CC BY
212
Рис. 4. Динамика накопления авирулентных инсерционных мутантов B.pertussis в легких внутривенно и интраназально зараженных мышей в процессе развития экспериментальной инфекции.
Ромбами представлены точки на графике, соответствующие интраназаль-ному введению бактерий; квадратами — внутривенному введению. По оси абсцисс — сроки наблюдения (часы и дни), на оси ординат — ^ (N481).
Кунда Марина Сергеевна (Kunda Marina Sergeevna) — канд. биол. наук., ст. науч. сотр.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика; 1999.
2. Медкова А.Ю., Аляпкина Ю.С., Синяшина Л.Н. Мол. генетика, микробиология, вирусология. 2010; 4: 9—13.
3. Медкова А.Ю., Аляпкина Ю.С., Синяшина Л.Н. Детские инфекции. 2010; 4: 19—22.
4. MедковаА.Ю. Автореф. дис. канд. мед. наук. М.; 2013.
5. СиняшинН. И. Доклады АН УзССР. 1986; 7: 55—6.
6. Синяшина Л.Н., Воронцов В.В, Сёмин Е.Г. и др. Генетика. 2005; 12: 1—9.
7. Assessment and Monitoring Team Vaccine. WHO-Recommended Standards for Surveillance of Selected Vaccine-Preventable Diseases. Geneva, Switzerland: Department of Vaccines and Biologicals, World Health Organization; 2003.
8. Bidet P., Liguori S., De Lauzanne A. J. Clin. Microbiol. 2008; 46: 3636—8.
9. BisgardK.M., Pascual F.B., Ehresmann K.R. et al. Pediatr. Infect. Dis. J. 2004; 23: 985—9.
10. Bonacorsi S., Farnoux C. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(10): 3830—2.
11. Graeff-WohllebenH., DeppischH, GrossR. Mol. Gen. Genet. 1995; 247: 86—94.
12. Mattoo S., Cherry J.D. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18: 326—82.
13. MooiF.R. Infect. Genet. Evol. 2010; 10: 36—49.
14. Otsuka Nao, Han Hyun-Ja, Toyoizumi-Ajisaka Hiromi et al. PLoS One. 2012; 7: e31985.
15. QueenanA.M., CassidayP. K. EvangelistaA. N. Engl. J. Med. 2013; 368: 583—4.
16. Raymond J., Armengaud J.B., Cosnes-Lambe C. et al. Clin. Microbiol. Infect. 2007; 13: 172—5.
17. Stibitz S., Aaronson W., Monack D., Falkow S. Nature. 1989; 338: 226—9.
18. Stibitz S. J. Bacteriol. 1998; 180: 4963—6.
19. WendelboeA.M., NjamkepoE., BourillonA. et al. Pediatr. Infect. Dis. J. 2007; 26(4): 293—9.
20. WoodN., MclntgreP. Pediatr. Respir. Rev. 2008; 9: 201—12.
21. World Health Organization. Biolo. Standart. — 2011. — 2158.
Поступила 01.04.13
ACCUMULATION OF THE BVG- BORDETELLA PERTUSSIS AVIRULENT MUTANTS IN THE PROCESS OF EXPERIMENTAL WHOOPING COUGH IN MICE
A. Yu. Medkova, L. N. Sinyashina, Yu. P. Rumyantseva, O. L. Voronina, M. S. Kunda, and G. I. Karataev
Gamaleya Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow,
Russia
The duration of the persistence and dynamics of accumulation of insertion bvg- Bordetella pertussis mutants were studied in lungs of laboratory mice after intranasal and intravenous challenge by virulent bacteria of the causative agent of whooping cough. The capability of the virulent B. pertussis bacteria to long-term persistence in the body of mice was tested. Using the real-time PCR approximately hundred genome equivalents of the B. pertussis DNA were detected in lungs of mice in two months after infection regardless of the way of challenge. Using the bacterial test bacteria were identified during only four weeks after challenge. Bvg- B. pertussis avirulent mutants were accumulated for the infection time. The percentage of the avirulent bacteria in the B. pertussis population reached 50% in 7—9 weeks after challenge. The obtained results show that the laboratory mice can be used for study of the B. pertussis insertion mutant formation dynamics in vivo and confirm the hypothesis about insertional bvg-B. pertussis virulent mutants accumulation during development of pertussis infection in human.
Key words: causative agent of whooping cough, persistence, insertional mutants, virulence
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 616.98:578.833.28]-078.33:577.21.083.2
С. В. Серегин1, В. С. Петров1, М. П. Гришаев2
методы диагностики крымской-конго геморрагической лихорадки
Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора, п. Кольцово, Новосибирская обл., 630559; 2Закрытое акционерное общество "Вектор-Бест", п. Кольцово,
Новосибирская обл., 630559
Приведена краткая характеристика различных методов диагностики Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ). Показано, что создание иммуноферментных диагностикумов (ИФА-тест-систем) для выявления антител к вирусу ККГЛ на основе рекомбинантных антигенов, полученных в клетках Е.соН, сопряжено с рядом существенных сложностей, которые еще предстоит преодолеть. Представлены оригинальные результаты разработки и внедрения в производство тест-системы для выявления РНК вируса ККГЛ, основанной на проведении реакции обратной транскрипции и двухраундовой полимеразной цепной реакции. Пред-
ложена схема скрининга образцов, потенциально содержащих вирус ККГЛ, с использованием рестрикционного анализа ампли-конов на основе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с целью их предварительного генотипирования.
Ключевые слова: вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки (ККГЛ), диагностика ККГЛ, рекомбинантные вирусные белки, иммуноферментный анализ, метод обратной транскрипции — полимеразной цепной реакции, рестрикционный анализ, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов
Крымская-Конго геморрагическая лихорадка (ККГЛ) представляет собой острое инфекционное вирусное заболевание, сопровождающееся интоксикационным и геморрагическим синдромом с высокой летальностью (до 50%). Вирус ККГЛ относится к семейству Bunyaviridae, роду Ытт^ги^. Инфицирование человека происходит через укусы иксодовых клещей, при прямом контакте с больными и через кровь инфицированных животных. Лабораторная диагностика ККГЛ основана на выявлении вируса и (или) его структурных компонентов, а также вирусо-специфических антител. Принято выделять 3 группы методов: вирусологические, иммунологические и мо-лекулярно-генетические [5].
Главным вирусологическим методом является выделение вируса ККГЛ из клинического материала. Для этого исследователи используют метод интраце-ребрального заражения новорожденных белых мышей или крыс биологическим материалом, а также метод адаптации вируса, зачастую весьма длительной, к некоторым культурам клеток животного происхождения [2, 5, 12]. Безусловно, данные методы являются наиболее достоверными, однако они же наиболее дорогостоящие и длительные, поэтому не могут конкурировать с методами экспресс-анализа, которые крайне необходимы для мониторинга природных очагов инфекции [3, 5]. Кроме того, вирусологические исследования требуют специально оборудованных лабораторных помещений с высокой степенью биологической защиты и высококвалифицированного персонала, что ограничивает использование этих методов несколькими лабораториями в стране.
Иммунологические методы в лабораторной диагностике ККГЛ используют для выявления антител и антигенов в биологических образцах — сыворотках крови людей и животных, их тканях и органах, а также для характеристики полученных штаммов вируса ККГЛ. Для этого чаще всего используют электронно-микроскопические исследования, реакцию связывания комплемента (РСК), реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) и иммуноферментный анализ (ИФА). Для выявления антигена в настоящее время применяют метод флюоресцирующих антител (МФА), РНГА и ИФА. Следует отметить, что сравнительный анализ современных и классических серологических методов показал, что по чувствительности ИФА существенно превосходит классические серологические тесты [1, 13].
В последнее время для диагностики ККГЛ и генетической характеристики полученных изолятов и выделенных штаммов применяют молекулярно-ге-нетические методы, основанные на проведении реакции обратной транскрипции с последующей полиме-разной цепной реакцией — ОТ-ПЦР [12, 22, 23, 33]. Данный метод позволяет выявлять вирусную РНК в течение первых дней заболевания, когда серологические методы не могут дать положительного результата, поскольку иммунный ответ в должной степени еще не сформирован [4, 12]. Более того, данный метод позволяет провести предварительное генотипирова-ние биовариантов вируса путем прямого определения нуклеотидной последовательности полученных ПЦР-фрагментов его генома, при условии, что выбранный район позволяет это адекватно осуществить.
Таким образом, нам представляется крайне актуальной задачей усовершенствование и разработка новых методов экспресс-диагностики ККГЛ, а именно ИФА-диагностики, методов, основанных на использовании ОТ-ПЦР и рестрикционного анализа, что и явилось целью настоящей работы, в которой представлен обзор опубликованных нами ранее результатов, дополненный новыми оригинальными данными в рамках поставленной цели.
Материалы и методы
Для множественного выравнивания нуклеотидных и аминокислотных последовательностей различных штаммов и изолятов вируса ККГЛ использовали программу ClustalX v.1.8 [29]. Все генно-инженерные манипуляции осуществляли по методикам, описанным в сборнике [6]. Дизайн олигонуклеотидных праймеров и подбор условий проведения ПЦР проводили с использованием компьютерной программы OLIGO [24]. Структура праймеров для ОТ-ПЦР-диагностики и подробное описание условий реакций описаны ранее [10].
Результаты и обсуждение
Одним из главных компонентов ИФА-диагности-кумов, предназначенных для выявления антител к любому инфекционному агенту, является его антиген. Обычно используется два вида антигенов: лизатный либо рекомбинантный. Лизатный антиген, как правило, обладает высокой чувствительностью и достаточной специфичностью [9], однако, как мы упоминали выше, получение подобного антигена в случае вируса ККГЛ связано с работами в условиях повышенной безопасности и сопряжено с риском заражения персонала. Поэтому разработка подходов к получению антигенов вируса ККГЛ в рекомбинантном виде — одно из приоритетных направлений в плане решения поставленной задачи. Самым надежным, безопасным и относительно дешевым способом получения реком-бинантных антигенов опасных патогенов является получение продуктов экспрессии их генов в гетеро-логичных системах, самой простой из которых следует признать бактериальную систему экспрессии, в частности, с использованием различных штаммов Escherichia coli.
Известно, что инфицированный организм вырабатывает большое количество антител к нуклеокапсид-ному (N) белку вируса ККГЛ (кодируется S-сегментом генома), в меньшей степени — к поверхностному гли-копротеину G1, и совсем в незначительной — к другому гликопротеину G2 (кодируются М-сегментом) [30]. Поэтому выбор генов для экспрессии в клетках E.coli не вызывал особых сомнений.
Для оценки антигенных свойств N-белка нами была проведена серия экспериментов по его экспрессии в различных вариантах. В качестве матрицы мы использовали две рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты кДНК S-сегмента генома вируса ККГЛ китайского штамма С68031 [18], любезно предоставленные доктором А. Марриоттом (Marriott A.C.). Были рассчитаны и синтезированы праймеры, позволяющие получить и клонировать в различных экспрессионных векторах как фрагмент ДНК, кодирующий 1—359 а.к. N-белка, так и полный N-белок (1—482 а.к.).
В результате была получена серия рекомбинант-ных плазмид, направляющих в клетках E.coli синтез следующих рекомбинантных белков: вышеназванно-
го антигеннозначимого фрагмента Ж-белка как в чистом виде, так и в виде слитых белков с глутатион-S-трансферазой (GST) Schistosoma japonicum и Р-галактозидазой E.coli, а также полного Ж-белка, слитого с Ж-концевым фрагментом Р-галактозидазы.
Проведенные эксперименты по взаимодействию рекомбинантных вариантов вирусного Ж-белка с сыворотками больных ККГЛ в ИФА показали невысокую специфичность и чувствительность. Лучшие результаты были получены при использовании в качестве антигена рекомбинантного белка, состоящего из Ж-концевого фрагмента Р-галактозидазы E.coli (около 40 кД) и полного N-белка вируса ККГЛ, экспрессиру-емого в составе модифицированного вектора pUBEX. Учитывая вышеназванное обстоятельство, а также обнаруженную вариабельность в аминокислотной последовательности нуклеокапсидного белка вируса ККГЛ между штаммами, изолированными в Азии и европейской части России [8], мы получили аналогичный рекомбинантный белок штамма STV/HU29223, изолированного в Ставрополе от больного. Аналогичным образом была сконструирована плазмида pG1, направляющая в клетках E.coli синтез протяженного антигеннозначимого (1510—1670 а.к.) фрагмента оболочечного белка-предшественника (входит в состав зрелого белка G1) вируса ККГЛ штамма STV/TI28985 (изолирован от клеща).
На рис. 1 представлена структура рекомбинантной плазмиды pN1. Все другие описанные здесь плазми-ды имеют аналогичную структуру, за исключением того, что по участкам рестрикции BglII/SalI встроен соответствующий ген или фрагмент гена (N2, G1).
Получение рекомбинантных белков вируса ККГЛ осуществляли в клетках E.coli RRI, трансформированных одной из целевых плазмид (pN1, pN2, pG1) путем активации термоиндуцибельного промотора P(R) фага к сдвигом температуры культивирования с 30°С до 42°С. Было установлено, что все рекомбинантные белки накапливаются в составе нерастворимого осадка телец включений, который последовательно промывали растворами 2М и 4М мочевины, растворяли в 8М мочевине и стандартизовали по концентрации — 0,5 мг/мл. В качестве примера на рис. 2 приведена электрофореграмма некоторых фракций полученных рекомбинантных белков вируса ККГЛ.
Далее нами была проведена оценка антигенных свойств методом ИФА следующих полученных нами рекомбинантных белков: N1 — полный N-белок китайского штамма С68031; N2 — полный N-белок штамма STV/HU29223 (Россия); G1 — 1510—1670 а.к. — фрагмент оболочечного белка-предшественника штамма STV/TI28985 (Россия), входящего в состав гликопротеина G1. В качестве отрицательного контрольного антигена был взят рекомбинантный белок p24 ВИЧ-1, полученный в той же системе экспрессии и выделенный из клеточной биомассы аналогичным образом. В эксперименте проводили определение антител класса IgG с использованием 16 положительных сывороток на ККГЛ. Белок N1 выявил как положительные 4 из них, белок N2 — 5, G1 — 2 (для p24 — 1). Для определения специфичности мы взяли случайную выборку из сывороток 48 здоровых доноров. Из них по 3 сыворотки оказались ложно-положительными для всех белков вируса ККГЛ (для
р24 — 1). Положительное взаимодействие (+) нами определялось по формуле: OD+/OD" > 2, где OD+ — значение оптической плотности при А490 для тестируемой сыворотки, OD" — среднее значение оптической плотности 3 контрольных отрицательных сывороток.
Таким образом, полученный рекомбинантный белок G1 следует признать неантигенным, то есть неспособным выявлять антитела к вирусу ККГЛ в сыворотках больных методом ИФА. Вероятно, антигенные свойства белка в значительной степени модулируются в результате его гликозилирования, отсутствующего в бактериальной клетке, а также определяются его конформационными эпитопами, формирующимися на поверхности вирусных частиц.
Несколько лучшие результаты были получены при использовании белка N причем белки азиатского и российского штаммов отличались по взаимодействию с сыворотками больных ККГЛ, однако крайне низкая чувствительность (менее 30%) при недостаточном показателе специфичности (около 90%) ставит под сомнение возможность создания диагностической тест-системы для выявления антител к вирусу ККГЛ методом ИФА с использованием полученных рекомбинантных вирусных белков в качестве антигенов. Для того чтобы получить целевой антиген более высокой степени очистки, мы в плаз-миде организовали перед кодоном терминации трансляции так называемый "гистидиновый хвост", состоящий из 6 кодонов гистидина. Это позволило нам провести аффинную очистку белка на №-ЫТА-агарозе, однако заметного повышения антигенных свойств обнаружить не удалось. Тот факт, что реком-бинантный ^белок, полученный в бакуловирусной системе экспрессии, либо в других эукариотических системах, обладает достаточными антигенными свойствами для выявления антител к вирусу ККГЛ [18, 25, 26, 28], может свидетельствовать о том, что конформационно он близок нативному вирусному белку. Вполне возможно, что основные антигенные детерминанты имеют конформационную структуру, которая нарушается при солюбилизации белка в растворе мочевины, а процесс ренатурации и рефол-динга не может в должной степени ее восстановить. Ведь в самом деле основное преимущество эукари-отических систем экспрессии перед прокариотиче-скими состоит в возможности получать гликопроте-ины благодаря наличию системы гликозилирования белков, тогда как нативный вирусный ^белок не является гликопротеином.
По-видимому, для надежной экспресс-диагностики ККГЛ необходимо разрабатывать альтернативные подходы для создания диагностической тест-системы. Одним из наиболее перспективных из них нам представляется ОТ-ПЦР-диагностика. Данный метод применяется для диагностики ККГЛ уже более 10 лет во многих странах мира [4, 7, 12, 22, 23, 27, 33], однако быстрое накопление результатов изучения генетического разнообразия вируса неизбежно ставит задачи совершенствования существующих и создания новых тест-систем на основе ОТ-ПЦР. Принципиально предложенные системы детекции можно разделить на однораундовые (используется одна пара праймеров) и двухраундовые (используют две пары праймеров, причем вторая пара является вложенной (полностью
LAMBDA P(R)
1 t Sail
Рис. 1. Структура рекомбинантной плазмиды pN1.
или частично) внутрь ПЦР-фрагмента первого раунда). Каждый подход имеет свои преимущества и недостатки, которые определяются прежде всего теми целями, которые разработчики считают приоритетными. Для нас главными целями при разработке являлись максимальные чувствительность и специфичность, а также информативность амплифицируемого фрагмента, т.е. возможность провести предварительное генотипирование по результатам его прямого сек-венирования.
Таким образом, предложенный нами метод основан на использовании двух пар праймеров, фланкирующих консервативный кодирующий участок S-сегмента РНК вируса ККГЛ (рис. 3), при проведении двухраундовой амплификации. Показано, что в условиях двухраундовой амплификации повышаются специфичность и чувствительность определения РНК вируса ККГЛ в пробах различного происхождения. Специфичность реакции подтверждали прямым секвенированием ПЦР-продуктов, по результатам которого проводили надежное генотипирование изо-лятов вируса ККГЛ [14, 23, 33]. В результате нами был получен патент РФ на изобретение [10], и тест-система была успешно внедрена в производство.
При скрининге образцов на наличие генетического материала вируса ККГЛ необходимо быть уверенным, что в каждой пробирке ПЦР проходит адекватно. Для этого обычно применяют так называемый внутренний контроль реакции, который представляет собой альтернативную матрицу (ДНК для ПЦР или РНК для ОТ-ПЦР), позволяющую получить ПЦР-фрагмент с использованием тех же специфических праймеров, но отличающийся по длине от целевого фрагмента. Такая матрица вносится в исследуемый образец в предельном разведении, позволяющем детектировать появление контрольного фрагмента.
Для этой цели нами сконструирована рекомби-нантная плазмида, позволяющая получить ПЦР-фрагмент длиной 475 п.н. при использовании прай-меров серии SP в двухраундовой реакции амплификации, тогда как целевой специфический фрагмент имеет длину 350 п.н. Эта генетическая конструкция получена путем встройки Я/пйШ-фрагмента ДНК фага X длиной 125 п.н. по Я/пйШ-участку рестрикции в кДНК S-сегмента вируса ККГЛ штамм
1 2 3 4 5
Рис. 2. Очистка рекомбинантных белков вируса ККГЛ. Электро-
фореграмма. 12% SDS-PAGE. 1 — N1 (8M мочевина); 2 — N2 (8M мочевина); 3 — маркерные белки: 97,4 кД, 66,2 кД, 45,0 кД, 31,0 кД, 21,5 кД; 4 — G1 (4M мочевина); 5 — G1 (8M мочевина). Целевые белки представлены мажорными полосами в каждой из дорожек геля: около 94 кД для N1 и N2 (дорожки 1 и 2), около 57 кД для G1 (дорожки 4 и 5).
UZBEK/TI10145, ранее клонированного в векторе pGEM-T [8]. В результате была получена целевая плазмида, названная нами pSL Данная плазми-да может применяться как внутренний контроль ПЦР, так и в качестве положительного контроля, позволяющего легко и просто выявлять возможные случаи контаминации исследуемых образцов, что значительно облегчает правильную интерпретацию результатов исследования. На рис. 4 приведен пример использования полученной плазмиды, из которого видно, что чувствительность разработанной нами тест-системы составляет не менее 100 молекул ДНК в реакционной смеси (25 мкл) первого раунда ПЦР. При необходимости использовать данную конструкцию на стадии синтеза кДНК (стадия обратной транскрипции) можно получить целевой РНК-транскрипт in vitro под контролем сильных промоторов РНК-полимераз фагов Т7 и (или) SP6, которые в плазмиде pSA, фланкируют вставку S-сегмента вируса ККГЛ с фрагментом ДНК фага L Нами была поставлена также следующая задача: провести подробный анализ полного генома всех известных штаммов и изолятов вируса ККГЛ и выбрать фрагмент любого геномного сегмента, который позволил бы предварительно генотипировать биоварианты вируса при помощи простого рестрикционного анализа. Поставленную задачу удалось решить лишь после изучения нуклеотидной последовательности L-сегмента генома различных штаммов вируса [19— 21]. Результаты проведенного исследования подробно описаны нами в работе [11], в которой предложен простой, быстрый, не требующий секвенирования на первом этапе, метод скрининга образцов, потенци-
Рис. 3. Схема расположения праймеров для амплификации участка Б-сегмента генома вируса ККГЛ. Цифрами обозначены позиции 5'-концевых нуклеотидов праймеров. Структура всех праймеров и условия проведения ОТ-ПЦР приведены в [10].
ально содержащих вирус ККГЛ, с использованием рестрикционного анализа ампликонов с целью дифференциации генотипов вируса ККГЛ, характерных для территории Европы, от других генотипов. Данный метод основан на изучении полиморфизма длин рестрикционных фрагментов целевого ампликона. Для этого предложено использовать ПЦР-фрагмент L-сегмента генома вируса, включающий вариабельный район, и эндонуклеазы рестрикции А1и1 и ИаеШ. Предложенная схема скрининга образцов (рис. 5), потенциально содержащих вирус ККГЛ, может помочь исследователям в проведении мониторинга с целью выявления нехарактерных генотипических вариантов
Исследуемый образец 1
Выделение РНК
I
ОТ-ПЦР с праймерами \ZFnew и \ZRnew
i
Электрофорез в 1,5% агарозном геле
Отсутствие фрагмента 390 п.н.-не ККГЛ
Наличие фрагмента~390 п.н.-КЛГЛ
Рестрикция А1и 1~390 п.н.
Иная рестрикционная картина-Нетипично для генотипа Европа 1
Секвенирование, филогенетический анализ
Детекция фрагментов 215, 80, 80 п.н. (либо 215, 80, 70 п.н. или 220, 80, 70 п.н.)
Рестрикция Нае\\\ фрагмента 390 п.н.
Детекция фрагментов 245, 145 п.н.
Иная рестрикционная картина-Нетипично для генотипа Европа 1
Рис. 5. Схема генотипирования вируса ККГЛ, позволяющая дифференцировать вирус основного европейского генотипа (Европа 1) от других, нехарактерных для Европы, генетических вариантов вируса. Подробное описание и пояснения приведены в [11].
Рис. 4. Электрофореграмма ПЦР-продуктов, полученных в двухраундовой реакции при использовании набора праймеров
серии БР и различных матриц. 1,5% агарозный гель. Дорожки: 1 — отрицательный контроль реакции ОТ-ПЦР (без матрицы); 2 и 3 — матрица рБХ в количестве 10±5 и 100±50 молекул плазмидной ДНК в реакционной смеси (25 мкл) на стадии 1-го раунда ПЦР, соответственно. Дорожка 4 — маркер длин фрагментов ДНК
(гидролизат плазмиды pUC19IMsp I); 5 и 6 — матрицей служила РНК антиген-положительного пула клещей с добавлением 1000±500 молекул
плазмидной ДНК рБХ в реакционную смесь (25 мкл) на стадии 1-го раунда ПЦР либо без добавления, соответственно; 7 — положительный (вируссодержащий) контрольный лабораторный образец.
вируса на территории Российской Федерации и других европейских стран.
Нельзя не упомянуть о разработке тест-систем нового поколения, основанных на проведении ПЦР в режиме реального времени [16, 17, 31, 32]. Несомненно, такие диагностикумы будут все более востребованы, поскольку имеют огромное преимущество перед традиционными в виде возможности точной количественной оценки генетического материала возбудителя в исследуемых образцах (вирусная нагрузка), однако с их помощью нельзя решить все задачи, поставленные нами в данной работе.
Таким образом, нами разработана, всесторонне проверена и внедрена в производство ОТ-ПЦР-тест-система для выявления РНК вируса ККГЛ. Предложена схема скрининга образцов, потенциально содержащих вирус ККГЛ, с использованием рестрикционного анализа ампликонов с целью их предварительного генотипирования. Показано также, что создание ИФА-тест-систем для выявления антител к вирусу ККГЛ на основе рекомбинантных антигенов, полученных в клетках Е.соИ, сопряжено с рядом существенных сложностей, которые еще предстоит преодолеть.
Авторы глубоко признательны сотрудникам ЗАО "Вектор-Бест" М.А. Смердовой, О.Н. Гришаевой, В.В. Распопину за большую помощь в работе по
тестированию образцов и внедрению в производство ОТ-ПЦР-тест-системы, а также всем нашим соавторам по предыдущим работам. Особую благодарность авторы выражают сотрудникам бывшего отдела биохимии вирусов ГНЦ ВБ "Вектор" О.И. Вышемирскому, И.Д. Петровой, Л.Н. Яшиной, С.С. Серегину, И.Ю. Тумановой, Г.И. Тюнни-кову, И.И. Кузиной, Н.В. Якименко.
Сведения об авторах:
Серегин Сергей Викторович — ст. науч. сотр., канд. биол. наук; ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора, отдел "Коллекция микроорганизмов", 630559, п. Кольцово, Новосибирская обл., e-mail: svseregin@ngs.ru, seregin@vector.nsc.ru.
Петров Владимир Семенович — зав. лаб., канд. биол. наук; ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора, отдел "Коллекция микроорганизмов", 630559, п. Кольцово, Новосибирская обл., e-mail: petrovvs@vector.nsc.ru.
Гришаев Михаил Петрович — директор НИИ средств диагностики ЗАО "Вектор-Бест", канд. химических наук; 630559, п. Кольцово, Новосибирская обл., e-mail: grishaev@vector-best.ru
ЛИТЕРАТУРА
1. Батырова Б. А., Юсупова С. М., Омарова Б. К. и др. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005; № 4 (приложение). — С. 32—34.
2. Бутенко А. М. Материалы по изучению этиологии, лабораторной диагностики и иммунологии КГЛ: вопросы экологии вируса-возбудителя. Автореф. дис... д-ра биол. наук. М.; 1970.
3. Вышемирский О. И., Нешров В. А., Бутенко А. М. и др. Вопросы вирусологии. 2001; 4: 21—2.
4. Карань Л. С., Шипулин Г. А., Платонов А. Е. Клиническая лабораторная диагностика. 2003; 10: 50—4.
5. Львов Д. К., Клименко С. М., Гайдамович С. Я. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: Медицина; 1989: 236—9.
6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1984.
7. Онищенко Г. Г., Туманова И. Ю., Вышемирский О. И. и др. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005; 1: 27—31.
8. Петрова И. Д., Серегин С. В., Петров В. С. и др. Вопросы вирусологии. 2003; 2: 8—12.
9. Рубин С. Г., Бутенко А. М., Заводова Т. И. и др. В кн.: Материалы III областной научно-практической конференции в Ростове-на-Дону. Ростов н/Д.; 1970: 25—9.
10. Серегин С. В., Петров В. С., Туманова И. Ю и др. Набор оли-гонуклеотидных праймеров для идентификации РНК вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки в полевых и клинических образцах. Патент 2294963 РФ, приоритет от 03.03.2005, выдан 10.03.2007.
11. Серегин С. В., Серегин С. С., Петров В. С. и др. Вопросы вирусологии. 2011; 1: 30—3.
12. Смирнова С. Е. Крымская-Конго геморрагическая лихорадка: этиология, эпидемиология и лабораторная диагностика: Авто-реф. дис. д-ра мед. наук. М.; 2003.
13. Тишкова Ф. Х. Диагностика буньявирусных инфекций и идентификация буньявирусов в Таджикистане (1991—1995 гг.): Автореф. дис. канд. биол. наук. М.; 1996.
14. Туманова И. Ю., Серегин С. В., Вышемирский, О. И. и др. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2006; 2: 36—41.
15. Burt F. J., Leman P. A., Smith J. F., SwanepoelR. J. Virol. Methods. 1998; 70: 129—37.
16. Duh D, Saksida A., PetrovecM. et al. J. Virol. Methods. 2006; 133: 175—9.
17. Garrison A. R., Alakbarova S., Kulesh D. A. et al. Am. J. Trop. Med. Hyg. 2007; 77: 514—20.
18. Marriott A. C., Polyzoni T., Antoniadis A., Nuttall P. A. J. Gen. Virol. 1994; 75: 2157—61.
19. Meissner J. D., Seregin S. S., Seregin S. V. et al. Arch. Virol. 2006; 151: 465—75.
20. Meissner J. D., Seregin S. S., Seregin S. V. et al. J. Med. Virol. 2006; 78: 223—8.
21. Meissner J. D., Seregin S. S., Seregin S. V. et al. Virus Genes. 2006; 33: 87—93.
22. Papa A., Ma B., Kouidou S. et al. Emerg. Infect. Dis. 2002; 8: 50—3.
23. RodriguezL .L., Maupin G. O., KsiazekT. G. et al. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1997; 57: 512—8.
24. Rychlik W., RhoadsR. E. Nucl. Acids Res. 1989; 17: 8543—51.
25. Saijo M., Tang Q., Niikura M. et al. J. Clin. Microbiol. 2002; 40: 1587—91.
26. SaijoM., Tang Q., ShimayiB. et al. J. Med. Virol. 2005; 75: 295—9.
27. Schwarz T. F., NsanzeH., LongsonM. et al. Am. J. Trop. Med. Hyg. 1996; 55: 190—6.
28. Tang Q., Saijo M., Yuzhen Y. et al. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003; 10: 489—91.
29. Thompson J. D., Gibson T. J., Plewniak F. et al. Nucl. Acids Res. 1997; 24: 4876—82.
30. Whitehouse C. A. Antiviral Res. 2004; 64: 145—60.
31. Wolfel R., Paweska J. T., Petersen N. et al. Emerg. Infect. Dis. 2007; 13: 1097—100.
32. YaparM., AydoganH., PahsaA. et al. Japan J. Infect. Dis. 2005; 58: 58—362.
33. YashinaL., Vyshemirskii O., Seregin S. et al. J. Clin. Microbiol. 2003; 41: 860—2.
Поступила 15.10.12
METHODS FOR THE CRIMEAN-CONGO HEMORRHAGE FEVER DIAGNOSIS
S. V. SereginJ, V. S. Petrov1, and M. P. Grishaev2
1 State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector", Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare, Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia; 2 Joint Stock Company "Vector-Best", Koltsovo, Novosibirsk Region, Russia
Several distinct methods currently used for the Crimean-Congo Hemorrhage Fever diagnosis (CCHF) were suggested in this work. We demonstrated that the ELISA-based diagnostic kits, which are based on CCHFV recombinant antigens produced in E. coli cells, still possessed a few substantial shortcomings, which are yet to be addressed. In this work we presented the development of the unique CCHFV detection system fully based on reverse transcription -nested two-step polymerase chain reaction (RT-PCR). Our RT-PCR-based diagnostic kit for the CCHFV detection is now commercially available. We also developed a simple screening method for the samples, potentially containing CCHFV, which is based on restriction fragment length polymorphism (RFLP) amplicons analysis and allows for preliminary genotyping of the CCHFV isolates.
Key words: Crimean-Congo Hemorrhage Fever virus (CCHFV), CCHFV diagnosis, recombinant viral proteins, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), reverse transcription -polymerase chain reaction (RT-PCR), restriction fragment length polymorphism (RFLP)
