CC BY
163
Мутации изоцитратдегидрогеназ 1 и 2 и метилирование
гена MGMT в глиомах
N
И
ш и
Д.В. Табаков1, А.Н. Катаргин2, А.М. Строганова1, А.И. Сендерович1, Д.Р. Насхлеташвили1, Н.П. Киселева2
НИИ клинической онкологии ФГБУ«Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России;
Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 23; 2НИИканцерогенеза ФГБУ«Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478
Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Наталия Петровна Киселева [email protected]
Глиомы — наиболее распространенные опухоли головного мозга, трудно поддающиеся ранней диагностике и лечению. Мутации в генах изоцитратдегидрогеназ 1 и 2 (IDH1 и IDH2) играют существенную роль в глиомогенезе, диагностике и выборе терапии пациентов. Было исследовано распределение мутаций IDH1/2 в глиомах различных гистологических типов и степеней злокачественности методом анализа кривых плавления ДНК с зондами TaqMan по разработанному нами протоколу, позволяющему определять мутации с чувствительностью 5 %. Специфичность определения мутаций подтверждена секвенированием по Сэн-геру. В глиомах II и IIIстепеней злокачественности по классификации Всемирной организации здравоохранения частота мутаций IDH1/2 составила 74 %, в глиобластомах (IVстепень злокачественности) — 14 %. Глиомы, содержащие клетки с олигоден-дроцитарным типом дифференцировки, достоверно чаще имели мутации IDH1/2, чем другие типы глиом (р = 0,014). Преобладающим типом мутаций являются мутации IDH1 (79 % от общего числа мутаций). Одно из последствий мутаций IDH1/2 — индукция аберрантного метилирования генов. Анализ метилирования промотора гена О6-метилгуанин-ДНК-метил-трансферазы (MGMT, O6-methylguanine-DNA-methyltransferase), предсказательного маркера чувствительности глиом к терапии алкилирующими агентами у тех же больных, показал частичную ассоциацию с мутациями IDH1/2. В 73 % случаев с мутациями IDH1/2 наблюдалось метилирование MGMT. В то же время в 67 % случаев с метилированием MGMT отсутствовали мутации IDH1/2, что указывает на существование других механизмов метилирования MGMT в глиомах. Данные свидетельствуют в пользу необходимости одновременного определения 2 биомаркеров при выборе послеоперационной терапии пациентов.
Ключевые слова: глиома, мутации IDH1 и IDH2, метилирование MGMT, плавление ДНК
DOI: 10.17650/2313-805X-2017-4-1-53-59
Isocitrate dehydrogenase 1 and 2 genes mutations and MGMT methylation in gliomas D.V. Tabakov1, A.N. Katargin2, A.M. Stroganova1, A.I. Senderovich', D.R. Naskhletashvili1, N.P. Kiseljova2
Research Institute of Clinical Oncology, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia;
23 Kashirskoye Shosse, Moscow 115478, Russia;
2Research Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia;
24 Kashirskoye Shosse, Moscow 115478, Russia
Gliomas are the most common brain tumors. It is difficult to detect them at early stages of disease and there is a few available therapies providing significant improvement in survival. Mutations of isocitrate dehydrogenase 1 and 2 genes (IDH1 and IDH2) play significant role in glio-mogenesis, diagnostics and selection of patient therapy. We tested the distribution of IDH1 and IDH2 mutations in gliomas of different histological types and grades of malignancy by DNA melting analysis using our protocol with a sensitivity of 5 %. The results of this assay were confirmed by conventional Sanger sequencing. IDH1/2 mutations were detected in 74 % of lower grade gliomas (II and III, World Health Organization) and in 14 % of glioblastomas (IV, World Health Organization). Mutation rate in gliomas with oligodendroglioma component were significantly higher then in other glioma types (р = 0.014). The IDH1 mutations was the most common (79 % of general mutation number). IDH1/2 mutations can induce aberrant gene methylation. Detection of methylation rate of the gene encoding for O6-methylguanine-DNA-methyltransferase (MGMT), predictive biomarker for treatment of gliomas with the alkylating agents, has demonstrated a partial association with IDH1/2 mutations. In 73 % of IDH1/2-mutant tumors MGMT promoter methylation were observed. At the same time IDH1/2 mutations were not revealed in 67 % tumors with MGMT promoter methylation. These results indicate existence of another mechanism of MGMT methylation in gliomas. Our data strong support for necessity of both markers testing when patient therapy is selected.
Key words: glioma, IDH1 and IDH2 mutations, MGMT methylation, DNA melting
x ш
и
Введение
Глиомы — наиболее распространенные первичные опухоли головного мозга, включающие опухоли различных гистологических типов и степеней
злокачественности, трудно поддающиеся ранней диагностике и лечению.
Классификация глиом Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), основанная на гистологи-
N
CS
И
ш U
X ш
и
ческом сходстве опухолевых клеток с различными типами нормальных клеток глии и морфологии опухоли, различает 4 степени злокачественности (I—IV) [1]. Разработка и введение в клиническую практику молекулярных маркеров в дополнение к классификации ВОЗ позволяют выделять подтипы глиом, которые существенно различаются по выживаемости и чувствительности к терапии [2, 3].
Мутации в генах изоцитратдегидрогеназ 1 и 2 (IDH1 и IDH2) играют существенную роль в глиомогенезе, а также определяют диагностику и выбор терапии пациентов [4, 5]. Функция изоцитратдегидрогеназ заключается в окислительном декарбоксилировании изоцитрата, который превращается в а-кетоглутарат. Соматические мутации в генах IDH1 и IDH2, обнаруживаемые в глиомах и некоторых других опухолях, представляют собой гетерозиготные миссенс-мутации в каталитическом домене ферментов. Наиболее распространенные (> 90 % случаев) мутации вызывают замену аргинина (R132) на гистидин в IDH1 и аргинина (R172) на лизин в IDH2. В остальных случаях более редкие мутации в этом же кодоне вызывают замену аргинина на другие аминокислоты [5]. Мутации приводят к потере нормальной функциональной активности ферментов (образование а-кетоглутарата) и приобретению новой функции (образование 2-ги-дроксиглутарата). Таким образом, мутации в генах IDH1 и IDH2 имеют по крайней мере 2 последствия для клетки. Во-первых, снижается уровень нормального метаболита а-кетоглутарата, который является ключевым промежуточным продуктом цикла Креб-са, необходимым для нормального его прохождения и для многих других процессов в клетке, таких как метаболизм жиров, ацетилирование белков и др. Роль нарушения этих процессов в канцерогенезе пока мало изучена. Во-вторых, в клетках глиом накапливается 2-гидроксиглутарат, который рассматривается как онкометаболит [6]. Показано, что 2-гидроксиглу-тарат — ингибитор а-кетоглутаратзависимых ферментов диоксигеназ, к которым относятся гистоновые Н3К9/Н3К36-деметилазы семейства KDM4 и ферменты семейства ТЕТ, участвующие в деметилировании ДНК [7]. Предположение о том, что мутации IDH1/2 могут изменять паттерны метилирования ДНК и ги-стонов в опухолевых клетках в связи с ингибировани-ем соответствующих ферментов, было подтверждено экспериментами в культуре клеток [8—10]. В то же время в клинических исследованиях была охарактеризована группа глиом, обладающих специфическим фенотипом (CIMP, CpG-island methylator phenotype), отличающимся координированным гиперметилированием ДНК в промоторах многих генов-супрессоров. В этих глиомах CIMP статистически достоверно был ассоциирован с соматическими мутациями IDH1 [11].
Кроме этого, в экспериментах с культурами клеток было продемонстрировано, что клетки, содержащие мутантные IDH1/ 2, обладают повышенными
радиочувствительностью и чувствительностью к химио-препаратам, что, по-видимому, связано с нарушением ответа на окислительный стресс [12—14]. Увеличение чувствительности глиом с мутантными ШН1/2 к радио- и химиотерапии также было показано и в клинических исследованиях [15, 16]. Все вышесказанное говорит о необходимости систематического определения мутационного статуса ШН1/2 в клинической практике.
В связи с тем, что мутации ШН1/2 нарушают метилирование ДНК в опухолевых клетках, были сделаны попытки определить наличие корреляции метилирования промотора гена О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT, 06-теШу^иашпе-DNA-methyltransferase) с наличием мутаций ШН1/2. Метилирование MGMT рассматривается в настоящее время как предсказательный маркер, указывающий на чувствительность глиом к химиотерапии алкили-рующими агентами [17].
Являясь одним из ферментов системы репарации ДНК, MGMT удаляет метильные и хлорэтильные группы из О6-позиции гуанина, нейтрализуя цитоток-сический эффект алкилирующих агентов [18]. В нормальных клетках глии ген MGMT экспрессируется на высоком уровне. Снижение уровня экспрессии фермента за счет метилирования промотора гена, наблюдающегося только в опухолевых клетках, увеличивает цитотоксичность алкилирующих агентов избирательно по отношению к опухолевым клеткам. Хотя важность определения мутаций ШН1/2 и метилирования MGMT общепризнанна, остается неясным, они предоставляют перекрывающуюся или независимую информацию как биомаркеры [19, 20].
В данной работе мы исследовали распределение мутаций ШН1/ 2 в глиомах различных гистологических типов и степеней злокачественности методом анализа кривых плавления ДНК, выделенной из рутинных парафиновых срезов удаленных опухолевых тканей, фиксированных формальдегидом [21].
Разработанный нами протокол обеспечивал чувствительность 5 % и показал 100 % корреляцию с результатами определения мутаций с помощью «золотого стандарта» — секвенирования по Сэнгеру, чувствительность которого составляет 10—20 %. Показана лишь частичная ассоциация мутаций ШН1/ 2 и метилирования промотора гена MGMT в глиомах, что свидетельствует в пользу определения 2 биомаркеров для каждого пациента при выборе послеоперационной терапии.
Материалы и методы
Клинические материалы. Были использованы фиксированные формальдегидом, заключенные в парафиновые блоки ткани глиом, удаленные у пациентов, проходивших лечение в РОНЦ им. Н.Н. Блохина. Клинический диагноз был подтвержден двойным гистологическим исследованием всех образцов в отделении патологической анатомии опухолей человека. Выборка из 210 глиом включала образцы ГГ—ГУ
степеней злокачественности согласно классификации ВОЗ (табл. 1).
Выделение ДНК. Для выделения ДНК из тканей опухолей, заключенных в парафиновые блоки, использовали срезы толщиной 25 мкм. После механического выделения опухолевого материала из среза при микроскопическом контроле и депарафинизации его ксилолом (1 мин) ДНК выделяли с использованием набора QIAamp DNA FFPE Tissue (Qiagen, Германия) по протоколу фирмы.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени и определение профиля плавления продукта ПЦР. Использовали зонды типа TaqMan с флуорофором ROX на 5'-конце и гасителем BHQ2 на З'-конце олигонуклеотида. Олигонуклеотиды были комплементарны к смысловой цепи ДНК, не содержащей мутаций. Весь анализ выполняли в одной пробирке, что снижало вероятность перекрестных загрязнений образцов. Состав прайме-ров и зондов: IDH1 F-TCT TCA GAG AAG CCA TTA TC, R-CAC ATT ATT GCC AAC ATG A, зонд 5' (ROX) CATAAGCATGACGACCTATGATGAT (BHQ2) 3' (продукт ПЦР 118 пар нуклеотидов (п. н.)); IDH2 F-AAA CAT CCC ACG CCT AGT CC, R-AAA GTC TGT GGC CTT GTA CTG C, зонд 5' (ROX) CATGGGCGTGCCTGCCAATGGTGA (BHQ2) 3' (продукт ПЦР 171 п. н.). Кодоны, соответствующие аргининам 132 в IDH1 и 172 в IDH2, в которых наблюдаются мутации в опухолях, подчеркнуты. Реакционная смесь имела следующий состав: 10-кратный реакционный буфер для ПЦР — 2,5 мкл; ДНК-поли-мераза Hot Start Taq (Евроген, Россия) — 1,2—2,5 ед. активности на реакцию; MgCl2 — 2,5 ммоль; дезокси-нуклеотидтрифосфаты — до 200 мкмоль; прямой прай-мер — 12 пкмоль; обратный праймер — 1,2 пкмоль (для обеспечения преимущественной амплификации смысловой цепи в асимметричной ПЦР); зонд TaqMan (Синтол, Россия) — 5 пкмоль; вода — до общего объема 25 мкл; не менее 40 нг ДНК-матрицы. Реакцию проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rаd, США) для обеих пар праймеров следующим образом: 95 °С — 3 мин, (95 °С - 13 с, 54 °С - 40 с, 72 °С - 20 с) х 40 циклов; затем плавление продукта ПЦР: при температуре 95 °С 1 мин, при 54 °С 8 мин, от 54 до 90 °С повышение температуры на 0,3 °С при каждом шаге с продолжительностью шага 12 с. В качестве матрицы для положительного контроля использовали клонированный в плазмидном векторе pTZ57R/T (Fermentas, Литва) продукт ПЦР IDH1 и IDH2 дикого и мутант-ного типов соответственно.
Определение чувствительности метода выявления мутаций ЖЯплавлением продукта ПЦР. Чувствительность метода определяли анализом кривых плавления продуктов в 3 независимых ПЦР, в которых в качестве матрицы использовали смесь клонированных аллелей дикого и мутантного типов IDH в разных соотношениях. За порог чувствительности принимали минимальную
концентрацию мутантного аллеля в смеси с аллелем дикого типа в процентах, при которой еще выявлялся двухфазный характер кривой.
Определение нуклеотидной последовательности продукта ПЦР. После проведения симметричной ПЦР продукт реакции разделяли в 2 % агарозном геле, выделяли из геля замораживанием/оттаиванием и определяли нуклеотидную последовательность ампликона, используя указанные выше праймеры, в Центре коллективного пользования «Геном» НИИ молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта по протоколу Центра.
Метил-специфичная ПЦР для гена MGMT. Реакцию проводили как описано ранее [22]. Использовали 2 набора праймеров к верхней цепи ДНК, конвертированной в результате обработки бисульфитом натрия с помощью готового набора EZ DNA Methylation Kit (Zymo Research, США): 1) для метилированной последовательности сенс - 5' TTT CGA CGT TCG TAG GTT TTC GC (1063 п. н.), антисенс № 1 - 5' GCA CTC TTC CGA AAA CGA AAC G (1122 п. н.), антисенс № 2 - 5' ACC ACT CGA AAC TAC CAC CGT CC (115S п. н.); 2) для неме-тилированной последовательности сенс - 5' GTG TTT TGA TGT TTG TAG GTT TTT GT (1059 п. н.), антисенс № 1 - 5' AAC TCC ACA CTC TTC CAA AAA CAA AAC A (1127 п. н.), антисенс № 2 - 5' ACC ACT CAA AAC TAC CAC CAT CC (115S п. н). Позиции праймеров указаны по сиквенсу гена MGMT NC_000 010.11 (GenBank), начиная от -1000 п. н. от старта транскрипции. ПЦР проводили по следующей программе: 95 °С - 5 мин, (95 °С - 30 с, 60 °С для праймеров к метилированной последовательности и 64 °С для праймеров к немети-лированной последовательности - 30 с, 72 °С - 40 с) x 40 циклов, 72 °С - 10 мин. Фрагменты ДНК, полученные в процессе ПЦР, разделяли в 4 % агарозном геле с бромистым этидием (0,5 мкг/мл).
Результаты
Определение мутаций IDH1/2 флуоресцентным анализом кривых плавления продуктов ПЦР. Первоначально ДНК из 24 образцов глиобластом анализировали одновременно секвенированием по Сэнгеру и ПЦР в реальном времени с флуоресцентно-меченными зондами с последующим анализом кривых плавления продуктов ПЦР. На рис. 1 представлены примеры кривых плавления продуктов ПЦР и подтверждения мутационного статуса IDH1/2 секвенированием. Гетеродуплекс, образующийся между мутантным аллелем и зондом, не имеющим мутации, имеет более низкую температуру плавления, чем гомодуплекс зонда с аллелем дикого типа. Однофазная кривая плавления указывает на присутствие аллелей только дикого типа, двухфазная кривая с дополнительным пиком со сниженной температурой плавления - на смесь молекул мутантного и дикого типов.
При разработке протокола учитывали влияние на температуру плавления гетеро- и гомодуплексов, сочетания флуорофора и гасителя, длины зондов,
N
CS
И
ш u
ж ш
и
б
N
ев
X ш
и
ЮН1 м
С Т (£ГСт) С А Т С
200 150 100 50 0
50 60 70 80 90 Т, °С
ЮН1 тэ2Н
С С
НЕ*
С А Т
140 120 100 80 60 40 20 0
50 60 70 80 90 Т, °С
ЮН1 тэ2С
С С Т ' ' С А Т
50 60 70 80 Т, °С
ЮН2 wt
С С С А С
150
100
50
ср
о
=у
© -50
150
3- 100 I
ш
50 60 70 80 90 Т, °С ЮН2 т72 м
СР
о
=У
с ©
50
-50
60 70 80 Т, °С
90
Рис. 1. Определение гетерозиготных мутаций ЮН1 и ЮН2 в образцах глиом 2методами: а — кривые плавления продуктов полимеразных цепных реакций (ПЦР), проведенных с праймерами к участкам генов ЮН1 и ЮН2, включающих кодоны для аргинина 132 (R132) и 172 (R172) соответственно; анализ основан на разнице температур плавления дуплексов, образующихся между зондом и аллелями дикого (ш) или му-тантного типов; б — определение нуклеотидной последовательности секвенированием по Сэнгеру продукта ПЦР; овалом отмечены кодоны, соответствующие R132 и R172
использования сенс- или антисенс-цепи ДНК в качестве мишени для зонда и некоторых других условий [23].
В нашей выборке во всех случаях на двухфазных кривых сдвиг температур плавления для мутантных аллелей по сравнению с диким типом составлял 4—8 °С, что значительно превышает соответствующий сдвиг
150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
250
0 5 10 15 20 25 30
Количество мутантного аллеля в смеси с аллелем дикого типа, %
200
150
3- 100:
е п.
о у
50
0
-50
60
70
80
90
Т, °С
1,2 и 3 - кривые плавления для смесей с содержанием мутантного аллеля 0, 5 и 10 % соответственно
Рис. 2. Чувствительность метода анализа мутаций: а — результаты анализа кривых плавления продуктов 3 независимых полимеразных цепных реакций (вертикальные скобки — стандартное отклонение; в качестве матрицы в реакциях использовали смесь клонированных аллелей дикого и мутантного типов в разных соотношениях); б — результаты типичного опыта для ЮН2
при использовании интеркалирующих флуоресцентных красителей для анализа кривых плавления (не более 1 °С) [24]. Широкий интервал между температурами плавления мутантного и дикого вариантов позволяет не опасаться получения ложных результатов за счет различий температур плавления продуктов ПЦР с разными вариантами замен оснований в анализируемом кодоне на несколько градусов (см. рис. 1, сравни ШИ1 R132H и R132C). Таким образом, с помощью одних и тех же праймеров и зонда предложенный протокол позволяет выявлять различные варианты точечных мутаций в анализируемом кодоне, описанные в литературе [5].
Результаты определения мутационного статуса 2 методами полностью совпали, что говорит о специфичности разработанного протокола.
Определение чувствительности метода анализа кривых плавления в нашей модификации показало, что минимальная концентрация мутантного аллеля в смеси с аллелем дикого типа, при которой еще выявляется двухфазный характер кривой плавления, составляет 5 % (рис. 2).
а
а
б
0
Таблица 1. Частота мутаций генов IDH1 и IDH2 в глиомах
Гистотип Степень злокачественности* Мутация гена IDH1 Мутация гена IDH2
Астроцитома II 3/6 1/6
Олигодендроглиома II 4/5 0/5
Олигоастроцитома II 7/9 2/9
Анапластическая астроцитома III 9/18 1/18
Анапластическая олигодендроглиома III 8/12 2/12
Анапластическая олигоастроцитома III 5/7 0/7
Всего 36/57(63) 6/57 (11)
Глиобластома IV 14/153 (9) 8/153(5)
Примечание. Здесь и в табл. 2: цифры в скобках — частота события в процентах. *Степень злокачественности по классификации Всемирной организации здравоохранения [1].
N
ев
и ш u
Частота мутаций ШН1/2 в глиомах. Используя описанный протокол, мы провели анализ мутаций ШН1/2 в 210 образцах глиом различных степеней злокачественности и гистологических типов (см. табл. 1). В глиомах ГГ и ГГГ степеней злокачественности частота мутаций ШН1/2 составила 74 %. Глиомы, содержащие клетки с олигодендроцитарным типом дифференцировки, достоверно чаще (28 из 33) имели мутации ЮН1/2, чем астроцитомы разных степеней злокачественности (14 из 24; р = 0,014). Таким образом, мутации выявляются уже в глиомах низких степеней злокачественности. В табл. 1 представлена суммарная частота мутаций в первичных и вторичных глиобласто-мах (IV степень злокачественности), которая составила 14 %. Подавляющее большинство образцов IV степени злокачественности в нашей выборке составляли вновь диагностированные глиобластомы без возможности их разделения по клинической истории на первичные и вторичные глиобластомы (предшественники последних — глиомы ГГ и ГГГ степеней злокачественности). Низкая частота мутаций (14 %) в глиобласто-мах по сравнению с глиомами более низких степеней злокачественности указывает на преобладание в нашей выборке первичных глиобластом, для которых эти
мутации являются редкими [25, 26]. Преобладающим (79 %) типом мутаций во всех глиомах были мутации IDH1, при этом большинство из них были мутациями IDH1R132H. Только в 3 из 50 глиом, имеющих мутации IDH1, были обнаружены другие варианты замен оснований в том же кодоне. Мутации IDH2 составляли 21 % от всех выявленных мутаций и были представлены наиболее распространенным типом мутаций R172K во всех случаях, кроме одного с мутацией R172M (см. рис. 1). Одновременного присутствия мутаций IDH1 и IDH2 не обнаружено ни в одном случае.
Мутации IDH1/2 и метилирование промотора гена MGMT в глиомах. Метилирование MGMT было выявлено в 126 (60 %) из 210 глиом (табл. 2). При этом мы не наблюдали преобладания этого маркера в каком-либо из подтипов глиом (данные не представлены). Мутации IDH1/2 присутствовали лишь в 42 (33 %) из 126 опухолей, в которых наблюдалось метилирование MGMT. С другой стороны, мутации IDH1/2 не всегда сопровождались метилированием гена MGMT. В 17 (27 %) из 64 глиом, имеющих мутации, не выявлено метилирования MGMT. Таким образом, наблюдалась лишь частичная ассоциация 2 биомаркеров.
х ш
и
Таблица 2. Соотношение мутаций IDH1/2 и метилирования MGMT в глиомах
Степень злокачественности* Частота meMGMT meMGMT mutIDH1/2
mutIDH1/2 wtIDH1/2 meMGMT unMGMT
II + III 41/57 28/41 13/41 32/42 10/42
IV 85/153 14/85 71/85 15/22 7/22
Всего 126/210 (60) 42/126 (33) 84/126(67) 47/64 (73) 17/64 (27)
Примечание. meMGMT — ген MGMT метилирован; unMGMT — ген MGMT не метилирован; mutIDH1/2 — гены IDH1/2 мутированы; wtIDH1/2 — дикий тип генов.
N
ев
и ш u
X ш
и
Обсуждение
Обнаружение мутаций анализом кривых плавления ДНК с использованием зондов типа TaqMan является нетрудоемким, быстрым и относительно недорогим методом, снижающим возможность перекрестных кон-таминаций образцов [21, 23]. Лежащая в основе метода ПЦР позволяет использовать фрагментированную ДНК, выделенную из рутинных парафиновых срезов опухолевых тканей, фиксированных формальдегидом. Сравнение полученных результатов с «золотым стандартом» выявления мутаций прямым определением последовательности нуклеотидов по Сэнгеру показало 100 % корреляцию в выборке из 24 образцов, что говорит о специфичности разработанного протокола. Использование этого протокола позволяет обнаружить мутации, если они присутствуют всего в 5 % молекул ДНК в образце. Таким образом, чувствительность метода в данной модификации составила 5 %, что сравнимо с чувствительностью определения мутаций ШИ методом пиросеквенирования (5 %), требующего дорогостоящего оборудования, и существенно превышает чувствительность секвенирования по Сэнгеру (10-20 %) [27].
Высокая частота мутаций ШИ1/2 уже при II степени злокачественности (17 (85 %) из 20 глиом) указывает на раннее появление этих мутаций и их вклад в глиомогенез. Глиомы, содержащие клетки с олиго-дендроцитарным типом дифференцировки, достоверно чаще имели мутации ЮИ1/2, чем астроцитомы разных степеней злокачественности (р = 0,014), как это наблюдалось и в других исследованиях. В целом результаты, полученные предложенным методом, хорошо согласуются с данными, опубликованными для других популяций [20, 25, 28]. Это говорит о корректности использованного протокола, с одной стороны, и об отсутствии специфических особенностей частоты мутирования и распределения мутаций ШИ1/2 между типами глиом в российской популяции пациентов, с другой. Насколько нам известно, это 1-е исследование распространенности мутаций ШИ1/2 в глиомах в России.
Метилирование промотора MGMT выявлено нами в 60 % глиом, что согласуется с частотой метилирования в других популяциях [17]. При этом присутствие мутаций ШИ1/2 лишь в 33 % глиом, имеющих метилирование MGMT, указывает на существование других механизмов метилирования MGMT в глиомах помимо снижения активности а-кетоглутаратзависимых ферментов. С другой стороны, мутации ШИ1/2 не сопровождались метилированием гена MGMT в 27 % глиом, имеющих мутации. Это говорит о необходимости каких-то дополнительных условий для метилирования гена, помимо изменения активности ШИ1/2. Обнаруженная частичная ассоциация между метилированием MGMT и мутациями ШИ1/2 указывает на необходимость анализа статуса обоих маркеров для ведения больных после удаления глиом. Определение 2 маркеров тем более важно, поскольку каждый из них имеет независимую ассоциацию с повышенной выживаемостью пациентов, подвергающихся радиотерапии в сочетании с алкилирующими агентами, и, по-видимому, различным образом влияет на клинический ответ на терапию [29, 30].
Заключение
Разработан протокол метода плавления ДНК для анализа мутаций генов ШИ1/2 в глиомах, позволяющий определять мутации с чувствительностью 5 %. Специфичность определения мутаций подтверждена секвенированием по Сенгеру в 24 образцах. В результате анализа более 200 глиом показаны раннее появление мутаций в процессе прогрессии глиом, преобладание мутаций ШИ1, более высокая частота мутаций ШИ1/ 2 в глиомах олигодендроглиального происхождения по сравнению с другими гистотипами глиом. Одновременное определение мутаций ШИ1/2 и метилирования промотора MGMT, предсказательного маркера чувствительности глиом к химиотерапии алкилирую-щими агентами, выявило лишь частичную ассоциацию 2 биомаркеров. Данные свидетельствует о пользе необходимости определения обоих биомаркеров для каждого пациента при выборе послеоперационной терапии.
Авторы выражают благодарность А.В. Лихтенштейну за консультации в процессе выполнения работы. Работа выполнена при частичной поддержке Российского научного фонда (грант № 15-15-00125).
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Louis D.N., Ohgaki H., Wiestler O.D. et al. The 2007 WHO classifcation
of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol 2007;114(2): 97-109.
2. Vigneswaran K., Neill S., Hadjipanayis C.G. Beyond the world health organization grading of infiltrating gliomas: advances in the molecular genetics of glioma classification. Ann Transl Med 2015;3(7):95.
3. Борисов К.Е., Сакаева Д.Д. Генные нарушения и молекулярно-генетические подтипы злокачественных глиом. Архив патологии 2013;(3):52-61. [Borisov K.E., Sakaeva D.D. Gene disorders and molecular genetic subtypes of malignant gliomas. Arkhiv patologii = Pathology Archive 2013;(3):52-61.
(In Russ.)].
4. Parsons D.W., Jones S., Zhang X. et al. An integrated genomic analysis of human
glioblastoma multiforme. Science 2008;321(5897):1807-12.
5. Yan H., Ye D., Guan K.L., Xiong Y. IDH1 and IDH2 mutations
in tumorigenesis: mechanistic insights and clinical perspectives. Clin Cancer Res 2012;18(20):5562-71.
6. Losman J.A., Looper R., Koivunen P. et al. (R)-2-hydroxyglutarate is sufficient
to promote leukemogenesis and its effects are reversible. Science 2013;339(6127):1621-5.
7. Xu W., Yang H., Liu Y. et al. Oncometabolite 2-hydroxyglutarate is a competitive inhibitor of alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenases. Cancer Cell 2011;19(1):17-30.
8. Turcan S., Rohle D., Goenka A. et al. IDH1 mutation is sufficient to establish the glioma hypermethylator phenotype. Nature 2012;483(7390):479-83.
9. Lu C., Ward P.S., Kapoor G.S. et al. IDH mutation impairs histone demethylation and results in a block to cell differentiation. Nature 2012;483(7390):474-8.
10. Duncan C.G., Barwick B.G., Jin G. et al. A heterozygous IDH1R132H/WT mutation induces genome-wide alterations in DNA methylation. Genome Res 2012;22(12):2339-55.
11. Noushmehr H., Weisenberger D.J., Diefes K. et al. Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell 2010;17(5):510-22.
12. Shi J., Sun B., Shi W. et al. Decreasing GSH and increasing ROS in chemosensi-tivity gliomas with IDH1 mutation. Tumour Biol 2015;36(2):655-62.
13. Molenaar R.J., Botman D., Smits M.A. et al. Radioprotection of IDH1-mutated cancer cells by the IDH1-mutant inhibitor AGI-5198. Cancer Res 2015;75(22): 4790-802.
14. Li S., Chou A.P., Chen W. Overexpression of isocitrate dehydrogenase mutant proteins renders glioma cells more sensitive to radiation. Neuro Oncol 2013;15(1):57-68.
15. Okita Y., Narita Y., Miyakita Y. et al. IDH1/2 mutation is a prognostic marker for survival and predicts response
to chemotherapy for grade II gliomas concomitantly treated with radiation therapy. Int J Oncol 2012;41(4):1325-36.
16. Tran A.N., Lai A., Li S. et al. Increased sensitivity to radiochemotherapy in IDH1 mutant glioblastoma as demonstrated
by serial quantitative MR volumetry. Neuro Oncol 2014;16(3):414-20.
17. Weller M., Stupp R., Reifenberger G. et al. MGMT promoter methylation in malignant gliomas: ready for personalized medicine? Nat Rev Neurol 2010;6(1):39-51.
18. Christmann M., Verbeek B., Roos W.P. et al. O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) in normal tissues and tumors: enzyme activity, promoter methylation and immunohistochemistry. Biochim Biophys Acta 2011;1816:179-90.
19. Mukasa A., Takayanagi S., Saito K.
et al. Significance of IDH mutations varies with tumor histology, grade, and genetics in Japanese glioma patients. Cancer Sci 2012;103(3):587-92.
20. Siegal T. Clinical impact of molecular biomarkers in gliomas. J Clin Neurosci 2015;22(3):437-44.
21. Lyon E., Wittwer C.T. Light cycler technology in molecular diagnostics. J Mol Diagn 2009;11(2):93-101.
22. Табаков Д.В., Строганова А.М., Сенде-рович А.И. и др. Анализ метилирования гена MGMT в глиомах методом модифицированной метил-специфичной ПЦР. Вестник РОНЦ им. Н.Н. Бло-хина 2015;(26):9-33. [Tabakov D.V., Stroganova A.M., Senderovich A.I. et al. Analysis of MGMT gene methylation
in gliomas using modified methylation-specific PCR. Vestnik RONTS im. N.N. Blokhina = Journal of N.N. Blo-khin Russian Cancer Research Center 2015;(26):9-33. (In Russ.)].
23. Botezatu I.V., Nechaeva I.O., Stroganova А.М. et al. Optimization of melting analysis with TaqMan probes for detection of KRAS,
NRAS, and BRAF mutations. Anal Biochem 2015;491:75-83.
24. Berenstein R., Blau I.W., Kar A. et al. Comparative examination of various PCR-based methods for DNMT3A and IDH1/2 mutations identification in acute myeloid leukemia. J Exp Clin Cancer Res 2015;33:44.
25. Ichimura K., Pearson D.M., Kocialkowski S. et al. IDH1 mutations are present
in the majority of common adult gliomas but rare in primary glioblastomas. Neuro Oncol 2009;11(4):341-7.
26. Измайлов Т.Р., Снигирева Г. П., Шишкина Л.В. и др. Генетические нарушения при первичных глиобластомах головного мозга. Вопросы онкологии 2016;62(4):471-8. [Izmaylov T.R., Snigireva G.P., Shishkina L.V. et al. Genetic disorders in primary brain glioblastomas. Voprosy onkologii = Problems in Oncology 2016;62(4):471-8. (In Russ.)].
27. Arita H., Narit Y., Matsushita Y. et al. Development of a robust and sensitive pyrosequencing assay for the detection of IDH1/2 mutations in gliomas. Brain Tumor Pathol 2015;32(1):22-30.
28. Hartmann C., Hentschel B., Simon M. et al. Long-term survival
in primary glioblastoma with versus without isocitrate dehydrogenase mutations. Clin Cancer Res 2013;19(18):5146-57.
29. Molenaar R.J., Verbaan D., Lamba S.
et al. The combination of IDH1 mutations and MGMT methylation status predicts survival in glioblastoma better than either IDH1 or MGMT alone. Neuro Oncol 2014;16(9):1263-73.
30. Yang P., Zhang W., Wang Y. IDH mutation and MGMT promoter methylation
in glioblastoma: results of a prospective registry. Oncotarget 2015;6(38): 40896-906.
N
CS
И
ш u
ж ш
и
