CC BY
10
Ключевые слова: эпендимный слой, нейральные Key words: ependymal layer, neural stem cells,
стволовые клетки, танициты, эпендимоциты, tannycytes, ependymocytes, neuroonthogenesis. нейроонтогенез.
Стаття надшшла 14.03.18 р. Рецензент Маевський О.£.
DOI 10.26724/2079-8334-2018-3-65-196-199 УДК 616. 33
НАСЛ1ДКИ ШФЕКЦП HELICOBACTER PYLORI
E-mail: [email protected]
В робот показан наслiдки впливу iнфекцii Helicobacter pylori на слизову оболонку шлунка. Задiянi як гiстологiчнi методики, так i молекулярно-бiологiчна методика (ISSR-PCR) з використанням ISSR -праймеру S-2, i3 структурою (AGC)6G. Проаналiзованi змiни слизовоi оболонки шлунка при Н/ру^п-асоцшованих захворюваннях: хрошчнш виразковiй хворобi дванадцятипалоi кишки, хрошчнш виразковiй хворобi шлунка, виразковоiнфiльтративному раку шлунка. Пстолопчно в слизовiй оболонщ шлунка знайденi дисплазп трьох ступешв тяжкостi (Д-1; Д-II; Д-Ш). Генотитчно в слизовiй оболонцi знайденi змши, що вiдповiдають мiкросателiтним експансiям, що е свiдченням передракових змiн.
Kjii040Bi слова: Helicobacter pylori, дисплазп, мжросател1тш експансп.
Робота е фрагментом НДР «Формування сучасних Memodie хiрургiчного л^вання i профшактики ускладнень захворювань i травм оргатв грудной клгтки i черевноi порожнини», № державноi реестраци 0110U002649.
Груитовний анал1з проблемы «Н. pylori i рак шлунка», проведений М1жнародною агенщею з вивчення рака (IARC) BOO3B 1994 рощ вщшс шфекщю Н. pylori до канцерогешв 1 групи. Канцерогенами 1-i групи IARC вважають фактори зовшшнього середовища, у вщповщносп до яких е достатньо доказ1в канцерогенност для людини. Ще зовсш недавно нав1ть думка про те, що рак шлунка може бути пов'язаний з первинною бактер1альною шфекщею могла повид1тись абсурдною, але результати дослщжень останшх роюв роблять цю концепщю правдопод1бною.
Ешдемюлопчш дослщження показали, що рак шлунка у шфшованих Н. pylori зустр1чаеться в 4-6 раз1в частше, шж у нешфшованих [1]. В странах з високим ризиком раку шлунка враження Н. pylori шлунка з'являються вже в ранньому дитинств^ i це дае можливють вважати, що тривала iнфекцiя може бути причиною прогресування хронiчного гастриту i раку шлунка. Мае надзвичайний iнтерес той факт, що значне зниження захворюваностi на рак корелюе з шфекуванням Н.рylori. Так, в Японп, де захворюванiсть на рак шлунка була одшею iз самих високих у свiтi, смертнiсть вщ нього знизилась бiше нiж в два рази: у чоловшв iз 100 до 40/100000 та у жшок з 50 до 20/100000. Одшею з причин зниження шфекованост Н. pylori вважаеться збшьшення вживання в останш роки населенням рiзних кра'н полiненасичених жирiв i ix есенщальних жирних кислот, що iнгiбiрують рют Н. рylori [7].
Метою дослщження було виявити феномен мшросател^них експансiй в передпухлинних процесах та раку шлунка.
Матерiал та методи дослщження. Дослiджено операцiйний матерiал шлункiв, що резецiйованi з приводу шфшьтративно-виразкового раку шлунка (1ВРШ) - 50, хрошчно' виразки шлунка (ХВШ) - 50, хронiчноi виразки дванадцятипало' кишки(ХВДПК) - 50. Bказанi хвороби були ^l^obacter pylori-асоцiйованi. У хворих для вивчення частоти виявлення дисплазш дослiджувалась слизова оболонка шлунка яку брали з краiв виразки(пухлини), центру виразки (пухлини), навколо пухлини, з тлоричного вiддiлу, малоi кривизни та тша шлунка. 3 парафiнових блоюв iз рiзних топографоанатомiчних вiддiлiв слизово' оболонки шлунка одержали зрiзи, як фарбували гематоксилiн-еозином, пiкрофуксином за Ван-Лзоном, за загальноприйнятими схемами та вмщували в полiстерол. Вплив iнфекцii ^l^obacter pylori (НР) на стан слизово' оболонки шлунка вивчали на нашвтонких зрiзах, виготовлених з епоксидних блоюв. В якостi барвника використовували 0,1% розчин толущинового синього на фосфатному буферi з рН 7,4. Фшсатором слугував 10% розчин нейтрального формалшу або 4% холодний розчин глютаральдепду. При дослiдженнi паралельно з пстолопчним методом (маркер фенотипу), за допомогою якого вивчалась динамiка дисплазiй (Д) слизово' оболонки шлунка (СОШ), проводилось вивчення змшень ДНК(як маркер генотипу) СОШ в динамщ за допомогою полiмеразноi ланцюговоi реакцii [4]. В СОШ
© О.В. Харченко, О.О. Шерстюк, 2018 196
виявляли характер диспластичних зм1н покривно-ямкового еп1тел1ю та на дшянках з кишковою метаплаз1ею. Для оцшки вираження порушень мгтозу використовували визначення м^отичного режиму. 1ндивщуальне ДНК-типування (генотипування) зразюв СОШ проводили шляхом амптфшацп ДНК(виб1ркове кошювання певних дшьниць ДНК) в пол1меразн1й ланцюговш реакци (ПЛР) (PCR) з використанням ISSR - праймеру S2, який мав структуру: (AGC)6G. ISSR- PCR (Inter-Simple Sequence Repeat - амптфшащя послщовностей м1ж простими повторами) вщр1зняетъся високим р1внем шформативностг
При використанш одного ISSR- праймеру в однш реакци анал1зуеться одразу 8-20 ДНК-локушв (фшсованих локал1зац1й гешв на ДНК). Використання двох ISSR-систем з р1зними праймерами дае можливють проанал1зувати 16-40 локушв. Ампл1ф1кац1ю проводять в 25 мкл реакцшно! сумш1, що мютить 1 х реакцшний буфер з трифосфатами, праймер наведенно! структури, Таg-полiмеразу, ДНК додають в кшькосп 10 - 20 нг на реакщю. Температура вщпалу праймера становить 57°C, синтез фрагментiв ДНК проходить в 30 циклах амплiфiкацil на термоциклерi (амплiфiкаторi) в режима I - 95°-2хв., II - 94°-30с, 57°-2хв, 72°-2хв., III - 72°-10хв. Електрофоретичне роздiлення продуктiв амплiфiкацil проводять в 2%-му горизонтальному агарозному гелi з наступним !х фарбуванням протягом 10 хв в 0,5мкг/мл розчинi бромистого етидiю i багаторазовою промивкою в проточнiй водi [5]. Вiзуалiзацiю електрофореграм (одержаних нуклеотидних послщовностей в нукле!нових кислотах) проведено на трансiлюмiнаторi в ультрафiолетовому свiтлi з довжиною хвилi 365 нм з наступним фотографуванням. Визначення розмiрiв амплшошв (скопiйованих дiльниць ДНК) виконано за допомогою маркеру розмiру фрагментiв ДНК.
Результати дослщження та ix обговорення. Пстолопчний аналiз гастрально! системи при хрошчнш виразцi шлунка, хронiчнiй виразщ дванадцятипало! кишки, виразково-iнфiльтративному раку шлунка, а також слизово! оболонки шлунка навколо пухлини та навколо виразки, пiдтверджуе належнiсть виражених форм хрошчного атрофiчного гастриту, а також шфекцп Helicobacter pylori до стабшьного фонового стану.
При захворюваннi на ХВШ та ХВДПК HP знайдет в 46 (92%) i 45 (90%) спостереженнях, але в СОШ хворих на ВIРШ бактерп виявлеш лише в 35 (70%) спостереженнях вщносно 50 спостережень в кожнш розглянутiй групi. Для всiх розглянутих випадк1в характерно, що дисплаз1я ештелда виявляеться в усiх вiддiлах шлунка. Звертае на себе увагу, що в тш шлунка хворих на ВШШ частота дисплаз^' першого ступеня (Д-I) (90,9±3,7) достовiрно вище в порiвняннi з ХВДПК(50,0±9,3) i ХВШ(55,9±8,5) р<0,001. Дисплаз^' другого ступеня(Д-П) у щй дiлянцi домiнуе при В!РШ(87,9±4,2%) у порiвняннi з ХВДПК(23,3±7,8%) i ХВШ(38,2±8,5%) р<0,001. Дисплаз1я третього ступеня (Д-III) при ВIРШ мае достовiрно найбiльшу частоту(54,5±6,5%) в порiвняннi з ХВДПК(3,3±3,3%) р<0,001. У групi ХВШ в слизовш оболонцi тiла шлунка Д-III не спостертаеться. Розповсюдження Д в тш шлунка при вшх ступенях i! вираження низьке. Але при ВШШ розповсюдження Д-I в СОШ тша достовiрно вище (21,5±2,2%) нiж у хворих з ХВДПК(2,9±0,9%) i ХВШ(3,1±0,6) р<0,001. В тлоричному вiдцiлi розповсюдження Д-I було найбшьшим при ВIРШ (32,0±1,1%), потiм при ХВДПК(25,2±1,6%) i ХВШ(12,2±1,1%). Д-II i Д-III також превалювали при ВIРШ. Аналогiчнi спiввiдношення цього показника i на малш кривизнi. Але найбшьшим показник розповсюдження Д-I зареестрований навколо пухлини (34,9±2,2%), що достовiрно вищий в порiвняннi з таким навколо виразки шлунка (13,3±1,4%) р<0,001. Аналопчно бiльшими при ВIРШ е показники розповсюдження Д-II i Д-III навколо пухлини. Характерним для всiх груп дослiдження е те, що в тш шлунка показники мiтотичного режиму нижчi нiж в пiлоричному вщцш i на малiй кривизнi. Звертае на себе увагу той факт, що в тш шлунка при ВШШ достовiрно вища кiлькiсть мп^в у метафазi 44,9±2,8% в порiвняннi з показниками при ХВДПК(20,0±3,1%) i ХВШ (20,6±8,3%) р<0,001(Таблиця 1).
Таблиця 1
Вщдш шлунка ВIРШ ХВШ ХВДПК
MI Кiлькiсть мiтозiв в метафазi Кiлькiсть Патоло-гiчних мiтозiв MI Кiлькiсть мiтозiв в метафазi Юльюсть Патоло-гiчних мiтозiв MI Кiлькiсть мгтсгав в метафазi Кiлькiсть Патоло-гiчних мiтозiв
НП(НВ)* 33,1±11,8 56,9±5,8 37,3±3,5 22,3±1,7 37,3±7,8 10,6±1,3 - - -
*П 27,5±5,8 51,5±3,3 35,1±2,7 20,0±2,8 46,9±2,8 15,6±1,9 16,5±4,2 37,8±7,8 10,6±1,3
*МК 25,5±3,9 51,9±2,9 25,3±3,3 19,8±2,3 44,9±2,8 13,7±1,9 16,0±2,4 38,8±3,7 9,0±1,4
*Т 15,1±1,3 44,9±2,8 5,1±1,1 14,8±1,2 20,6±8,3 4,0±1,1 7,5±1,2 20,0±3,1 4,0± 1,1
Примака: *НП - навколо пухлини; НВ - навколо виразки; П - шлоричний вщдш; МК - мала кривизна; Т - тшо.
При В1РШ показники мгтотичного режиму вищi вщ таких при ХВШ та ХВДПК. Всi вище вказанi показники е свщченням певних змiн на рiвнi тканин i клiтин, тобто фенотитчш. Гiстологiчний метод хоч i е базисним методом в морфолопчнш диференцiйнiй дiагностицi дисплазiй i раку шлунка, але мае специфiчнiсть 90% i чугливiсть 90%, що свщчить про обмежену роздiльну здатнiсть[3]. У комплекс з гiстологiчним методом виконали метод генотипування (ДНК-типування) з метою диференцшно! дiагностики дисплазп третього ступеня i раку шлунка[2]. Генотипування еттелда СОШ пацiентiв, хворих на хрошчну виразку дванадцятипало! кишки, хронiчну виразку шлунка та iнфiльтративно-виразковий рак шлунка, виявило рiзнi амплiфiкацiйнi профiлi ДНК(спектри амплiконiв з певною послiдовнiстю). В межах вщповщних нозологiчних груп ДНК-профш вiдрiзнялись за яюсним складом[6]. Профш маркеру СОШ в нормi мютили фрагменти розмiром 190, 180, 160, 140, 120, 110, 90, 70, 60 п.н. (пар нуклеотцщв). При хротчнш виразц дванаццятипало! кишки(ХВДПК) фенотипу слабо виражено! дисплазп (Д-1) еттелда слизово! оболонки шлунка ДНК-профш були iнтенсивно подовженi i мали розмiр: 220, 210, 200, 190, 180, 160, 140, 120, 110, 100, 90 п.н., що вщповщало 30% (15), що е м^осателгтними експанаями [9]. 1нтенсивне подовження мшросателгтних послiдовностей за рахунок реплiкацiйних помилок(мшросателгтш експансп) спостерiгалися i при фенотип Д-11 в 27%(13) випацюв мали варiант ДНК-профшв розмiром 300, 260, 240, 220, 210, 190, 180, 160, 140, 120, 100 п.н.(перший варiант), решта ж 3%(2) мала ДНК-профш (другий варiант) 500, 480, 440, 400, 360, 300, 240, 200, 140, 110, 100 п.н. Фенотипи Д-Ш мали ДЩ-профш з феноменом мiкросателiтних експансiй одного варiанту 520, 500, 480 460, 440, 420, 410, 380, 360,340,320 п.нд складали 40%(20) вiд загально! кiлькостi абс.(%) (таблиця 2).
Таблиця 2
Порiвняльна характеристика результатiв генотипування (ДНК-типування) зразшв слизовоТ оболонки
шлунка пащенпв з ХВДПК та ХВШ
Виражешсть дисплази еттелш слизово! оболонки шлунка ХВДПК ХВШ
Д-1 30%(15) 20%(10)
Д-11 1-вар1ант 27%(13) 12%(6)
Д-11 11-вар1ант 3%(2) 14%(7)
Д-III 1-вар1ант 40%(20) 50%(25)
Д-III П-вар1ант 4%(2)
Всього 100% (50) 100%(50)
При хрошчнш виразщ шлунка(ХВШ) в ДНК-проф1лях при Д-I виявлеш також мшросателггш експансп, яю мали розм1р - 220, 210, 200, 190, 160, 120, 110, 90, 80, 70, 60 п.н. При Д-11 ДНК-профш мали мшросател^ш експансп двох вар1анпв, перший розм1ром- 320, 300, 240, 220, 210, 200, 190, 180, 160, 140, 120 п.н. i другий розм1ром - 520, 500, 480, 460, 440, 420, 410, 400, 360, 300, 220 п.н. ДНК-профш, що вщповщали фенотипу Д-Ш мали мшросателггш експансп двох варiантiв: перший розмiром - 600, 580, 540, 520, 500, 480, 460, 420, 410, 340 320 п.н. i другий -620, 610, 600, 580, 560, 540, 520, 500, 480, 460, 440 п.н. абс. (%) (див.таблиця 2).
Анатз НР-асоцшованих хвороб шлунка за допомогою пстолопчного методу встановив наявшсть дисплазш слизово! оболонки шлунка, яю фенотитчно при ХВДПК, ХВШ i В1РШ мають схожий вигляд, але показники мпотичного режиму епiтелiю СОШ при В1РШ превалюють над такими при ХВДПК та ХВШ. Результати генотипування еттелда СОШ за реакщею ISSR-PCR пащенпв з НР-асоцшованими хворобами шлунка (ХВДПК, ХВШ i В1РШ) показали, що диспластичнi змiни при них дещо вiдрiзняються вiдповiдно iз lхнiми ДНК. Генотипування епiтелiю слизово! оболонки шлунка пащенпв, хворих на шфшьтративно-виразковий рак шлунка, виявило досить стабшьш ДНК-профiлi розмiром вiд 520 до 620 п.н., що мали характер мшросател^них експансш в ушх спостереженнях, та були вiдмiннi вщ профiлю норми.
Перспективи подальших дотдженъ: в подалъшому феномен плануетъся docnidumu на практиц з метою дiагностики неопластичних змш еттелт слизовоi оболонки шлунка.
Ш
1. Aruin LI, Kononov AV, Mozgovoy SI. Mezhdunarodnaya klassifikatsiya khronicheskogo gastrita: chto sleduyet prinyat i chto vyzyvayet somneniya. Arkh. pat. 2009; 4: 11 - 18. [in Russian]
2. Karseladze AI. Nekotoryye osnovopolagayushchiye ponyatiya onkomorfologii v svete dostizheniy sovremennoy molekulyarnoy biologii. Arkh. pat. 2009; 5: 17- 21. [in Russian]
3. Kononov AV, Mozgovoy SI, Markelova MV, Shimanskaya AG. Morfogenez atrofii slizistoy obolochki zheludka kak osnova fenotipa khronicheskogo gastrita. Arkh. pat. 2011; 3: 26 - 31. [in Russian]
4. Markovskyi VD, Kharchenko OV. Kompleksna patomorfolohichna dyferentsiyna diahnostyka peredpukhlynnykh protsesiv i raku shlunka. Patolohiya. 2012; 3: 15 - 18. [in Ukrainian]
5. Kharchenko OV. Dynamika proyaviv fenotypu dysplaziy epiteliyu slyzovoyi obolonky shlunka u vidpovidnosti z yikh henotypom na materiali vyvchennya svitlovoyi mikroskopiyi ta DNK-typuvannya za metodom ISSR-PCR. Visnyk morfolohiyi (Reports of Morphology). 2009; 15(2): 396 - 402. [in Ukrainian]
6. Kharchenko OV. Mikrosatelitni ekspansiyi - molekulyarno-biolohichnyi fenomen diahnostyky peredpukhlynnykh i pukhlynnykh protsesiv. Svit medytsyny ta biolohiyi. 2015; 2(49): 196 - 200. [in Ukrainian]
7. Haruma K., Okamoto S., Kawaguchi H. Reduced incidence of Helicobacter pylori infection in young Japanese persons between the 1970s and 1990s. - J.Clin.Gastroenterol. - 1997. - V. 25 - P. 583 - 6.
ПОСЛЕДСТВИЯ ИНФЕКЦИИ HELICOBACTER PYLORI Харченко А.В., Шерстюк О. А.
В работе показаны последствия влияния инфекции Helicobacter pylori на слизистую оболочку желудка. Применены как гистологические методики, так и молекулярно-биологическая методика (ISSR-PCR) с ипользованием ISSR -праймера S-2, со структурой (AGC)6G. Проанализированы изменения слизистой оболочки желудка при H/pylori-ассоциированных заболеваниях: хронической язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, хронической язвенной болезни желудка, язвенно инфильтративном раке желудка. Гистологически в слизистой оболочке желудка обнаружены дисплазии трёх степеней тяжести (Д-1; Д-II; Д-III). Генотипически в слизистой оболочке обнаружены изменения соответствующие микросателлитным экспансиям, которые являются свидетельством предракових изменений.
Ключевые слова: Helicobacter pylori, дисплазии, микросателлитные экспансии.
Стаття надшшла 16.03.18 р.
CONSEQUENCES OF HELICOBACTER PYLORI INFECTION Kharchenko À.V., Sherstyuk O.A.
The consequences of influence of infection of Helicobacter are in-process shown pylori on the mucous membrane of stomach. Both histological methodologies and molecular-biological methodology (ISSR-PCR) are applied with ISSR-praimer S-2, with the structure (AGC) 6G. The changes of mucous membrane of stomach are analysed at H.°pylori- the associated diseases: chronic ulcerous illness of duodenum, chronic ulcerous illness of stomach, ulcerous infiltration cancer of stomach. Histological in the mucous membrane of stomach found out dysplasias of three degrees of weight (D-1; D-II; DIII). Genotype in a mucous membrane found out changes corresponding to microsatellite expansions that are the certificate of pre-cancer changes.
Key words: Helicobacter pylori, dysplasia, microsatellite expansions.
Рецензент Шеттько B.I.
DOI 10.26724/2079-8334-2018-3-65-199-204 UDC 611.631.013-053.34
THE PECULIARITIES OF THE PRENATAL MORPHOGENESIS OF THE EPIDIDYMIS
E-mail: [email protected]
Epididymis serves a critical function in the process of sperm cells maturation, since it provides with a unique liquid microbiomedium that allows maturation and survival of the spermatozoa. Therefore, the aim of our study is to clarify the patterns of the morphogenesis of the epididymis during the perinatal period of human ontogenesis. 27 series of the serial histological sections of the human embryos and prefetuses (4.0-80.0 mm of parietal-coccygeal length (PCL)) and 56 specimens of human fetuses (81.0-375.0 mm PCL) have been studied, using the methods of microscopy, macroscopy, graphic and plastic reconstruction and morphometry. It has been found that the anlage of the epididymal tubules occurs in the prefetuses 14,0-16,0 mm of PCL, and the formation of the epididymal segments (caput, corpus and cauda), as well as establishment of the correlation between the tubules of the testicle and epididymis is observed in prefetuses 18,0-65,0 mm of PCL. At the early fetal period the asymmetry of the shape and size of the right and left epididymises is observed; it is preserved during the entire fetal period and is accompanied by the process of their accelerated and slowed development. At the end of the fetal period of the ontogenesis the structure and shape of the epididymal tubular system is close to the definite state.
Keywords: epididymis, mesonephros, mesonephric duct, prenatal morphogenesis, human.
The study is a fragment of the research project "The features of morphogenesis and topography of the systems and organs in the human pre-and postnatal ontogenesis" (state registration No.0115U002769).
Knowing the nature and clarifying the time of specific transformations, which in general ensures the systemic genesis of the fetus, is extremely important in embryology. Numerous abnormalities that occur in the clinical practice can be mainly explained only on the basis of clarification of the origin and interaction of the organs and structures that eventually acquired their typical shape, and having studied the features of their topography and deeply realized relevant embryonic phenomena [1]. The epididymis serves a critical function in the process of sperm cells maturation, since it provides with a unique liquid microbiomedium that allows maturation and survival of the spermatozoa [2].
To perform its function the epididymis must undergo a complex path of the prenatal morphogenesis. The publications [4-6] report about intrauterine secretory activity of the human
© T.V. Khmara, M.O. Ryznychuk, 2018 1QQ
