CC BY
29
УДК 578.81
Науменко О.В., к.т.н., ст. науковий ствроб1тник © E-mail: naumenkoo@list.ru
1нститутпродовольчихресуравНААН, M.Kuïe, Украгна
НАУКОВО-ПРАКТИЧН1АСПЕКТИ ВИЯВЛЕННЯ 1НГ1БУЮЧИХ РЕЧОВИН У МОЛОЧН1Й СИРОВИН1
Дослгджено in vitro активтстъ антибютиюв щодо промысловых штам1в Lactococcus lactis ssp., Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus ma Streptococcus thermophilus з колекцив1ддту бютехнологп'ШР. Встановлено гхне природне походження, остлъки жоден з них не проявляв антибютикорезистенттстъ на pieni штам1в з набутою сттюстю - значения мшмалъног тг1буючог концентрацИ (MIK) було у межах 0,01-5,0 мг/кг. Показано, що бтъшктъ чутливих штам1в належало до виду S. thermophilus. Запропоновано для анал1зування впливу х1м1чних insi6imopie на лактобактерИ' визначати показник М1К50 - концентращя insiôimopa, за яког гине 50% клтин. Показник М1К50 дае можливктъ оцтити ефективтстъ використання тест-культур для визначення наявност1 msiôimopie у молочтй cupoeuni за гхнъого eMicmy менше мШмалъно тг1буючо1концентраци.
Проведено спрямовану селекцт штам1в лактобактерш за маркером чутливост1 до тг1буючих речовин та eidiôpano 5 тдикаторних культур S. thermophilus. Встановлено меж1 чутливост1 eidiôpanux тест-культур залежно eid типу iHsi6im0pH0S0 фактору. Опрацъовано мжробюлог1чний метод визначення imiôimopie у молочши cupoeuni 3i застосуванням нових тест-кулътур. Резулътати nepeeipKU eidiôpanux тест-культур у промислових умовах встановили гхню ефективтстъ nid час мотторингу молока-сировини на наявтстъ xîmî4hux imiôimopie.
Ключов{ слова: тг1буюч1 речовини, мШмалъна тг1буюча концентращя, селекщя, маркер, тдикаторна культура, межа чутливост1.
УДК 578.81
Науменко О.В., к.т.н., ст. научный сотрудник ИнститутпродоволъственныхресурсовНААН, г.Киев, Украина
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ИНГИБИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ В МОЛОЧНОМ СЫРЬЕ
Исследованы in vitro активность антибиотиков по отношению к промышленным штаммам Lactococcus lactis ssp., Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus из коллекции отдела биотехнологии ИПР. Установлено их природное происхождение, поскольку ни один из них не проявлял антибиотикорезистентностъ на уровне штаммов с приобретенной устойчивостью - значения минимальной ингибирующей концентрации (МИК) было в пределах 0,01-5,0 мг/кг. Показано, что большинство чувствительных штаммов принадлежало к виду S. thermophilus. Предложено для анализа влияния химических ингибиторов на лактобактерии
© Науменко О.В., 2014
119
определять показатель МИК50 - концентрация ингибитора, при которой погибает 50% клеток. Показатель МИК50 дает возможность оценить эффективность использования тест-культур для определения наличия ингибиторов в молочном сырье при их содержании меньше минимальной ингибирующей концентрации.
Проведена направленная селекция штаммов лактобактерий по маркеру чувствительности к ингибирующим веществам и отобрано 5 индикаторных культур S. thermophilus. Установлены границы чувствительности отобранных тест-культур в зависимости от типа ингибиторного фактора. Разработан микробиологический метод определения ингибиторов в молочном сырье с применением новых тест-культур. Результаты проверки отобранных тест-культур в промышленных условиях установили их эффективность во время мониторинга молочного сырья на наличие химических ингибиторов.
Ключевые слова: ингибирующие вещества, минимальная ингибирующая концентрация, селекция, маркер, индикаторная культура, предел чувствительности.
UDC 578.81
O. V. Naumenko, Ph. D., Senior Researcher Institute of Food Resources of National Academy of Agrarian Sciences, Kiev, Ukraine
SCIENTIFIC AND PRACTICAL ASPECTS OF IDENTIFICATION OF INHIBITORY SUBSTANCES IN RAW MILK
Antibiotics activity in relation to industrial strains of Lactococcus lactis ssp., Lactobacillus casei, Lactobacillus acidophilus and Streptococcus thermophilus from the collection of IFR biotechnology department was investigated in vitro. Their natural origin was established, because none of them showed antibiotic resistance on a level of strain acquired resistance - the value of the minimum inhibitory concentration (MIC) was in the range 0.01-5.0 mg/kg. It was shown that the most of sensitive strains belong to the species S. thermophilus. It was proposed for analysis of chemical inhibitors effect on lactic acid bacteria to determine MIC50 - the concentration of inhibitor at which 50% of the cells die. MIC50 indicator allows to estimate the effectiveness of use of test cultures to determine the presence of inhibitors in raw milk at concentrations less than the minimum inhibitory concentration.
Directed selection of strains by the marker of sensitivity to inhibitory substances was conducted and 5 indicator cultures S. thermophilus were selected. The sensitivity limits of the selected test cultures were established depending on the inhibitory factor type. A microbiological method for determining of inhibitors in raw milk using new test cultures was developed. Test results of selected test cultures in industrial conditions set their effectiveness during the monitoring of raw milk for the presence of chemical inhibitors.
Keywords: inhibiting substances, minimum inhibitory concentration, selection, marker, indicator culture, sensitivity limit.
Для контролю шпбуючих речовин, зокрема залишюв антибютиюв в молощ та молочних продуктах застосовують pi3Hi методи: мжробюлопчш, ензиматичш, хроматограф1чш та rnmi [1]. Необхщно зауважити, що
120
мжробюлопчш методи, що використовуються в багатьох крашах для визначення антибютиюв у молочних продуктах, вир1зняються недостатньою стандартизовашстю умов виконання, низькою вщтворювашстю результат, неоднаковою чутливютю та точшстю. Деяк1 дослщники наводять загальний bmîct р1зних антибютимв, iHmi - bmîct окремих антибютимв [2-3].
У нашш KpaÏHi на пщприемствах молоко-сировину контролюють на bmîct шпбуючих речовин згщно з чинним ГОСТ 23454. Метод цього стандарту, заснований на пор1вняльному визначенш дегщрогеназно1 активное^ чутливо! до ÎHriôiTopiB бактер1ального росту тест-культури S. thermophilus за ïï розвитку у молощ, що дослщжуеться, та стандартному зразку молока (який не мктить ÎHriôiTopiB). Проблеми цього методу визначення шпбуючих речовин на сьогодш е дуже актуальними. Це в першу чергу стосуеться обмеженого спектру та меж1 чутливост1 тест-культури, а також тривалост1 проведения анал1зування. Водночас експрес-методи, що визначають наявшсть того чи шшого антибютика впродовж лише 5-15 хв, тим не менше не можуть повшстю замшити контроль шпбуючих речовин за 1хньою сукупшстю. Одним i3 рацюнальних шлях1в виршення n;ieï проблеми е створення простих стандартизованих метод1в анал1зування, використання яких призведе до збшьшення rapaHTiï виявлення антибютимв чи шших ÎHri6iTopiB xiMÎ4HOÏ природи.
Метою роботи був вщб1р найчутливших штам1в лактобактерш до антибютиюв i залишюв миюче-дезшф1куючих засоб1в для використання ïx як тест-культур для визначення шпбуючих речовин у молочнш сировиш.
Матер1али та методи. Об'ектами дослщжень були зразки молока-сировини, пастеризованого молока, штами молочнокислих бактерш з колекци 1ПР. Визначення шпбуючих речовин у молочнш сировиш проводили згщно з ГОСТ 23454-79 з шдикатором метиленоеим ситм. Чутливють штам1в до антибютиюв визначали за методом паперових дисюв. Для дослщження було взято антибютики виробництва г.Санкт-Петербург, НИЦФ, ТУ 9398-00139484474-2000. При визначенш чутливост1 культур до антибютиюв добову культуру бактерш, вирощену на вщповщному поживному середовищк гщрол1зованому молощ - для лактобактерш, середовищ1 MPC - для лактобацил, розводили стерильним ф1зюлопчним розчином до густини 1,0 за стандартом мутност! Мак-Ферлана. Поавний матер1ал у кшькост1 0,2 см3 вносили у чашки Петр1 з агаризованим середовищем, аналопчним середовищу вирощування, поверхневим методом. Чашки з культурою молочнокислих бактерш та ¿ндикаторними дисками культивували за температури 30 °С i 37 °С упродовж 24 год, вим1рювали д1аметр зони затримки росту у мм. Мммальну шпбуючу концентрацию (MIK) антибютимв, формалшу, перекису водню визначали за найменшою 1хньою кшьюстю, що повшстю затримувала picT мжрооргашзму в агаризованому поживному середовищ1 [4].
Результата дослщження. Hapa3i вщомо, що стшюсть м1крооргашзм1в до антибютимв передаеться спадково, а значить, залежить вщ генотипу та стабшьност1 штаму. Pi3Hi види та штами м1крооргашзм1в вир1зняються один вщ одного за щею властивктю, що необхщно враховувати пщ час пошуку чутливих культур. Окр1м того необхщно враховувати мехашзм виникнення
121
резистентносп - природний чи набутий, школи за рахунок генно-шженерного втручання. Нараз! спостер1гаеться збшьшення нижньо! меж! антибютикостшкост! штам1в лактобактерш, нав1ть щойновидшенних ¿з природно! екошш! - самоквасних молочних продукив. Оскшьки мжрофлора останшх також змшюеться через широке використання антибютиюв виробниками молока, у тому числ11 приватними. Це призводить до виникнення адаптацшних змш та природно! селекци штам1в лактобактерш, стшких до таких концентрацш антибютиюв, яю рашше шпбували !хнш розвиток [5].
3 ще! точки зору було щкавим дослщити вщношення до антибютиюв р1зних вцщв лактобактерш з колекци вщд!лу бютехнологп, для того щоб визначити вид - перспективний для селекци антибютикочутливих штам1в. Результата скриншгових дослщжень з визначення МЖ шести антибютиюв представлено у таблиц! 1.
Таблиця 1
Актившсть антнбштнкт шодо промислових штам1в молочнокислих
бактерш т у'йго
Мшмальна шпбуюча концентращя антибютика, мкг/см3
Антибютик Те. Те. Ьс. X ЛегторЫ1ш
casei ааёорЫ1ш 1асИ$ (п=23)
(п=7) (п=6) (п=11)
Амшцилш 0,10-0,50 0,01-0,50 0,02-0,20 0,01-0,02
Бензилпенщилш 0,10-1,00 0,01-0,50 0,02-0,50 0,02-0,50
Еритромщин 0,10-0,15 0,05-0,10 0,10-0,50 0,05-0,10
Тетрациклш 1,0-2,0 0,50-2,50 0,50-1,5 0,20-0,50
Хлорамфешкол 1,0-5,0 0,10-2,50 0,20-0,50 0,50-1,00
Стрептомщин 1,0-4,5 0,5-1,0 0,10-1,00 0,5-1,0
Як свщчать результата проведено! робота, найменше значения показника М1К встановлено для амп!цил!ну та бензилпенщил!ну - 0,01-1,00 мкг/см3, залежно в!д досл!джуваного штаму (це у 10-100 раз!в б!льше за норми залишково! к!лькост! антиб!отик!в у молощ незбираному зг!дно з Постановами ЕС № 470/2009 та № 37/2010). Найвищ! р!вш М1К було отримано для хлорамфен!колу (до 5 мкг/см3), що майже у 1000 раз!в б!льше за допустимий р!вень у сирому молощ. Слщ звернути увагу на висок! порогов! концентрац!! антибютиюв, як! спричиняли бактер!остатичну д!ю на мезофшьш бактер!! вид!в Ьс. \actis та Ье. casei. Пор!вняння значень М1К для промислових штам!в заквашувальних культур з л!тературними [6] показало, що жоден ¿з досл!джених штам!в з колекц!! 1ПР не проявляв антибютикорезистентшсть на р!вн! штам!в з набутою резистентн!стю. Це св!дчить, в першу чергу, про !хне природне походження. Водночас, сл!д зауважити, що деяю б!отехнологи пропонують виробникам ферментованих молочних продукт!в високорезистентн! до антибютиюв штами лакто-, б!ф!добактер!й, замовчуючи мехашзм виникнення ц!е! ст!йкост! [5].
Якщо пор!внювати види бактер!й (взят! нами до виб!рки), то з числа thermophilus було б!льше чутливих штам!в щодо половини досл!джених
122
антибютиюв пор1вняно з шшими видами бактерш. Тому наступний пошук антибютикочутливих штам1в проводили саме з числа бактерш виду Л. thermophilus. У результат! застосування двох критерив селекцшного вщбору: антибютикочутливост1 та високо! молокозброджувально! активное^ було вщ1брано 5 штам1в Л. thermophilus. Проведено 3 цикли селекци методом стутнчатого вщбору з1 застосуванням обраних критерив та вщ1брано бактер1альш ¿золяти, що характеризувались популяцшною стабшьшстю (ку=менше 10%) та були чутливими до вс1х використаних антибютиюв, д1аметр зони затримки росту ё > 25 мм.
Додатково перев1ряли вщношення культур до залишюв активних компонешгв миюче-дезшф1куючих розчишв, а саме, перекису водню та формалшу методом глибинного пос1ву у агаризоване поживне середовище, яке мктило спадаюч1 концентраци х1м1чних шпбггор1в.
Межу чутливост1 культур визначали за М1К шпб1тора, що затримувала рют мжрооргашзму пор1вняно з ростом культури без додавання шпб1тор1в. При цьому враховували 2 показники: М1К50 - концентращя шпб1тора, за якого гинуло 50% кл1тин та МЖ90 - концентращя шпб1тора, за якого гинуло 90% кл1тин в популяци. М1К50 означав, що половина кл1тин бактер1ально! культури буде чутливою до ще! концентраци шпб1тора, тому загальний ркт культури буде вщр1знятись вщ контролю (рют культури без антибютика буде швидюшим). Як бачимо значения М1К50 у 5-10 раз1в менш1 за М1К90 залежно вщ антибютика (табл. 2). Отримаш данш свщчать про високу чутливкть вщ1браних штам1в Л. thermophilus до дослщжених антибютимв (див. табл.2).
Таблиця 2
Значения меж1 антибштикочутливост1 штам1в Л' thermophilus
Антимжробний агент Д1апазон, (мкг/см3 ) М1К (мкг/см3 )
50% 90%
хлорамфешкол 0,0001-2,5 0,01 0,1
бензилпенщилш 0,0001-1,0 0,001 0,005
тетрациклш 0,001-2,0 0,01 0,1
стрептомщин 0,001-5,0 0,1 0,5
амшцилш 0,01-5,0 0,1 0,5
Кр1м того, визначення М1К50 дае можливють ощнити перспективнють використання вщбраних культур для визначення наявност1 антибютиюв у молочнш сировиш за 1хнього вмюту менше мш1мально шпбуючо! концентраци.
У результат! проведених дослщжень створено колекщю шдикаторних культур для визначення шпб1тор1в в молочнш сировиш. Ввдбраш тест-культури пщвищили чутливкть мжробюлопчного методу визначання х1м1чних шпб1тор1в у молочнш сировиш згщно ГОСТ 23454, а саме: пенщилша - в 10 раз1в; тетрацикл1ну та стрептомщину - у 100 раз1в, вмкт формалшу та перекису водню - у 10 раз1в. Окр1м того, вщ1браш шдикаторш культури дозволяють визначати залишковий вмкт хлорамфешколу та ампщилшу, хоча цих антибютиюв в ГОСТ1 23454 не мае.
123
Ефектившсть селекцюнованих ¿ндикаторних культур було перев1рено та пщтверджено у промислових умовах, а саме: 1111 Науково-виробничий ф1рм1 «Лакт1ум», м. Ки1в; ЗАТ «Кагма» м. Кагарлик; ПГО «Асощащя пщтримки в1тчизняного товаровиробника» «Ф1РМА-ЛАСКА», м. Юровоград.
Висновки. Науково обгрунтовано та створено тест-систему для визначання iHri6iTopiB росту лактобактерш. Проведено спрямовану селекцш штам1в лактобактерш за маркером чутливост1 до шпб1торних речовин та вадбрано 5 шдикаторних культур S. thermophilus.
Перспективи подальших дослщжень. М1кробюлопчний метод зг1дно ГОСТу 23454 е арб1тражним, чинним в Укра!н1, i тому заслуговуе на увагу. Оптим1защя методу полягае у подальшому розширенш спектру та меж1 чутливост1 тест-культур, широке впровадження яких у промисловють дозволить об'ективно оц1нювати як1сть та безпечшсть молочно! сировини.
Л1тература
1.Семко К. Р. Системи забезпечення яюсного визначення антиб1отик1в та ¿нших речовин у молощ при лабораторних дослщженнях / К.Р. Семко, О.О. Салганська ; УААН, IBM, ДНК1БШМ // Ветеринарна б1отехнолог1я : бюлетень. - К. : Дорадо, 2008. - № 13 (том 1) : Матер1али м1жнар. наук.-практ. конф. "Сучасш проблеми б1отехнолог11, стандартизац11 та забезпечення контролю якост1 ветеринарних препарат1в, корм1в та кормових добавок", присвяч. 10-р1ччю Державного науково-контрольного ¿нституту бютехнологи i штам1в м1кроорган1зм1в. - С. 353-357.
2.Кальницкая О.И. Чувствительность микробиологической тест-системы «Дельвотест» к антибиотикам, обнаруживаемым в молоке// Молочная промышленность. - 2010, №10. - С.31-32.
3.Хромых И. Современные методики определения антибиотиков в молоке//Молочная промышленность. - 2010, № 3.- С.40.
4. Salomskiene J. Microbiological processes in the manufacture of rennet cheese and methods for their control. - Kaunas: KUT, 1997. - 46 p.
5.Артюхова С.П., Жидкова О.Н. Устойчивость к антибиотикам микроорганизмов закваски для сметанного продукта//Молочная прошленость. -2009, №8. - С.24.
6.Mathur S., Singh R. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria—a review// International Journal of Food Microbiology. - 2005, № 105. - P.281-295.
Рецензент - д.с.-г.н., професор Цюарик О.Й.
124
