CC BY
56
НАНОТЕХНОЛОГИИ В ДИАГНОСТИКЕ ОПУХОЛЕЙ
Т.В. Белова1, Д.В. Новиков1, Р.Г. Пегое2, А.А. Алясова2,
В.В. Новиков1
Обнаружение мРНК GAGe 1-8,
MAGE-A1-6 и NY-ESO-I в периферической крови и клетках опухолевого очага больных раком легкого
1НИИмолекулярной биологии и региональной экологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород 2Нижегородская государственная медицинская академия
Введение. Раково-тестикулярные антигены в норме экспрессируются в сперматогониях, на премейотиче-ской стадии развития сперматозоидов, а также в тканях плаценты. В соматических клетках их экспрессия подавлена эпигенетически. Однако транскрипция раковотестикулярных генов наблюдается в клетках большей части первичных и метастатических опухолей различных гистологических типов.
Задачи исследования. Оценить частоту обнаружения мРНК раково-тестикулярных антигенов GAGE 1-8, MAGE-A1-6 и NY-ESO-I в опухолевом очаге и опухолевых клетках, циркулирующих в крови больных раком легкого.
Материалы и методы. Образцы периферической крови и клеток опухолевого очага исследовали на присутствие мРНК GAGE 1-8, MAGE-A1-6 и NY-ESO-I методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) с использованием специфических праймеров.
Результаты. В образцах опухолевых очагов мРНК MAGE-A1-6 выявлялась в 95 % случаев (19 из 20), мРНК NY-ESO-I — в 70 % случаев (14 из 20), а мРНК GAGE 1-8 — в 20 % случаев (4 из 20). В периферической крови, взятой от тех же больных до резекции опухоли, частота обнаружения мРНК MAGE-A1-6 и NY-ESO-I составила 60 % (12 из 20) и 70 % (14 из 20) соответственно. Матричной РНК GAGE 1-8 в периферической крови обнаружено не было. В сумме мРНК раково-тестикулярных антигенов была выявлена в 70 % образцов периферической крови больных раком легкого. При сравнении спектра мРНК раково-тестикулярних антигенов в опухолевом очаге и клетках, циркулирующих в крови, в 2 случаях в крови обнаружена мРНК NY-ESO-I, которая не детектировалась в опухолевом очаге.
Выводы. Матричная РНК GAGE 1-8, MAGE-A1-6 и NY-ESO-I выявляется с высокой частотой как в клетках опухолевого очага больных раком легкого, так и в периферической крови больных, что предполагает возможность использования тестов на наличие матричной РНК раково-тестикулярных антигенов в формате биочипа в мониторинговых целях.
Н.А. Брусенцов1, П.И. Никитин2, Ю.А. Пирогов3,
Т.Н. Брусенцова2, В.А. Полянский4, Т.И. Ксеневич2,
М.П. Никитин2, М.В. Юрьев2, A.A. Учеваткин3,
Д.А. Куприянов ,А.И. Дубина , Д.А. Тищенко ,
Е.Р. Вольтер5, А.В. Иванов1 Количественная оценка магнитоуправляемых нанопрепаратов в организме экспериментальных животных в реальном времени
1ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, Москва
3Центр магнитной томографии и спектроскопии МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
4Институт механики МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва 5НИИ экспериментальной патологии и терапии АН Абхазии, Сухуми
Цель исследования. Оценка содержания магнитоуправляемых нанопрепаратов (МН) в опухоли и органах РЭС в процессе магнитогидродинамической термохимиотерапии злокачественных опухолей (МТ).
Материалы и методы. Внугриопухолевое, внутри-брюшинное и внутрисосудистое введение МН в организм животных, находящихся вне искусственных магнитных полей, приводит к концентрации МН в органах ретикуло-эндотелиальной системы (РЭС). Внутриопу-холевое, внутрибрюшинное и внутрисосудистое введение МН животным, находящимся в сильном неоднородном постоянном магнитном поле (НПМП) в процессе направленной доставки и иммобилизации МН (таргетинг), приводит к концентрации МН в области максимального градиента неоднородного постоянного магнитного поля. Существующие методы определения нанопрепаратов в организме животных не позволяют количественно оценить их содержание в опухоли, печени и других органах в реальном времени. Мышей или крыс с опухолями размещают в неоднородном постоянном магнитном поле (НПМП) индукцией 0,2 - 7,0 Тл, градиент 0,01 - 0,35 Тл/см, в сосуд, питающий капсулу опухоли, или внутрь опухоли и окружающих тканей вводят золь магнитоуправляемого нанопрепарата (МН) в виде наночастиц диаметром 10 - 900 нм общей формулы: Zn2+x Mn2+y Fe2+1.x.y [Gd3+z Fe3+2.z]O4, где 0<y<1, 0<x<1, 0<z<1, выдерживают 4 мин и перемещают в переменные магнитные поля (ПеМП) магнитосенсорного устройства «МСУ ИОФ РАН» (манипуляции занимают 6 мин). Магнито-сенсорное сканирование опухоли проводят в 6 направлениях в режимах последовательного проецирования сенсора на ткани опухоли и исследуемых органов.
Результаты. В процессе сканирования магнитный сенсор излучает переменные магнитные поля и принимает отклик близлежащих биологических тканей на комбинаторных частотах. МН увеличивают отклики, идущие от органов и тканей. На калибровочных графиках по величине откликов, регистрируемых компьютером, определяют содержание МН в опухоли, органах и тканях в реальном времени.
Выводы. Определили постепенное увеличение содержания магнитоуправляемых нанопрепаратов в органах РЭС с помощью магнитного сенсора в процессе проведения магнитогидродинамической термохимиотерапии злокачественных опухолей.
Е.А. Гостюжова1’2, О.В. Уткин1’3, Д.В. Новиков1,
С.А. Волкова2, В.В. Новиков3 Спектры альтернативных вариантов мРНК Fas(CD95)-антигена в клетках крови больных хроническим миелолейкозом
ННГУ им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород 2Нижегородская областная клиническая больница им. Н.А. Семашко
3Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. И.Н. Блохиной
Задачи исследования. При хроническом миелолей-козе (ХМЛ) повышенная пролиферация и резистентность к апоптотическим сигналам считается одним из механизмов, отвечающих за экспансию миелоидных клеток и патогенез заболевания. Наибольшие успехи в лечении ХМЛ достигнуты при применении препарата гливек, блокирующего BCR/ABL тирозинкиназу, активация которой при ХМЛ ингибирует апоптоз. Однако молекулярные механизмы, которые управляют альтернативным сплайсингом ключевых регуляторов апопто-за, в настоящее время мало изучены. В связи с этим основной задачей нашей работы явилось исследование особенностей спектра альтернативных форм мРНК CD95(Fas) антигена, опосредующего апоптоз, в крови пациентов с хроническим миелолейкозом в дебюте заболевания и на фоне терапии гливеком.
Материалы и методы. Материалом для исследования служили образцы мононуклеарных клеток периферической крови больных ХМЛ и здоровых доноров. Спектр альтернативных форм мРНК Fas-антигена оценивали с помощью ОТ-ПЦР.
Результаты. В мононуклеарных клетках здоровых доноров присутствует мРНК, кодирующая мембранную (mFas), доминирующую растворимую (FasExoTMDel) и 4 минорных растворимых формы Fas-протеина. В дебюте заболевания спектр форм мРНК отличался гетерогенностью: от полного спектра до отсутствия альтернативных форм. У всех пациентов, получающих гливек, обнаружены мРНК mFas, FasExoTMDel и FasExo3,4Del. Выявлены особенности спектра в зависимости от эффективности терапии: при полном цитогенетическом ответе спектр форм мРНК Fas-антигена совпадал с донорским, в то время как при частичном ответе и отсутствии ответа отмечены изменения в спектре мРНК минорных альтернативных форм, а именно, в 50 % образцов крови у больных выявлялась единственная минорная форма (FasExo3,4Del или FasExo3,4,6Del). В случае клональной эволюции на фоне терапии гливеком обнаружено полное отсутствие альтернативных вариантов мРНК Fas-антигена.
Выводы. Выявленные особенности в спектрах мРНК Fas-антигена открывают перспективы для их использования в мониторинговых целях и свидетельствуют о возможности их тестирования в формате биочипа.
Е.А. Дудко, Т.А. Богуш, М.В. Тихомиров,
Р.Ю. Раманаускайте, О.С. Бурова, А.Ю. Барышников Параметры иммунофлюоресцентной оценки экспрессии маркера множественной лекарственной резистентности Pgp в клетках Т-клеточного лейкоза линии Jurkat
ГУ РОНЦ им. H. Н. Блохина РАМН, Москва
Задачи исследования. Множественная лекарственная резистентность (MDR), ассоциированная с выбросом препаратов из клеток, — один из наиболее распространенных механизмов устойчивости к химиотерапии. Однако до настоящего времени оценка фенотипа MDR солидных опухолей, в частности, с использованием метода иммуногистохимии, рутинно не используется в клинике из-за методических проблем, связанных с низкой специфичностью антител, разным сродством антител к разным эпитопам и трудностями подбора адекватного положительного контроля. Наиболее подробно методические аспекты изучены в отношении Pgp, выявление которого в стандартной постановке иммуноги-стохимического исследования требует не менее 3 (до 6) типов антител, что крайне трудоемко и дорого. Решить проблему можно, принципиально изменив методологию исследования, в частности, перейти на иммуноф-
люоресцентную оценку опухолевых маркеров методом проточной цитофлюориметрии. Такой подход значительно менее трудоемкий, но методических неопределенностей также достаточно. Некоторые из них, касающиеся иммунофлюоресцентного выявления Pgp, исследованы в настоящей работе.
Материалы и методы. В культуре клеток Т-лимфобластного лейкоза человека линии Jurkat проанализирован характер взаимодействия моноклональных (клон1^9) антител BD Pharmingen к Pgp, меченных FITC, в зависимости от концентрации исследуемых клеток (от 400 тыс. до 3 млн. клеток в мл) и специфических антител (5; 10 и 20 мкл коммерческого раствора на 300 мкл клеточной суспензии).
Результаты. 1). Оптимальное условие инкубации с антителами — после фиксации клеток 4%-ным раствором формальдегида. 2). Характер увеличения средней интенсивности флюоресценции клеток совокупно по всей суспензии при увеличении концентрации специфических антител не зависит от количества клеток. 3). Абсолютные значения средней интенсивности специфической флюоресценции клеток и количество клеток за областью флюоресценции изотипического контроля зависят от соотношения количества клеток и концентрации моноклональных антител.
Выводы. 1). Pgp экспрессирован практически во всех клетках Jurkat. 2). По уровню экспрессии Pgp культура клеток Jurkat достаточно однородна и стабильна в разных пассажах. 3). Клетки Jurkat могут быть использованы в качестве тест-культуры при оценке активности коммерческих антител к Pgp. 4). При имму-нофлюоресцентном анализе экспрессии Pgp в биопсийном материале опухолей необходимо использовать не менее 3 концентраций антител и клеток в исследуемой суспензии с обязательным параллельным исследованием клеточной тест-системы (клеток Jurkat). Это позволит не только констатировать факт, но и выраженность экспрессии Pgp, то есть диагностировать тяжесть фенотипа множественной лекарственной резистентности.
Исследование поддержано Грантами РФФИ (№ 0704-00082 и №08-04-13647).
Е.В. Загайнова1, М.В. Ширманова1’2, М.А. Сироткина1,
А.Г. Орлова1’ 3, И.В. Балалаева2, В.А.Каменскии Методы оптической томографии для оценки накопления металлических и полупроводниковых наночастиц в опухоли
1 Нижегородская государственная медицинская академия 2ННГУ им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород 3Институт прикладной физики РАН, Нижний Новгород
Введение. Широко обсуждается применение наночастиц для прицельного терапевтического воздействия на опухолевый очаг. Однако недостаточно разработаны методы объективного безопасного контроля проникновения и накопления наночастиц, мало сведений о взаимодействии наноагентов и человеческого организма.
Материалы и методы. В работе выполнены in vivo исследования по контролю накопления наночастиц в опухолях неинвазивными высокоразрешающими методами оптической когерентной томографии (ОКТ) и диффузионной флюоресцентной томографии (ДФТ). Мышам линии CBA с подкожно перевитым раком шейки матки внутривенно вводили золотые нанооболочки 130/15 нм с плазмонным резонансом в области 850 - 950 нм. Накопление наночастиц в опухоли наблюдали на оптическом когерентном томографе (ИПФ РАН): длина волны излучения 900 нм, пространственное разрешение 15 - 20 мкм, глубина сканирования до
1,5 мм. Мышам линии BDF-1 с карциномой легких Льюис внутривенно и перитуморально вводили кван-
товые точки (CdSe/CdS, 5 нм). Накопление квантовых точек в тканях оценивали на установке ФДТ-2М (ИПФ РАН): длина волны излучения 532 нм, регистрация флюоресценции осуществлялась охлаждаемым ФЭУ.
Результаты. ОКТ наблюдение накопления золотых наночастиц в опухоли при пассивной доставке показало, что до введения наночастиц уровень сигнала средний или даже низкий. После введения отмечалось повышение интенсивности сигнала в верхних слоях изображения, возрастание глубины полезного сигнала, визуализация глубинных структур опухоли (включений с низким уровнем сигнала). Методом электронной микроскопии наночастицы были найдены в опухоли, причем в центре частиц встречалось больше, чем на периферии. На ДФТ изображении целого животного до введения флюорофоров опухоль визуализировалась как область со слабой автофлюоресценцией. Перитумо-ральное введение квантовых точек обеспечило хорошую флюоресценцию опухолевого очага. Квантовые точки оказались высококонтрастными флюоресцирующими агентами для визуализации опухоли. Однако через час все нанокристаллы обнаруживались в основном в лимфатических узлах.
Выводы. Методы оптической томографии (ОКТ и ДФТ) могут стать информативными методами безопасного наблюдения аккумуляции наночастиц в различных органах и опухоли, что позволит более объективно определять время воздействия при терапии с наночастицами.
Е.В. Игнатьева, H.A. Дмитричева, И.В. Ярцева,
Л.Г. Гатинская
Количественное определение октасенса в водно-эмуксольной мицеллярной дисперсии
ГУ РОНЦ им. H. H. Блохина PAMH, Москва
Введение. Октасенс — новый липофильный фотосенсибилизатор ближнего инфракрасного диапазона, синтезированный в ФГУП «ГНЦ «НИОПИК» и предназначенный для фотодинамической терапии злокачественных опухолей. Физико-химические свойства вещества потребовали для возможности его использования в качестве лекарственного средства поиска не стандартной наноструктурированной модели лекарственной формы, которая была создана в лаборатории разработки лекарственных форм ГУ РОНЦ им.Н.Н. Блохина РАМН и представляет собой водно-эмуксольную мицеллярную дисперсию октасенса.
Материалы и методы. Настоящее работа посвящена разработке методики количественного определения октасенса в предложенной модели лекарственной формы. Для этого использован метод спектрофотометрии в видимой области. Из 3 максимумов в электронном спектре поглощения октасенса (383 ± 3 нм, 655 ± 3 нм, 726 ± 3 нм) в качестве аналитического выбран максимум при 726 ± 3 нм.
Результаты. На 1-м этапе разработки методики экспериментально были определены условия экстракции октасенса из водно-эмуксольной мицеллярной дисперсии. Показано, что наиболее полная экстракция октасенса достигается после предварительного разбавления водой исходной дисперсии в соотношении 1:1. В качестве экстрагента были опробованы толуол и хлороформ и отмечено, что лучшими экстагирую-щими свойствами обладает хлороформ. Известно однако, что его качество существенно влияет на спектр электронного поглощения октасенса: если в хлороформе присутствуют следы соляной кислоты, наблюдается значительный батохромный сдвиг аналитического максимума и уменьшение величины его оптической плотности. Для снятия этого нежелательного
эффекта экстракцию проводили хлороформом, предварительно обработанным поташом. Далее хлороформный экстракт, высушенный над безводным сульфатом натрия, стабилизировали добавлением спирта этилового 95% в соотношении 1:1,5. Установлено, что хлороформно-спиртовой раствор октасена подчиняется закону Бугера — Ламберта — Бера в необходимом диапазоне концентраций от 0,003 до 0,012 мг/мл. Содержание октасенса определяют измерением оптической плотности 0,0006% растворов октасенса (оптимальная концентрация) в максимуме поглощения при длине волны 726 ± 2 нм.
Выводы. Предлагаемая методика обладает хорошей воспроизводимостью и точностью. Относительная ошибка определения не превышает 2 %.
Работа поддержана Правительством г. Москвы.
С.В. Козлов, Н.Е. Торопова, О.И. Каганов Использования опухолеассоциированных маркеров крови при контроле результатов применения радиочастотной аблации в лечении колоректальных метастазов печени
ГО ВПО Самарский государственный медицинский университет
Задачи исследования. Внедрение метода исследования опухолеассоциированных маркеров (ОМ) крови при мониторинге результатов применения радиочастотной аблации (РЧА) в лечении колоректальных метастазов (МТС) печени.
Материалы и методы. На базе ГУЗ СОКОД 60 больным с диагнозом колоректальный рак проведено исследование ОМ крови (РЭА, СА 19-9, СА-242) в плане мониторинга результатов РЧА колоректальных МТС печени. У пациента перед РЧА проводился забор ОМ крови СА 19-9, СА 242, РЭА и определялись их значения. После выполнения РЧА контроль ОМ крови выполнялся через 2 нед, 1; 3; 6; 12 мес, а также проводились инструментальные исследования печени.
Результаты. При проведении первичного исследования больных перед оперативным вмешательством у всех пациентов были выявлено повышение значений одновременно 2, а в некоторых случаях и 3 опухолеассоциированных иммуномаркеров. Так у 91,67 % пациентов наблюдалось повышение СА 242 — 161,19 ± 106,14 Ед/мл (норма менее 20 Ед/мл), в 95 % случаев отмечено повышение РЭА до 79,43 ± 68,54 нг/мл (норма 5 - 10 нг/мл), а СА 19-9 у 90 % пациентов до 150,81 ± 90,58 Ед/мл (норма менее 35 Ед/мл). После РЧа МТС колоректального рака у 80 % больных через 2 нед имелась тенденция к снижению значений ОМ: СА 242 на 15,37 Ед/мл, РЭА на 8,92 нг/мл, СА 19-9 на 9,09 Ед/мл. Через 6 мес нами были определены нормальные значения ОМ: СА 242 у 23,33 % пациентов, РЭА у 46,66 %, СА19-9 у 50 %. Постепенное снижение значений ОМ после РЧА расценивалось как критерий стабилизации процесса и подтверждалось инструментальными методами исследования (УЗИ, КТ, МРТ печени). Повышение уровня ОМ, которое было выявлено в разные сроки после РЧА у 28,33 % больных, свидетельствовало о прогрессии процесса, что в дальнейшем было подтверждено инструментальными методами исследования. Через 1 мес после повышения ОМ визуализация прогрессии процесса при УЗИ стала возможной лишь у 1 пациента, а через 3 мес — у 7 больных, а при КТ — у 6 и 14 больных соответственно.
Выводы. Комбинированное исследование ОМ, таких, как СА 242, РЭА, СА 19-9, является высокочувствительным методом контроля радикальности проводимого лечения колоректального рака, в частности, РЧА, и позволяет на более ранних этапах, чем инструмен-
тальные методы исследования (УЗИ, КТ, МРТ), выявлять рецидивы и прогрессию процесса.
Н.Н. Мазуренко, И.С. Беляков, И.В. Цыганова,
И. М. Гагарин, Е.М. Бардина, П.П. Архири,
Д.А. Филоненко, О.А. Анурова Значение активирующих мутаций для онкодиагностики
ГУ РОНЦ им. H. Н. Блохина РАМН, Москва
Введение. Активация рецепторных тирозинкиназ в различных опухолях путем мутации или амплификации приводит к усилению передачи митогенных сигналов. При некоторых опухолях определение маркерных мутаций необходимо для индивидуальной молекулярногенетической характеристики пациента, имеет прогностическое значение и позволяет предсказать чувствительность к таргетной терапии. Активация EGFR при аденокарциномах легких за счет мутации является показателем чувствительности к тирозинкиназным ингибиторам — препаратам иресса и тарцева. Активирующие мутации генов KIT и PDGFRA характерны для стромальных опухолей ЖКТ (GIST), и их детекция важна для оценки прогноза и эффективности таргетных препаратов (гливек, сутент).
Материалы и методы. Проведен анализ 140 стро-мальных опухолей различных отделов ЖКТ, которые при иммуногистологическом исследовании были KIT (CD117) положительны в 95 %.
Результаты. Мутации гена KIT выявлены в 78 % и гена PDGFRA в 11т% GIST, в остальных опухолях мутации не обнаружены (KIT и PDGFRA wt). Наиболее распространены GIST с мутациями в 11 экзоне, кодирующем регуляторный домен рецептора KIT, причем, наиболее злокачественными являются GIST с делеция-ми, тогда как опухоли с точечными заменами и дупликациями менее злокачественны. Важно, что даже мета-стазирующие GIST с мутациями 11 экзона более чувствительны к гливеку, чем опухоли с мутациями 9, 13 и
17 экзонов KIT, а также GIST без мутаций. Мутации в 9 экзоне KIT выявлены в каждой 3-й опухоли тонкой кишки (13 % GIST), и их лечат удвоенной дозой гливе-ка (800 мг). Первичные мутации 13 и 17 экзонов KIT единичны, однако они выявлены в ряде опухолей с вторичной резистентностью к гливеку. При анализе гена PDGFRA наиболее часто обнаруживались делеции
18 экзона, тогда как точечные замены, в том числе и D842V, составляют меньшинство, что видимо характерно для российской выборки. В 10 случаях GIST выявлены гены KIT и PDGFRA wt, иногда в них присутствуют silent-мутации в 12 и 18 экзонах PDGFRA, такие опухоли отличаются крайне плохим прогнозом и не чувствительны к гливеку. Мутация 9-го экзона гена KIT и отсутствие мутаций KIT и PDGFRA является показанием к терапии сутентом, который начинают применять как препарат 2-й линии.
Выводы. Таким образом, тип и локализация мутации коррелируют с клинико-морфологическими характеристиками стромальной опухоли ЖКТ и имеют значение для прогноза и лечения этих больных.
И.Г. Меерович1, Г.А. Меерович2, О.В. Долотова3,
A.А.Учеваткин4, О.Ю. Савельев4, Н.В. Андронова1,
Л.М. Борисова1, В.М. Негримовский3,
Н.А. Оборотова1, Е.М. Трещалина1, О.Л. Калия3,
B.Б. Лощенов2, Ю.А. Пирогов4, Г.Н. Ворожцов3,
А.Ю. Барышников1 Наноструктурированный контрастирующий агент
для магнитно-резонансной томографии на основе марганцевого производного фталоцианина:
результаты предварительных исследований
1ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2ИОФ им. А.М. Прохорова РАН, Москва 3ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», Москва 4Центр магнитной томографии и спектроскопии МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
Материалы и методы. В настоящей работе в качестве потенциального контрастирующего агента (КА) для МРТ изучался тетра-3-фенилтио-тетра-5-трет-бутилфталоцианин марганца(Ш) хлорида [3-(PhS)4-5-(t-Bu)4PcMnCl].
3-(PhS)4-5-(t-Bu)4PcMnCl нерастворим в воде; для его исследования in vitro и введения животным была получена водно-мицеллярная дисперсия на основе Эмуксола с гомогенным распределением частиц по размеру в области 170 - 180 нм. Содержание субстанции фталоцианина марганца в дисперсии составляло до 0,56 мг/кг (0,44 ммоль/л).
Исследования in vivo динамики уровня и селективности накопления Mn-производного фталоцианина проводилось по спектрам поглощения in vivo, полученных методом спектроскопии диффузного отражения на мышах F1 с внутримышечно перевитой опухолью Эрлиха. МРТ-исследования проводились на крысах Wistar с подкожно перевитой глиомой C6. Препарат вводили в хвостовую вену в дозе 6 мг/кг (около 4,8 мкмоль/кг).
Значение удельного фактора ускорения магнитной релаксации R1 было определено на спектрометре Bruker Avance 600 «Bruker», Германия) с магнитным полем 15 Тл и составляло до 5,0 л*ммоль-1с-1 в диапазоне концентраций фталоцианина 1 - 3 мкмоль/л.
МРТ-исследования проводили по протоколу Т1-взвешенного спин-эха на томографе Bruker Biospec 70/30 («Bruker», Германия) с магнитным полем 7,0 Тл до введения препарата (в качестве контроля) и через 2 и 5 ч после его внутривенного введения в дозе 6 мг/кг.
Результаты. Изучение уровня и селективности накопления 3-(PhS)4-5-(t-Bu)4PcMnCl в опухоли по сравнению с нормальной тканью при введении в наност-руктурированной мицеллярной дисперсии показало, что обеспечивает его эффективное и селективное накопление в опухоли.
Высокая селективность накопления 3-(PhS)4-5-(t-Bu)4PcMnCl в сочетании с выраженными парамагнитными свойствами ионов марганца позволили при его введении в невысокой дозе (6 мг/кг) заметно повысить МРТ-контраст подкожно перевитой глиомы C6 на фоне окружающей здоровой ткани (индекс усиления МРТ-контраста — 1,74), сопоставимо с усилением МРТ-контраста при использовании КА «Магневист» (Bayer-Schering-Pharma) в дозе 170 мг/кг (индекс усиления МРТ-контраста — 1,76).
Выводы. Проведенные исследования показали, что 3-(PhS)4-5-(t-Bu)4PcMnCl в наноструктурированной мицеллярной дисперсии селективно накапливается в опухолях по сравнению с нормальной тканью, обладает заметной удельной способностью ускорения продольной магнитной релаксации и является перспективным для дальнейшего изучения в качестве контрастирующего агента для МРТ.
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства Москвы.
В.Н. Морозов
Новые методы иммунохимического анализа нано-аэрозолей в диагностике
Институт теоретической и экспериментальной биофизики
РАН, Пущино, Московская область
National Center for Biodefense and Infectious Diseases,
George Mason University, Manassas, VA 20110 USA
Введение. С развитием нанотехнологии увеличивается опасность выброса нано-аэрозольных частиц в атмосферу. Контроль таких «нано-загрязнений», а также патогенов, токсинов и других биомаркеров в аэрозольной форме представляет собой актуальную задачу.
Результаты. В работе описаны 2 новые технологии, разработанные автором для иммунохимического экспресс-анализа микро- и нано-аэрозолей. Первая технология позволяет быстро и дешево собирать аэрозоли фильтрованием воздуха через водорастворимые нанофильтры, полученные методом электропрядения растворов гидрофильных полимеров (типа поливинилпир-ролидона, полиакриламида) с нейтрализацией электрических зарядов в газовой фазе. Все собранные частицы освобождаются затем в небольшой объем буферного раствора для дальнейшего анализа с использованием ПЦР или иных методов.
Для быстрого анализа собранного аэрозоля автором разработан быстрый ультрачувствительный им-мунохимический метод, способный за 2 - 3 мин обнаружить 100 - 500 белковых молекул или вирусов в пробе объемом 50 - 100 ^L. Такие характеристики достигнуты благодаря замене диффузионного транспорта аналита и вторичных антител активным транспортом под действием электрических и магнитных сил. Показано также, что специфичность узнавания антигенов, основанная на механической прочности комплексов анатиген-антитело, не уступает таковой в ИФА, где специфичность определяется различием в термодинамической стабильности комплексов антиген-антитело.
Выводы. Указанные методы могут быть использованы для бесконтактной диагностики инфекционных и онкологических заболеваний легких, основанной на анализе биомаркеров в легочной жидкости, присутствующей в виде нанокапель в выдыхаемом воздухе. Разработанные технологии могут быть также применены для контроля загрязнения воздуха патогенами в местах общественного пользования, больницах и животноводческих комплексах.
Д.В. Новиков1, Т.В. Белова1, Д.И. Князев1,
Т.В. Наседкина2, А.В. Калугин1, В.В. Новиков1 Биочип для выявления мРНК раково-тестикулярных антигенов
1НИИ молекулярной биологии и региональной экологии ННГУ имени Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород
2 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН
Введение. Раково-тестикулярные антигены — это белки, в норме экспрессирующиеся в сперматогониях, эмбриональных тканях, плаценте, а также в клетках большей части первичных и метастатических опухолей различных гистологических типов. Ограниченная экспрессия раково-тестикулярных антигенов позволяет использовать их для выявления и прогнозирования течения неопластического процесса.
Задачи исследования. Разработать метод выявления мРНК 15 раково-тестикулярных антигенов с использованием гибридизации нуклеиновых кислот на биологическом чипе.
Материалы и методы. Для получения фрагментов кДНК раковотестикулярных антигенов применяли множественную ОТ-ПЦР с использованием специфических праймеров. Во 2-й стадии ПЦР полученную кДНК метили с использованием Cy-5 dUTP. Продукты реакции гибридизовали со специфичными олигонукле-одидными зондами, иммобилизованными в гидрогеле. Результаты реакции анализировали по интенсивности флюоресценции.
Результаты. На основе анализа нуклеотидных последовательностей мРНК раково-тестикулярных антигенов были подобраны праймеры и зонды для выявления мРНК NY-ESO-I, 8 представителей семейства GAGE антигенов и 6 представителей MAGE-A антигенов. Для предотвращения неспецифической амплификации хромосомной ДНК использовали праймеры, комплементарные местам соединения экзонов при сплайсинге мРНК. Подобранные праймеры использовали как для раздельного выявления мРНК 15 раковотестикулярных антигенов методом ОТ-ПЦР, так и для проведения множественной ОТ-ПЦР с последующей гибридизацией нуклеиновых кислот на биочипе. При сравнении результатов определения мРНК раковотестикулярных антигенов GAGE 1-8, MAGE-A(1-6) и NY-ESO-I в 10 образцах клеток опухолевого очага рака легкого, полученных методами «nested» ПЦР и гибридизации нуклеиновых кислот на ДНК-чипе, показано соответствие результатов.
Выводы. С применением технологии биочипов разработан метод выявления мРНК 15 раковотестикулярных антигенов, показано его соответствие методу «nested» ПЦР.
Ю.А. Пирогов1, Н.А. Брусенцов2, Т.Н. Брусенцова3,
А.А. Учеваткин1.
Магнитно-резонансный томографический контроль злокачественных опухолей в процессе магнитогидродинамической термохимиотерапии с применением магнитоуправляемых нанопрепаратов
1Центр магнитной томографии и спектроскопии
МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва
2ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
3Институт общей физики им. А.М. Прохорова РАН, Москва
Цель исследования. Количественная оценка усиления МРТ-изображений аскорбинатмагнетитом (АМ) в сочетании с магневистом в процессе магнитогидродинамической термохимиотерапии злокачественных опухолей (МТ).
Материалы и методы. Для контроля эффективности МТ использовали метод магнитно-резонансной томографии, который является неинвазивным и позволяет проводить in vivo мониторинг развития и регрессии опухоли. При внутривенном введении АМ с дополнительным введением магневиста и последующим Т2, Т2*-взвешенным 3D сканированием получают МРТ-изображения, на основании которых определяют расположение и функциональное состояние опухоли, внутренних органов и метастазов. Сканирование проводят на магнито-резонансном биоспектротомографе BIOSPEC BC 70/30 USR. (Bruker) в режимах: T1-взвешенное (TR/TE = 500/15 мс), Т2-взвешенное (TR/TE = 6000/63 мс) на основе спинового эха и T2-взвешенного градиентного эха (TR/TE = 500/15 мс, угол поворота 15°). Одним из эффективных способов терапии опухолей является: магнитогидродинамическая термохимиотерапия злокачественных опухолей (МТ).
Результаты. Минимальная температура +43 °С, необходимая при терапии глубокозалегающих опухолей, трудно достижима с применением существующих устройств МТ, ряд проблем в технологии МТ остаются нерешенными: 1) увеличивающаяся при МТ перфузия крови через ткани опухоли ускоряет клиренс нанопрепаратов, опухоль быстро опустевает и не нагревается; 2) поскольку для МТ пока не синтезированы магнитоуправляемые противоопухолевые нанопрепараты (МПН) с ТС.43 - 46 °C, в качестве магнитного носителя используют наночастицы магнетита (Fe3O4, ТС 585 °С и y-Fe2O3), покрытые декстраном (C^oO^^QH^fy-
Fe2O3)p(Fe3O4)n, декстранферрит; 3) при МТ на поверхности крупных сосудов внутри опухоли и по краям её остаются островки непрогретой при 45 - 46 °С опухолевой ткани, содержащие выжившие клетки-источники прогрессии опухолей; 4) распределение нанопрепаратов, не пропорциональное величине термической конвекции данных опухолевых тканей; 5) не проводится мониторинга влияния на опухоль и органы РЭС каждого отдельного сеанса терапии, заключение по результатам лечения принимается в конце планируемого курса, без учета результатов дробных сеансов МТ.
Выводы. Основную часть перечисленных проблем можно частично решить путем контроля содержания нанопрепаратов в опухоли и в РЭС. Необходимы МПН, обладающие высокой удельной абсорбцией энергии ЭМП с температурой Кюри (ТС), равной 44 - 46 °C. Принципы, лежащие в основе перечисленных проблем, во многом справедливы для способа магнитогидродинамической термохимиотерапии злокачественных опухолей.
А.В. Рябова1’2, В.Б. Лощенов1’2, Е.Ф. Странадко3,
И.А. Шикунова4, В.Н. Курлов4
Лазерно-спектроскопический
наноскальпель
для резекционной диагностики
ЦениИОФ РАН, Москва 2ЗАО «Биоспек», Москва
3ФГУ ГНЦ лазерной медицины Росздрава, Москва 4ИФТТ РАН, Черноголовка
Сапфир обладает высоким показателем преломления и широкой полосой оптического пропускания в УФ, видимой и ИК областях спектра. Оптические характеристики сапфира позволяют реализовать подсветку зоны разреза и коагуляцию в процессе разрезания, когда лезвие работает как волновод с концентрацией излучения в области режущей кромки.
Разработаны методики выращивания тонких (диаметром менее 0,6 мм) капиллярных каналов в сапфировых лентах, на основе которых можно создать принципиально новый тип хирургических инструментов — скальпели с возможностью одновременной резекции и флюоресцентной диагностики состояния резецируемой ткани в окрестности режущего острия непосредственно в процессе хирургической операции. Во время хирургической операции, например, по удалению злокачественных опухолей одновременно с резекцией ткани обеспечивается спектроскопическая диагностика ткани с применением фотосенсибилизаторов (ФС), что позволяет объективно оценивать степень кровенаполнен-ности органов для планирования коагуляции и определять наличие раковой ткани для оценки распростанен-ности опухоли и правильности выбора объема резецируемой ткани.
Принцип основан на том, что в 2 изолированных каналах, которые своими торцами подходят непосредственно к режущей кромке сапфирового скальпеля, размещены оптические кварцевые волокна, причем одно из них предназначено для подачи излучения, возбуждающего флюоресценцию, или коагулирующего излучения, в зону резекции ткани, другое предназначено для передачи излучения флюоресценции. Дистальные концы оптических волокон расположены вблизи режущей кромки лезвия, что позволяет получать достаточный для спектральной диагностики с применением ФС захват регистрирующим волокном энергии флюо-
ресцентного излучения от прилегающих тканей и одновременно эффективную концентрацию энергии излучения в области режущей кромки лезвия от излучающего волокна для фотодинамического воздействия или коагуляции, в повышении механической и химической надежности облучающего узла, за счет исключения контакта оптических волокон со средами организма и друг с другом.
Работа выполнена при поддержке РФФИ в 2008 г.
А.В. Шишкин1,2, И.И. Шмырев1, Н.Г. Овчинина2,
С.А. Кузнецова , А.В. Вылегжанина , А.А. Бутылин , Ф.И. Атауллаханов1,3
Разработка иммунологических биочипов для определения поверхностных антигенов нормальных и опухолевых клеток крови
1ГУ Гематологический научный центр РАМН, Москва 2Ижевская государственная медицинская академия,
Ижевск
3Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, Москва
Определение антигенов, экспрессируемых на поверхности клеток, имеет большое значение для диагностики опухолей системы крови. Для определения поверхностных антигенов клеток методом иммунофено-типирования широко используется проточная цитофлюориметрия. К ее недостаткам можно отнести невозможность одновременного определения большого числа поверхностных антигенов, а также необходимость использования дорогостоящего оборудования. В настоящее время быстро развиваются новые методы анализа, связанные с использованием биочипов. Иммунологический биочип представляет собой твердую поверхность (подложку) с иммобилизованными на ней в строго определенных участках антителами, специфичными к поверхностным антигенам клеток. В результате инкубации биочипа с клеточной суспензией в области участков (пятен) с иммобилизированными антителами специфически связываются клетки, имеющие соответствующие поверхностные антигены. Наряду с иммуно-фенотипированием одним из важнейших методов диагностики опухолей системы крови является морфологическое исследование клеток. Поэтому задачей данной работы было создание биочипа, позволяющего совместить определение содержания в суспензии клеток, экспрессирующих различные поверхностные антигены, и их морфологическое исследование.
Нами были созданы экспериментальные биочипы, позволяющие определять поверхностные антигены CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD16, CD19. CD20, CD21, CD22, CD45, CD45RA и CD56 на различных клетках крови. Была разработана методика установления процентного содержания в суспензии клеток, экспрессирующих определяемые поверхностные антигены. На примере исследования клеток 3 здоровых доноров и 10 больных В-клеточным хроническим лимфо-лейкозом мы показали, что результаты, полученные при помощи биочипов, соответствуют данным проточной цитофлюориметрии. При окрашивании связавшихся на биочипе клеток по Романовскому — Гимзе было показано, что их морфология сходна с морфологией клеток, окрашенных в мазке. Использование биочипа в сочетании с проточной камерой позволяет концентрировать на биочипе клетки крови, присутствующие в исследуемом образце в небольшом количестве.
