspACI более чем в 25 раз ниже минимального значения этого параметра для представленных в таблице 2 С5-метилтранс-фераз с палиндромными сайтами узнавания.
Таким образом, в случае как N6-, так и С5-ме-тилтрансфераз, ферменты, узнающие палиндромные сайты узнавания, проявляют большую активность и эффективнее связываются с ДНК, чем метилтранс-феразы, модифицирующие непалиндромные последовательности ДНК.
4. Kossykh V.G. et al. Function of Pro-185 in the ProCys of conserved motif IV in the EcoRII [cytosine-C5]-DNA me-thyltransferase // FEBS Lett. 1995. Vol. 370. N 1-2. P. 75-77.
5. Lee K.F. et al. Overproduction, purification and characterization of M.EcoHK31I, a bacterial methyltransferase with two polypeptides // Biochem. J. 1996. Vol. 314. N 1. P. 321-326.
6. Bhattacharya S.K. et al. Kinetic mechanism of cy-tosine DNA methyltransferase Mspl // J. Biol.Chem. 1999. Vol. 274. N 21. P. 14743-14749.
Поступила в редакцию 31.05.10
CLONING AND ANALYSIS OF BIOCHEMICAL AND CATALYTIC PROPERTIES
OF DNA METHYLTRANSFERASE Ml.BspACI
M. V. Tarasova, V. V. Kuznetsov, N.A. Netesova, D.A. Gonchar, S.Kh. Degtyarev
Genes coding for the DNA methyltransferases of restriction-modification system BspACI from Bacillus psychrodurans AC have been cloned in E. coli cells. The analysis of amino acid sequences of the proteins showed that both these genes belong to C5 DNA methyltransferases. Gene bspACIMl has been subcloned in pJW2 vector. High-purity recombinant enzyme has been obtained with chromatography on different carriers. It has been shown that Ml.BspACI modifies the first cytosine residue in the sequence 5'-CCGC-3'. Kinetic parameters have been determined. The catalytic constant appears to be 0,095 ± 0,002 min-1, Km дНК фага x — 0,053 ± 0,007 мкМ, Km SAM — 5,1 ±0,3 мкМ.
Key words: DNA-methyltransferase, gene cloning, Bacillus psychrodurans, enzyme kinetics.
Сведения об авторах
Тарасова Маргарита Владимировна — Научно-производственное объединение "СибЭнзим", г. Новосибирск; Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Новосибирский государственный университет (НГУ), Новосибирск. Е-mail: ta-rasovamv@sibenzyme.ru
Кузнецов Виталий Викторович — ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребназдора, Кольцово, Новосибирская обл.
Нетесова Нина Александровна — канд. биол. наук, ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребназдора, Кольцово, Новосибирская обл.
Гончар Данила Александрович — канд. биол. наук, Научно-производственное объединение "СибЭнзим", г. Новосибирск.
Дегтярев Сергей Харитонович — докт. биол. наук, проф., Научно-производственное объединение "СибЭнзим", г. Новосибирск.
