CC BY
57
Распространенность стертых форм коклюшл и анализ фазовых состояний
БАктЕрий BORDETELLA PERTUSSIS
А. Ю. Медкова1, Ю. С. Аляпкинд2, Л. Н. Синяшинд1, И. П. Амелина1, Я. И. Алексеев2, Г. И. Каратаев1, А. Г. Боковой3
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН1, ЗАО «СИНТОЛ»2, ФГУ ЦКБП УД Президента РФ3, Москва
Методом ПЦР и ПЦР РВ идентифицированы бактерии B. pertussis, вызывающие атипичные формы коклюша, выявлено носитель-ство возбудителя у «практически здоровых» детей и взрослых. Установлено, что популяции бактерий B. pertussis у больных типичной формой коклюша состояли из бактерий в вирулентном состоянии с нативной структурой оперона bvgAS. Популяция бактерий у больных со стертой клинической картиной коклюша представлена как вирулентными, так и авирулентными бактериями B. pertussis, содержащими инсерцию IS-элемента в опероне вирулентности. Бактерии B. pertussis, выявленные у «практически здоровых» детей и взрослых, почти полностью находились в авирулентном состоянии. Ключевые слова: коклюш, фазовые состояния, носительство
УДК 616.921.8
Контактная информация: Медкова Алиса Юрьевна — м.н.с. лаборатории патогенных микроорганизмов НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН; 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18; 8(499) 193-61-90
The PrevaLence of SubcunicaL Forms of Pertussis
and Analysis of Phase States of Bacteria Bordetella pertussis
A. Yu. Medkova1, Yu. S. Alyapkina2, L. N. Sinyashina1, I. P. Ameuna1, Ya. I. Alekseev2, G. I. Karataev1, A. G. Bokovoy3
Research Institute of Epidemiology and Microbiology named after N.F. Gamaleya of Russian Academy of Medical Sciences, Moscow 1
Closed Joint-Stock Company «SINTOL»2, Central Clinical Hospital of the Administrative Department of the President of the Russian Federation3
Bacteria B. pertussis causing atypical forms of pertussis were identified by PCR and Real-Time PCR methods in «apparently healthy» children and adults in carrier state. It was detected that bacterial populations of B. pertussis at patients with typical form of pertussis consisted of virulent bacteria with native structure of operon bvgAS. Bacterial population in patients with subclinical form of pertussis consists of both virulent and avirulent bacteria B. pertussis containing insertion of IS-element in virulence operon. The majority of the bacteria B. pertussis identified in «apparently healthy» children and adults were in avirulent state. Key words: pertussis, phase state, carrier state
Коклюш — антропонозное респираторное ин- bvg мутанты обнаружены нами в популяциях бактерий фекционное заболевание, вызываемое грамотрица- B. pertussis, выращенных in vitro, а также in vivo: у больных тельными бактериями Bordetella pertussis, характери- коклюшем, различными инфекционными заболеваниями зующееся приступообразным судорожным кашлем и дыхательных путей и у «практически здоровых» детей и высокой летальностью у детей раннего возраста. Не- взрослых. Предполагается, что в результате фазовой вари-смотря на проводимую в разных странах с начала абельности бактерий B. padu^'s индуцир°ванн°й переме-1950-х годов прошлого столетия массовую противокок- щением |S481 и Ы002 в оперон bvgASk***, происходит люшную вакцинацию, элиминации возбудителя среди распространение бактерий B. peftussis в различных фаз<э-населения не происходит. На фоне гиподиагностики _
коклюша ежегодно в мире регистрируется более * фазовые варианты, или фазовые состояния бактерий 48,5 миллионов случаев заболевания разной степени В. pertussis - бактерии В. pertussis с рс^ыми степенью виру-
тяжести, из которых около 300 000 заканчиваются ле-
лентности, формой колоний и способностью к гемолизу эритроцитов, выделенные на разных стадиях заболевания при экспе-
рт oi D -----' ----------- 1--------- — -----------------------г
тальным исходом 2J. Ь последние годы отмечается риментальном заражении лабораторных животных и при куль значительный рост числа лабораторно подтвержденных тивировании in vitro.
случаев коклюша среди подростков и взрослых [3], рас-
Мобильные генетические элементы (МГЭ) — нуклеотид-
пространение стертых форм заболевания, выявление ная последовательность (участок ДНК), способная изменять носительства бактерий B. pertussis [4]. свое положение в ген°ме. М1"Э классифицируют на 3 груты:
МГЭ с длинными инвертированными повторами, с терминальными повторами и без таких повторов. Также среди МГЭ
Экспрессия абсолютного большинства детерминант вирулентности B. pertussis контролируется опероном различают IS-элементы и транспозоны.' bvgAS [5]. Нарушение структуры оперона bvgAS сопровождается изменением фазового состояния бактерий
IS-элементы, или инсерционные последовательности — мобильные генетические элементы длиной 700—1 800 п.н., как
B. pertussis*. Проведенные нами исследования показали, правило, не имеющие собственного выражения в фенотипе, хо-
что в результате перемещения мобильных генетических тя и могУ содержать открытую рамку считывания для 1 -2 белков, а также промотор, способный обеспечивать транскрипцию элементов (инсерционных последовательностей — IS-эле- ' мм»
последующего участка донорского гена; IS-элементы ограниче-
ментов ) в оперон bvgAS индуцируется переход бакте- ны короткими инвертированными концевыми повторами (10— рий в различные фазовые состояния [5]. Инсерционные 40 п.н.) и фланкированы прямыми повторами.
* *
вых состояниях, вызывающих стертые формы коклюша с персистенцией возбудителя и его носительством.
Целью настоящего исследования было изучение корреляции между распространенностью стертых форм коклюша и фазовыми состояниями бактерий B. pertussis, индуцированными перемещением /S-элементов в оперон вирулентности bvgAS.
Материалы и методы исследования
Взятие образцов проводили носоглоточными тампонами типа Dacron у больных с диагнозом коклюш, с острыми и хроническими респираторными инфекциями верхних и нижних дыхательных путей, с симптомом «длительный кашель», а также у «практически здоровых» детей и взрослых. Материал для анализов поступал из детского инфекционного отделения ФГУ ЦКБП УД Президента РФ, НЦЗД РАМН и ГУ НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН.
Для выделения ДНК B. pertussis методом ПЦР смывы с носоглоточных тампонов центрифугировали, последовательно обрабатывали раствором гуанидинтиоциана-та с применением магнитного сорбента фирмы «Prome-ga» США.
Для поиска инсерционных последовательностей IS481 и IS1002 в опероне bvgAS использовали тест-систему ПЦР РВ (ПЦР в режиме реального времени), разработанную совместно НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи РАМН и ЗАО «Синтол».
Микробиологическую идентификацию бактерий B. pertussis проводили в соответствии с инструкцией [6]. Выделенные культуры дополнительно изучали с помощью ПЦР и ПЦР РВ.
Результаты и их обсуждение
Исследования, проведенные нами в 1996 г. и 2006—2009 гг., выявили ДНК B. pertussis в клинических образцах обследованных детей и взрослых с диагнозом ОРВИ в 37% (1996 г.) и 50% (2006—2009 гг.) случаях, в 7,3% (1996 г.) и 8,3% (2006—2009 гг.) в образцах «практически здоровых» детей и взрослых, у 31% (2006—2008 гг.) «длительно кашляющих» детей и 78% (2006—2009 гг.) взрослых, контактировавших с больными детьми [7, 8]. Высокие показатели регистрации ДНК B. pertussis у детей с клиническим диагнозом ОРВИ сви-
**** Одной из причин вариабельности бактериальных геномов является наличие в них мобильных генетических элементов (МГЭ), обеспечивающих формирование псевдогенов, делеций, реверсий и перестановку протяженных фрагментов генома. В 1 988—1 990 гг. такие элементы были обнаружены и в геноме B. pertussis. Определение полной последовательности хромосом каждого из представителей B. pertussis, B. parapertussis и B. bronchiseptica, показало, что в хромосоме B. pertussis присутствуют последовательности IS481, IS 1002 и IS 1663, а в хромосоме B. parapertussis — IS 1001. Исследования, проведенные в институте НИИ ЭМ им Н.Ф. Гамалеи РАМН, показали, что МГЭ IS481, IS 1002 участвуют в формировании делеции, инверсий и способны перемещаться в оперон bvgAS, вызывая его инактивацию.
детельствовали о значительном распространении стертых форм коклюша на фоне лабораторной гиподиаг-ностики возбудителя (бактериологическим посевом клинический диагноз был подтвержден только в 30% случаев). В период с 1996 г. по 2006 г. выявление стертых форм коклюша при использовании метода ПЦР увеличилось в среднем на 13%. ДНК B. pertussis обнаружили у 78% «практически здоровых» детей и взрослых в семьях, где находились больные коклюшем, а также у контактировавших с больным коклюшем ребенком в детских лечебных и учебных учреждениях. ПЦР позволяет выявлять ДНК бактерий B. pertussis у больных, у которых коклюш протекает в атипичной форме (стертая, бессимптомная, транзиторное носительство), обнаруживая потенциальный источник возбудителя для наиболее восприимчивой к этой инфекции новорожденных и детей младшего возраста [9, 10].
Механизмы перестройки генома, способствующие переживанию бактерий B. pertussis в организме хозяина не известны. Результаты наших исследований позволили предположить, что переход бактерий в фазовые состояния происходит в результате обратимой инактивации генов вирулентности, вследствие перемещения в них IS-эле-ментов [11—13]. Авирулентные бактерии B. pertussis способны выживать во внешней среде и в эукариотических клетках. Соотношение количества вирулентных бактерий B. pertussis и бактерий в состоянии фазового перехода к а вирулентному, вероятно, и определяет тяжесть заболевания.
Для регистрации IS-элементов B. pertussis и событий перемещения IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS нами разработан метод ПЦР РВ и исследованы ПЦР-по-ложительные по ДНК B. pertussis образцы, взятые у больных с клиническим диагнозом коклюш, ОРВИ и другие острые и хронические респираторные инфекции и у «практически здоровых» детей и взрослых, контактировавших и не контактировавших с больными коклюшем (табл. 1). В анализ брали препараты ДНК B. pertussis, содержащие в 5 мкл раствора не менее 103 молекул ДНК человека, или те образцы ДНК, где обнаружили искомую инсерцию. Более 80% ПЦР-положительных образцов содержали требуемое количество копий ДНК человека, что подтвердило корректность и относительную стандартизацию методики взятия материала для анализа.
По результатам ПЦР РВ-исследования обследованных распределили на три группы (табл. 1). Первая группа (7 детей и 4 взрослых) пациентов, у которых обнаружено наибольшее количество копий ДНК B. pertussis — 106— 107 в 5 мкл образца. Относительное количество инсер-ций IS481 и IS1002 в cctagg сайт оперона bvgAS B. pertussis 5 X 10-5 и менее. Бактерии в популяции в подавляющем большинстве находились в вирулентном состоянии. Независимо от возраста и сопутствующих инфекций в этой группе наблюдали типичную клиническую картину коклюша. В 30% случаев клинический диагноз удалось подтвердить бактериологическим посевом (табл. 1). При повторном обследовании этих больных через 3 недели
Таблица 1. Анализ фазового состояния бактерий B. pertussis, выделенных от больных с различными диагнозами и от «практически здоровых» детей и взрослых
Группы обследованных пациентов Клинический диагноз Лабораторная диагностика коклюша
Метод ПЦР (% обнаруженной ДНК B. pertussis) Метод ПЦР-РВ Бактериологический метод
Абсолютное количество бактерий B. pertussis Относительное количество инсерций (N) % выявления бактерий B. pertussis % выявления других бактерий
N IS481 N IS1002
Первая группа Коклюш 100% 4-9 X Х106—107 2—7 X Х10-7—10-5 4—6 X X 10-5—10-4 ~ 30% ~ 15%: St. saprophyticus, St. epidermidis, Str. pneumoniae, St. aureus
Вторая группа Острые и хронические респираторные инфекции, «длительный кашель», «практически здоровые» взрослые* 60% 2-3 X Х104— 106—107 1,3—6,2 X X 10-3 10-2 < 1 5% >40%: St. epidermidis, Candida albicans, Str. pneumoniae, Str. viridans, Str. pyogenes, H. influenzae, Chi. pneumoniae, Klebsiella pneumoniae
Третья группа ОРВИ и смешанная бактериальная инфекция, «практические здоровые» взрослые** 50% 3—6 X X101 —104 1,0—1,6— 3 X 10-2 0—5% 0—5% >20%: P. mirabilis, Str. pneumoniae, Str. viridans, Candida albicans, St. aureus, E. faecium, Chi. pneumoniae, Klebsiella pneumoniae
* — контактировавшие с больными коклюшем; ** — контактировавшие и не контактировавшие с больными коклюшем
выявили 10-ти кратное увеличение доли инсерционных мутантов на фоне незначительного изменения количества ДНК B. pertussis, т.е. накопление бактерий в авирулент-ном состоянии. Относительное количество инсерций IS481 и IS 1002 у пациентов первой группы не отличалось.
Ко второй группе отнесли 13 обследованных (табл. 1), в образцах которых обнаружено 103—104 молекул ДНК B. pertussis, содержащих 0,1 — 1,0% IS-элемен-тов в опероне вирулентности bvgAS. Это пациенты с острыми и хроническими респираторными инфекциями верхних и нижних дыхательных путей, «длительно кашляющие» и «практически здоровые» взрослые и дети, члены семей, контактировавшие с больными коклюшем. Наибольший интерес представляла динамика накопления бактерий в авирулетном состоянии у взрослого пациента, обратившегося за консультацией по поводу уточнения причины длительного кашля, продолжавшегося более четырех недель. Микробиологическая идентификация клинического образца выявила B. pertussis, Str. viridians, Candida albicans. Методом ПЦР РВ выявили бактерии B. pertussis, 50% в авирулентном состоянии. При обследовании после курса антибиотикотерапии, было зарегистрировано увеличение количества ДНК B. pertussis в 100 раз, а инсерции IS481 в cctagg сайте оперона bvgAS регистрировались с меньшей частотой — 1 0-4. Ин-серция IS 1002 в опероне bvgAS обнаружена не была. Возможно, в результате проведенного курса антибиоти-котерапии произошло исключение IS- из cctagg сайта оперона bvgAS и переход значительной части популяции
бактерий в вирулентное состояние в связи с вероятной резистентностью B. pertussis к данному антибиотику.
Третью группу составили пациенты, у которых от 10 до 100% бактерий B. pertussis в популяции содержали инсерцию IS-элементов в опероне bvgAS. Суммарное число бактерий B. pertussis в 5 мкл образца колебалось от нескольких десятков до нескольких сотен. В эту группу вошли «практически здоровые» взрослые, контактировавшие и не контактировавшие с больными респираторными инфекциями. К этой группе отнесли также взрослую пациентку и ребенка с симптомом «длительный кашель», при повторном обследовании которых выявлено увеличение доли бактерий (с 1,4 до 90%) в авирулентном состоянии. Полученный результат указывает на то, что «длительный кашель» может быть следствием коклюша, протекающего в стертой форме. Подобное нарастание доли бактерий в авирулентном состоянии выявили и у больных типичной формой коклюша на поздних стадиях заболевания.
Заключение
Полученные нами данные подтверждают более широкое, чем принято считать, распространение возбудителя коклюша. Выявлены и проанализированы бактерии B. pertussis в различных фазовых состояниях, индуцирующие развитие стертых форм коклюша. Показана возможность носительства возбудителя в различных фазовых состояниях «практически здоровыми» детьми и взрослыми, особенно в семьях, где есть больной коклюшем ребенок. Установлена гетерогенность фазовых состояний популяции бактерий B. pertussis у больных типичной и стер-
той формами коклюша. Такие популяции содержали вирулентные bvg+ бактерии с нативной структурой опе-рона bvgAS и авирулентные bvg- мутанты, несущие IS-элементы в опероне вирулентности. Количество инсер-ционных авирулентных мутантов у больных типичной клинической картиной коклюша было незначительное, тогда как у больных стертой формой коклюша они преобладали. Почти все популяции бактерий B. pertussis, выявленные у «практически здоровых» детей и взрослых, находились в авирулентном состоянии.
Обнаружено характерное увеличение количества ин-серционных bvg-мутантов в динамике развития инфекционного процесса. Переход бактерий B. pertussis из вирулентной фазы в а вирулентную, по-видимому, приводит возбудитель к персистенции и его носительству в иммуно-резистентном макроорганизме и формированию исключительно антропонозного источника бактерий B. pertussis, в первую очередь, для наиболее уязвимых новорожденных и детей в возрасте до одного года.
Дальнейшее изучение факторов, влияющих на частоту инсерций в опероне вирулентности, необходимо для разработки методов, регулирующих транспозицию IS-элемен-тов в хромосоме B.pertussis, например, лекарственными препаратами направленного действия (таргетные препараты), вакцинами нового поколения и др., препятствующими переходу бактерий в фазовые состояния, индуцирующие стертые формы заболевания и носительство возбудителя.
Литература:
1. How best to estimate the global burden of pertussis? / N.S. Crowcroft, C. Stein, P. Duclos, M. Birmingham // Lancet Infect. Dis. — 2003. — V. 3. — Р. 413—418.
2. Severe and unrecognised: pertussis in UK infants / N.S. Crowcroft et al. // Arch. Dis. Child. - 2003. - V. 88. - Р. 802-806.
3. Feigin R.D., CherryJ.D., Demmler G.J., Kaplan S. (ed.). Textbook of pediatric infectious diseases, 5th ed. / J.D. Cherry, U. Heininger. Pertussis and other Bordetella infections. — The W. B. Saunders Co, Philadelphia, Pa, 2004. - P. 1588-1608.
4. A controlled study of the relationship between Bordetella pertussis infection and sudden unexpected deaths in German infants / U. Heininger, W.J. Kleemann, J.D. Cherry, S.S. Group// Pediatrics. - 2004. -V. 114. - Р. 9-15.
5. bvg-негативная регуляция перемещений повторяющихся последовательностей в клетках Bordetella pertussis/ Л.Н. Синяшина и др. // Генетика. - 2005. - Т. 4, № 12. -С. 1 -9.
6. Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше // Министерство здравоохранения СССР. - Москва, 1984.
7. Специфическая диагностика коклюша у детей методом ДНК-зондирования / А.Г. Боковой и др.// Клинический вестник. -1996. - №3.- С. 15-16.
8. Выявление возбудителя коклюша в клинических образцах методом ДНК-ДНК гибридизации / Л.Н. Синяшина и др. // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней. - 1997. -Вып. 2.- С. 149-153.
9. Wendelboe A.M., Njamkepo E., Bourillon A. // Pediatr. Infect. Dis. J. -2007. - V. 4. - Р. 293-299.
10. Wood N. Pertussis: review of epidemiology, diagnosis, management and prevention / N. Wood, P. Mclntyre // Pediatric Respiratory Reviews. - 2008. - V. 9. - P. 201-212.
1 1. Каратаев Г.И. Мобильные генетические элементы Bordetella pertussis и их роль в регуляции генов вирулентности возбудителя коклюша: Автореф. дисс. ... д.б.н. - М., 2007.
12. Bvg-негативная регуляция перемещений повторяющихся последовательностей в клетках Bordetella pertussis/ Л.Н. Синяшина и др. // Генетика. - 2005. - Т. 12. - С. 1 -9.
13. In «National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH: Frontiers in Research» / L.N. Sinyashina et al. - Ed. Vassil St. Georgiev, Humana Press, Totowa, NJ. - 2008. - P. 227-23 1.
Патогенетическая значимость внутриутробных инфекций в формировании прогрессирующих гидроцефалий у детей первых месяцев жизни
Т. И. Долгих, Л. А. Ситко, В. И. Лдрькин, И. И. Лдрькин,
Э. В. НЕСТЕРЕНКО, М. М. МИРОНЕНКО, М. В. ШЕЛЕВ, С. Ю. ВЕГНЕР
ГОУ ВПО Омская государственная медицинская академия, Омская городская детская клиническая больница № 32
Обследованы 24 ребенка в возрасте от 1 до 5 мес. жизни с прогрессирующей гидроцефалией, у которых в ликворе методом полимеразной цепной реакции детектирован генетический материал возбудителей: Toxoplasma gondii, Herpes simplex virus 1/2, Epstein-Barr virus, Cytomegalovirus, Human herpes virus-6, Rotavirus, Lisreria monocytogenes, Enterovirus и Parvovirus B19, встречающихся в различных сочетаниях у каждого второго пациента. Не исключена роль Parvovirus B19 как триггера прогрессиро-вания патологии мозга. При инфекции установлено высокое содержание в ликворе хемокина — интерлейкина-8, который может служить диагностическим критерием развития воспалительного процесса.
Ключевые слова: дети первых месяцев жизни, внутриутробные инфекции, гидроцефалия, ликвор, Parvovirus B19, интерлейкин-8 УДК 616.9-053.3:618.33
Контактная информация: Долгих Татьяна Ивановна — д.м.н., проф., зав. центральной научно-исследовательской лабораторией ОГМА; 644043, Омск, ул.Ленина, 12; (3812) 23-32-89
