CC BY
73
urgent need to develop the efficient NDM-1 inhibitors of various mode of action thereby necessitating structural studies of the enzyme as well as analysis of the secretion pathway and localization of the protein. The recombinant full-length NDM-1 is produced in E.coli in the inactive form and is mostly accumulated in the inclusion bodies. The secreted recombinant NDM-1 forms are several N-terminally truncated species. The robust expression system capable of high-level production of the
full-length NDM-1 and derivatives thereof is required to obtain NDM-1 in the quantities necessary for drug discovery, diagnostics, and research purposes. Therefore, we developed a new system that utilizes antibiotic pressure to select E. coli producing increased quantity of soluble NDM-1 and showed that an increase in the NDM-1 solubility occurs in the bacterial clones producing increased amounts in the chaperones. Key words: chaperone activity, E.coli
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 579.841.94:579.25].083.3
А.Ю. Медкова, Л.Н. Синяшина, Ю.П. Румянцева, О.Л. Воронина, М.С. Кунда, Г.И. Каратаев накопление авирулентных инсерционных ВVG мутантов bordetella
pertussis при экспериментальной инфекции лабораторных мышей
ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи МЗ РФ, Москва, Россия
Изучены длительность персистенции возбудителя коклюша и динамика накопления авирулентных инсерционных Bvg- мутантов Bordetella pertussis в легких лабораторных мышей после их интраназального и внутривенного инфицирования вирулентными бактериями. Установлено, что бактерии возбудителя коклюша способны к длительной персистенции в организме лабораторных мышей. ПЦР в режиме реального времени в легких мышей выявляет сотни геном эквивалентов ДНК B.pertussis, независимо от способа введения бактерий, спустя 2 мес после инфекции, тогда как время идентификации бактерий с помощью посева на селективную питательную среду ограничено 28 днями. С течением времени происходит накопление Bvg- мутантов B.pertussis, доля которых через 7—9 нед достигает 50% от общего числа бактерий в популяции. Полученный результат показывает возможность использования лабораторных мышей для изучения динамики накопления инсерционных мутантов B.pertussis in vivo и подтверждает предположение о накоплении инсерци-онных авирулентных мутантов в процессе развития коклюшной инфекции у людей.
Ключевые слова: коклюш, персистенция, инсерционные мутанты, вирулентность
Коклюш — респираторное инфекционное антро-понозное заболевание, вызываемое грамотрицатель-ными бактериями B.pertussis, характеризующееся приступообразным судорожным кашлем и высокой летальностью у детей раннего возраста. Несмотря на продолжительную массовую вакцинацию, проводимую в разных странах с начала 50-х годов прошлого столетия, элиминации возбудителя в популяции не происходит. Ежегодно в мире регистрируется до 50 млн случаев заболевания коклюшем, из которых около 300 тыс. приводят к летальному исходу [7]. В последние годы отмечается значительный рост числа лабораторно подтвержденных случаев заболевания коклюшем среди подростков и взрослых [20]. Недостаточно высокое качество ранней диагностики коклюша приводит к тому, что коклюш, протекающий в атипичных формах, часто смешанных с другими респираторными бактериальными или вирусными инфекциями, не диагностируется [2, 3]. Выявлены случаи бессимптомного носительства B. pertussis [20]. Взрослые и подростки, в том числе, и "практически здоровые", являются важным резервуаром возбудителя коклюша и источником инфекции для восприимчивых детей младшего возраста и неиммунизированных детей старшего возраста [9, 16, 19]. До 85% младенцев заражаются от членов семьи [20], при этом около 90% — от бессимптомных носителей инфекции [16].
Современные противоэпидемические мероприятия предполагают изоляцию больных коклюшем для
разрыва цепи передачи возбудителя. Однако неясно, как долго больной и тем более "практически здоровый" человек, у которого обнаружены бактерии B.pertussis, является носителем инфекции и способен выделять возбудитель. По данным ряда исследований, бактерии возбудителя присутствуют в носоглотке от 3 до 7 нед после установления диагноза "коклюш" и начала лечения [8, 10]. Длительность бактерионосительства "практически здоровыми" людьми, находившимися в контакте с больными коклюшем, не изучалась. В опубликованных нами работах представлены результаты анализа бактерий B.pertussis, обнаруженных у больных с типичными и атипичными формами коклюша, а также у "практически здоровых" людей. Показано, что исследованные популяции бактерий B.pertussis гетерогенны по фазовому составу и содержат разное число авирулентных бактерий, несущих инсерции Ш481 или ^1002 в специфическом сайте оперона вирулентности BvgAS, что предполагает возможность накопления инсерционных авирулентных мутантов в развитии инфекционного процесса [2, 3]. Значение таких мутантов для развития инфекционного процесса, переживания бактерий внутри эукариотических клеток, формирования бактерионосительства и передачи бактерий новому хозяину практически не изучено. Для экспериментальной проверки предполагаемого нами механизма формирования авирулентных, персистирующих в организме человека бактерий, в результате внедрения ^-элементов в оперон вирулентности необходим структурный анализ популяций бактерий B.pertussis у многочисленной группы больных на разных стадиях заболевания и у "практически здоровых" людей. Проведение таких исследований требует диспансерного наблюдения и соответствующего финансирования. В качестве первого приближения для решения поставленной задачи могут быть использованы лабораторные животные. В настоящей работе представлены результаты изучения динамики изменения фазового состава популяции бактерий B.pertussis при экспериментальном заражении лабораторных мышей. Несмотря на то что мыши не болеют коклюшем и не являются адекватной для человека экспериментальной моделью, на сегодняшний день "мышиная модель" используется для изучения некоторых характеристик инфекционного процесса и оценки качества коклюшных вакцин [21]. Важным преимуществом лабораторных мышей является воз-
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
можность стандартизации эксперимента и использования для выделения ДНК ткани целого легкого.
Целью настоящего исследования является моделирование формирования и динамики накопления инсерционных Bvg- мутантов B.pertussis в макроорганизме при экспериментальной инфекции лабораторных мышей.
Материалы и методы
Штаммы и условия культивирования. Бактерии вирулентного штамма B.pertussis 134 культивировали на плотной питательной среде КУА (казеиново-угольном агаре) с добавлением 10% дефибринированной крови барана в течение 36—72 ч.
Лабораторные животные. В работе использовали беспородных белых мышей обоего пола 3—4-недельного возраста весом 10—12 г.
Заражение мышей. Внутривенно и интраназально мышам вводили бактерии B.pertussis 134, по 80 мышей в каждой группе. При внутривенном заражении в хвостовую вену вводили 30 мкл суспензии, содержащей 3x10' бактерий B.pertussis. При интраназальном заражении в каждую ноздрю вводили 25 мкл суспензии, содержащей 3x10' бактерий B.pertussis. Титр бактерий определяли по международному оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Контрольным мышам (по 24 мыши в каждой группе) вводили соответствующие количества стерильного 0,85% раствора хлорида натрия.
Подготовка материала для микробиологического исследования и выделения ДНК. После предварительного усыпления мышей нембуталом [5] извлекали легкие у 10 мышей из каждой группы через 2 и 24 ч, затем на 7, 14, 28, 42, 49-й и 63-й дни после заражения. Легкие гомогенизировали в 1 мл 0,85% раствора хлорида натрия (рН 7,2—7,4), инкубировали 15 мин при температуре 35°С и центрифугировали при 3000 оборотах/ мин 5—10 мин. Надосадочную жидкость разводили в 10, 100 и 1000 раз, затем по 0,1 мл из каждого разведения высевали на 3 чашки Петри с селективной средой КУА и 2 мл исходного супернатанта использовали для выделения ДНК. В каждой точке наблюдения подсчитывали число выросших колоний на всех чашках Петри. Среднее количество КОЕ в легких каждой мыши (КОЕ/мл) рассчитывали по стандартной формуле [21].
Выделение ДНК B.pertussis из клинического материала и суперна-тантов гомогенатов легких мышей проводили с использованием магнитного сорбента в соответствии с инструкцией к набору WizardGenomic DNA PurificationSystem ("Promega", США).
Для выявления ДНК B. pertussis из клинических образцов и определения фазового состава популяции B.pertussis использована модифицированная тест-система ПЦР в реальном времени (ПЦР РВ) [2, 4]. В основу выбора праймеров для определения количества геном-эквивалентов ДНК (ГЭ) и инсерций IS481 в CCTAGG сайте оперона вирулентности B.pertussis положена схема, представленная на рис. 1а. Аналогичный подход использован для регистрации ин-серций IS1002. В качестве характеристики фазового состава использовали величину, характеризующую частоту регистрации инсерци-онных мутантов в анализируемой популяции (n 481). Значение n 481 рассчитано как относительное количество молекул ДНК B.pertussis, содержащих инсерции IS1002 или IS481 в CCTAGG сайте оперона, из соотношения n481 = N481/QBP. Qbp — количество ГЭ ДНК B.pertussis, рассчитанное как среднее значение величин (Q/S481/238) и (Q1S1002/6), где QjS481 и Q/S1002 — количество /S481 и /51002, определенное по результатам ПЦР РВ [2, 4]. N481 — количество геномов B.pertussis, содержащих инсерцию IS-элемента. Для построения калибровочной кривой использованы клонированные в составе плазмиды рGem фрагменты хромосомы B.pertussis, содержащие инсерции IS481 или IS1002 в опероне BvgAS [4].
Определение нуклеотидной последовательности, встроенной в CCTAGG сайт оперона вирулентности BvgAS. При высокой концентрации ДНК B. pertussis в образце ПЦР проводили с праймера-ми Sf- Bp2, при низкой копийности ДНК продукты, полученные в первой реакции, дополнительно амплифицировали с праймерами SF-Bp111. Ампликоны, очищенные с помощью Wizard PCR preps purification system ("Promega", США), секвенировали на приборе 3130 GeneticAnalyzer ("AppliedBiosystems"/"Hitachi"). Использовали наборы BigDyeTerminatorv 3.1 CycleSequencing. Режим амплификации выбирали согласно рекомендациям к прибору. Электрофорез продуктов реакции осуществляли в капиллярах длиной 50 см с полимером POP-7.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы MicrosoftExcel 2007 и методов статистической обработки, принятых в биологии и медицине [1].
Результаты и обсуждение
Бактерии возбудителя коклюша могут находиться в разных фазовых состояниях, крайними из которых являются вирулентная фаза (Bvg+, I фаза) и авирулент-ная (Bvg- , IV фаза). Описаны также промежуточные состояния бактерий — фазы II и III (Bvgi) [12]. Вирулентные бактерии характеризуются наличием функционирующего оперона BvgAS, кодирующего регуляторы транскрипции генов вирулентности возбудителя. Переход бактерий из фазы I в фазу IV происходит в результате нарушения транскрипции оперона BvgAS, наблюдающегося при изменении условий культивирования бактерий (фазовые модуляции) [11] или при нарушении структуры оперона вирулентности. До недавнего времени был описан только один тип структурных нарушений оперона BvgAS — точечные мутации [17]. В наших исследованиях [6], а также работе S. Stibitz [18] показана возможность перемещения IS-элементов (IS481 и IS1002) в специфический сайт оперона BvgAS хромосомы B.pertussis. Бактерии возбудителя, содержащие инсерцию IS-элемента в опероне BvgAS, не способны синтезировать факторы вирулентности и находятся в авирулентном, непатогенном для человека состоянии. Такие бактерии были обнаружены нами в клинических образцах, полученных от больных коклюшем людей [2—4].
Определение сроков персистенции бактерий B.pertussis при экспериментальном заражении мышей. Лабораторных мышей заражали внутривенно и интраназально. Идентификацию возбудителя коклюша в легких контрольных и зараженных животных проводили с помощью бактериологического метода и в реакции ПЦР РВ.
Вне зависимости от способа инфицирования при посеве на селективную среду КУА супернатантов го-могенатов легких мышей рост бактерий B.pertussis наблюдали до 28-го дня после заражения. На 42-й день только у некоторых мышей регистрировались единичные колонии возбудителя (рис. 2).
Максимальное количество ГЭ B.pertussis, независимо от способа заражения, было зарегистрировано в легких инфицированных мышей на 7-й и 14-й дни, а затем снижалось с течением времени наблюдения (рис. 3). ДНК B.pertussis выявляется в образцах до конца срока наблюдения — 63 дня после заражения, тогда как рост бактерий наблюдался только до 28-го дня. Отсутствие бактериальных колоний на 49—63-й день, при значительном количестве ГЭ, регистрируемых с помощью ПЦР РВ (см. рис. 2, 3), может быть связано с переходом значительной части бактерий возбудителя коклюша, размножающихся в легких мышей, в некультивируемое состояние или с низкой выживаемостью бактерий B.pertussis в процессе приготовления материала для бактериологического исследования. Наличие некультивируемых форм возбудителя коклюша в настоящее время не показано, тогда как низкая выживаемость бактерий во внешней среде, в том числе и при высеве материала из назофарингеальных аспиратов, взятых у больных с типичной формой коклюша, продемон-
Рис. 1. Структура фрагмента хромосомы, содержащего инсерцию /S481 в CCTAGG сайте оперона BvgAS B. pertussis.
а — схема фрагмента. Заштрихованная прямоугольная стрелка показывает положение интегрированного элемента ZS481 в CCTAGG сайте оперона BvgAS B. pertussis (обозначен залитыми прямоугольными стрелками). Маленькими угловыми стрелками обозначено положение праймеров; б
— фрагмент последовательности, сформированной в результате интеграции ZS481 в CCTAGG сайт оперона BvgAS B. pertussis. Прямым шрифтом изображена последовательность ZS481; курсивом
— последователность хромосомы B.pertussis, расположенная между праймером SF и сайтом интеграции CCTAGG. Заливкой выделена последовательность праймера SF; подчеркнутым и жирным
шрифтом выделены последовательности праймеров Вр481-42 и Вр2 соответственно.
стрирована многими исследователями. В наших исследованиях от единичных до сотен бактериальных колоний удавалось зарегистрировать при посеве материала из назофарингеальных мазков только у 30— 40% больных с клиническим диагнозом "коклюш". В лабораторной практике эти цифры еще ниже, при этом количество ГЭ в 5 мкл эквивалентного образца, определенное методом ПЦР РВ, составляло более 104 [6]. Таким образом, низкая высеваемость бактерий возбудителя коклюша в клинических образцах от больных коклюшем людей и лабораторных животных, является не вполне понятным, но достоверным фактом, подтвержденным экспериментальными исследованиями и лабораторной практикой при диагностике коклюша.
При посеве и ПЦР-анализе супернатантов гомо-генатов легких контрольных мышей роста колоний и регистрации ДНК возбудителя коклюша не наблюдалось.
Определение фазового состава популяции перси-стирующих бактерий B.pertussis при экспериментальном заражении мышей.
Помимо количества ДНК в каждой точке наблюдения определяли фазовый состав популяции бактерий B.pertussis. Результаты эксперимента представлены на рис. 4.
Через 2 ч в легких мышей, зараженных внутривенно, ДНК B.pertussis не обнаруживалась, а через 24 ч регистрируется от нескольких десятков до нескольких сотен ГЭ. В легких мышей, зараженных интраназально, через 2 и 24 ч обнаружено от не-
скольких десятков до нескольких сотен ГЭ, а у 4 мышей — около 105—106 ГЭ B.pertussis в 5 мкл образца. Количество интеграций т81 и ^1002 в оперон BvgAS в трех из четырех препаратов не превышало единичных значений, а в одном не зарегистрировано совсем. Эти результаты позволяют считать, что популяция возбудителя в первые часы после инфицирования животных сохраняет гомогенность и так же, как популяция бактерий B.pertussis, выращенных на среде КУА, содержит не более 10-5—106 инсерционных Вvg" мутантов от общего числа молекул. При обоих способах заражения относительное число авирулентных бактерий в анализируемой популяции существенно нарастает, начиная с 7—14-го дня после заражения мышей, и в среднем достигает 50% от общего объема бактериальной популяции к концу срока наблюдения. Аналогичные результаты получены при анализе интеграций Ш1002 в оперон BvgAS, с той лишь разницей, что их число так же, как и в проведенных нами ранее исследованиях [2—4], как правило, было ниже, чем количество интеграций ^481. Достоверность определения приведенных выше параметров популяции не вызывает сомнения, поскольку количество ГЭ ДНК B.pertussis в 5 мкл исследуемого образца у большинства животных за время наблюдения не опускалось ниже, чем 102—103 молекул, при этом количество инсерционных мутантов B.pertussis составляло в среднем 102, что значительно выше предельной чувствительности метода. Тем не менее, в нескольких образцах, полученных от экспериментально зараженных животных, было обнаружено около 102 ГЭ ДНК B.pertussis и 10—30 — инсерционных мутантов, количество которых находится на пределе чувствительности метода. Для доказательства того, что регистрируемые нами продукты ПЦР действительно представляют собой структуры, сформированные в результате интеграции .й-элементов в CCTAGG сайт оперона BvgAS, проведено секвенирование продуктов нестед-ПЦР трех таких образцов. С той же целью определена последовательность двух продуктов амплификации ДНК, содержащих более 1000 искомых интеграций по результатам ПЦР РВ (см. "Материалы и методы").
Результаты определения последовательности всех фрагментов показали идентичность продуктов амплификации друг другу и ожидаемой последовательности, сформированной в результате интеграции .Й481 в CCTAGG сайт оперона BvgAS B.pertussis (см. рис. 1, б). Каких-либо нарушений последовательности ДНК-мишени (делеций или инверсий) в обла-
экспериментальные статьи
7-1 6-„ 5-
I4-
S зн * 21 -о
к.-- JÍ» jy JÍ» jy jy JÍ»
/ / / / / /
J* „> J* J*
А »> rib ^ 5°» <£>
& &
Сроки наблюдения
<V* <Г <? <Г <f
&
Сроки наблюдения, дни
Рис. 2. Регистрация бактерий возбудителя коклюша бактериологическим методом в гомогенатах легких мышей после внутривенного и интраназального заражения вирулентными бактериями B.pertussis.
Темные прямоугольники на гистограмме соответствуют количеству КОЕ при внутривенном заражении; светлые — при интраназальном. По оси абсцисс — сроки наблюдения (часы и дни), на оси ординат — ^ (КОЕ/мл).
Рис. 3. Динамика изменения содержания геном-эквивалентов ДНК B.pertussis в легких мышей после внутривенного и интра-
назального заражения. Ромбами представлены точки на графике, соответствующие интрана-зальному введению бактерий; прямоугольниками — внутривенному введению. По оси абсцисс — сроки наблюдения (часы и дни), на оси ординат — ^ (N481).
сти, прилегающих к сайту интеграции, не обнаружено. Аналогичные результаты получены нами [6] и S. Stibitz [18] при анализе перемещений IS481 и IS1002 в CCTAGG в экспериментах in vitro.
Таким образом, с помощью ПЦР-РВ было обнаружено, что бактерии B.pertussis сохраняются в организме инфицированных мышей до конца наблюдения, что значительно дольше времени их выявления с помощью бактериологического метода и может указывать на переход бактерий в некультивируемое состояние через 30—40 дней после начала инфекционного процесса. С течением времени количество бактерий в легких мышей уменьшается. В первые часы после инфекции подавляющее большинство бактерий возбудителя коклюша в легких лабораторных мышей независимо от способа инфицирования животных находятся в вирулентном состоянии, характеризующемся нативной структурой оперона BvgAS. В процессе развития инфекции возрастает степень гетерогенности популяции бактерий B.pertussis в результате увеличения доли авирулентных мутантов возбудителя коклюша, несущих инсерцию одного из IS-элементов в опероне BvgAS B.pertussis, количество которых через 49—63 дня после заражения достигает в среднем 50% от общего числа бактерий в популяции. Эти данные согласуются с результатами единичных наблюдений, которые удалось провести на разных стадиях коклюша у людей, и подтверждают наше предположение о формировании и накоплении авирулентных мутантов, возникающих в результате перемещения IS-элементов в оперон BvgAS B.pertussis, в развитии инфекционного процесса у людей. Предлагаемая нами экспериментальная модель может быть использована не только для изучения динамики накопления инсерционных мутантов, но, по-видимому, и возможности появления in vivo вирулентных ревертантов, содержащих интактную структуру оперона вирулентности.
Отправной точкой для формулирования гипотезы
об IS-индуцированной изменчивости бактерий возбудителя коклюша в макроорганизме послужил установленный факт специфического перемещения IS481 и IS1002 в CCTAGG сайт оперона BvgAS B.pertussis. Анализ последовательностей хромосом разных штаммов B.pertussis показывает, что последовательности CCTAGG не только фланкируют имеющиеся IS-элементы, но распределены по всему геному, в том числе присутствуют во многих генах вирулентности и представляют собой потенциальные сайты для перемещения IS-элементов. Следовательно, эти гены также являются мишенями для IS-индуцированной инактивации, закрепление которой может быть выгодно для выживания бактерии в данном хозяине или для ее сохранения в изменяющихся условиях внешней среды. Бактерии, содержащие инсерцию IS481 в гене prn, кодирующем один из адгезинов возбудителя коклюша, были выявлены недавно в Японии и США при анализе штаммов, выделенных от больных коклюшем в конце прошлого — начале нынешнего века [14, 15]. Их появление так же, как и появление возбудителей коклюша, обладающих другими, "новыми" генотипами, многие исследователи связывают с длительным применением противококлюшных вакцин [13]. Эти результаты делают актуальным дальнейшее исследование гетерогенности популяций бактерий возбудителя коклюша в организме больных и бактерионосителей, используя для анализа другие гены вирулентности B.pertussis.
Сведения об авторах:
Каратаев Геннадий Иванович (Karataev Gennadiy Ivanovich) — вед. науч. сотр., д-р биол. наук, e-mail: karataevgi@rambler.ru Синяшина Людмила Николаевна (Sinyashina Ludmila Nikolaevna) — ст. науч. сотр., канд. мед. наук
Медкова Алиса Юрьевна (Medkova Alisa Yuryevna) — мл. на-учн. сотр.
Румянцева Юлия Петровна (Rumyantseva Yulia Petrovna) — ст. науч. сотр., канд. мед. наук
Воронина Ольга Львовна (Voronina Olga Sergeevna) — канд. биол. наук, доц., вед. научн. сотр., рук. лаб.
Рис. 4. Динамика накопления авирулентных инсерционных мутантов Б.регЫзз1з в легких внутривенно и интраназально зараженных мышей в процессе развития экспериментальной инфекции.
Ромбами представлены точки на графике, соответствующие интраназаль-ному введению бактерий; квадратами — внутривенному введению. По оси абсцисс — сроки наблюдения (часы и дни), на оси ординат — ^ (N481).
Кунда Марина Сергеевна (Kunda Marina Sergeevna) — канд. биол. наук., ст. науч. сотр.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика; 1999.
2. Медкова А.Ю., Аляпкина Ю.С., Синяшина Л.Н. Мол. генетика, микробиология, вирусология. 2010; 4: 9—13.
3. Медкова А.Ю., Аляпкина Ю.С., Синяшина Л.Н. Детские инфекции. 2010; 4: 19—22.
4. МедковаА.Ю. Автореф. дис. канд. мед. наук. М.; 2013.
5. СиняшинН. И. Доклады АН УзССР. 1986; 7: 55—6.
6. Синяшина Л.Н., Воронцов В.В, Сёмин Е.Г. и др. Генетика. 2005; 12: 1—9.
7. Assessment and Monitoring Team Vaccine. WHO-Recommended Standards for Surveillance of Selected Vaccine-Preventable Diseases. Geneva, Switzerland: Department of Vaccines and Biologicals, World Health Organization; 2003.
8. Bidet P., Liguori S., De Lauzanne A. J. Clin. Microbiol. 2008; 46: 3636—8.
9. BisgardK.M., Pascual F.B., Ehresmann K.R. et al. Pediatr. Infect. Dis. J. 2004; 23: 985—9.
10. Bonacorsi S., Farnoux C. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(10): 3830—2.
11. Graeff-WohllebenH., DeppischH, GrossR. Mol. Gen. Genet. 1995; 247: 86—94.
12. Mattoo S., Cherry J.D. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18: 326—82.
13. MooiF.R. Infect. Genet. Evol. 2010; 10: 36—49.
14. Otsuka Nao, Han Hyun-Ja, Toyoizumi-Ajisaka Hiromi et al. PLoS One. 2012; 7: e31985.
15. QueenanA.M., CassidayP. K. EvangelistaA. N. Engl. J. Med. 2013; 368: 583—4.
16. Raymond J., Armengaud J.B., Cosnes-Lambe C. et al. Clin. Microbiol. Infect. 2007; 13: 172—5.
17. Stibitz S., Aaronson W., Monack D., Falkow S. Nature. 1989; 338: 226—9.
18. Stibitz S. J. Bacteriol. 1998; 180: 4963—6.
19. WendelboeA.M., NjamkepoE., BourillonA. et al. Pediatr. Infect. Dis. J. 2007; 26(4): 293—9.
20. WoodN., MclntgreP. Pediatr. Respir. Rev. 2008; 9: 201—12.
21. World Health Organization. Biolo. Standart. — 2011. — 2158.
Поступила 01.04.13
ACCUMULATION OF THE BVG- BORDETELLA PERTUSSIS AVIRULENT MUTANTS IN THE PROCESS OF EXPERIMENTAL WHOOPING COUGH IN MICE
A. Yu. Medkova, L. N. Sinyashina, Yu. P. Rumyantseva, O. L. Voronina, M. S. Kunda, and G. I. Karataev
Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow,
Russia
The duration of the persistence and dynamics of accumulation of insertion bvg- Bordetella pertussis mutants were studied in lungs of laboratory mice after intranasal and intravenous challenge by virulent bacteria of the causative agent of whooping cough. The capability of the virulent B. pertussis bacteria to long-term persistence in the body of mice was tested. Using the real-time PCR approximately hundred genome equivalents of the B. pertussis DNA were detected in lungs of mice in two months after infection regardless of the way of challenge. Using the bacterial test bacteria were identified during only four weeks after challenge. Bvg- B. pertussis avirulent mutants were accumulated for the infection time. The percentage of the avirulent bacteria in the B. pertussis population reached 50% in 7—9 weeks after challenge. The obtained results show that the laboratory mice can be used for study of the B. pertussis insertion mutant formation dynamics in vivo and confirm the hypothesis about insertional bvg-B. pertussis virulent mutants accumulation during development of pertussis infection in human.
Key words: causative agent of whooping cough, persistence, insertional mutants, virulence
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616.98:578.833.28]-078.33:577.21.083.2
С. В. Серегин1, В. С. Петров1, М. П. Гришаев2
методы диагностики крымской-конго геморрагической лихорадки
Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора, п. Кольцово, Новосибирская обл., 630559; 2Закрытое акционерное общество "Вектор-Бест", п. Кольцово,
Новосибирская обл., 630559
Приведена краткая характеристика различных методов диагностики Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ). Показано, что создание иммуноферментных диагностикумов (ИФА-тест-систем) для выявления антител к вирусу ККГЛ на основе рекомбинантных антигенов, полученных в клетках Е.соН, сопряжено с рядом существенных сложностей, которые еще предстоит преодолеть. Представлены оригинальные результаты разработки и внедрения в производство тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ, основанной на проведении реакции обратной транскрипции и двухраундовой полимеразной цепной реакции. Пред-
ложена схема скрининга образцов, потенциально содержащих вирус ККГЛ, с использованием рестрикционного анализа ампли-конов на основе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с целью их предварительного генотипирования.
Ключевые слова: вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), диагностика ККГЛ, рекомбинантные вирусные белки, иммуноферментный анализ, метод обратной транскрипции — полимеразной цепной реакции, рестрикционный анализ, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
