МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ ШТАММОВ ГРИБОВ И СТРЕПТОМИЦЕТОВ, УСТОЙЧИВЫХ К БЕЛОМУ ФОСФОРУ Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 579.695; 546.85; 502.55; 661.63

1А.З. Миндубаев, 1А.Д. Волошина, 2Й.А. Акосах, 2К.А. Сапармырадов, 1Е.К. Бадеева

'Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН,

[email protected] 2Казанский (Приволжский) федеральный университет

МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ ШТАММОВ ГРИБОВ И СТРЕПТОМИЦЕТОВ, УСТОЙЧИВЫХ К БЕЛОМУ ФОСФОРУ

В статье дано морфологическое описание штаммов грибов Aspergillus niger АМ1; Aspergillus niger АМ2 и стрептомицетов Streptomyces sp. A8, участвующих в процессе биодеградации белого фосфора, и выполнен анализ их таксономического родства с типовыми представителями. Предварительные результаты исследования показали, что устойчивость к белому фосфору у A.niger АМ1 закреплена в геноме.

Ключевые слова: белый фосфор; Aspergillus niger АМ1; Aspergillus niger АМ2; Streptomyces sp. A8; морфологическое описание; таксономия.

Введение

Белый фосфор - востребованный и крупнотоннажный продукт. Доля России в мировом потреблении белого фосфора в 2004 г. составляла 5.7%, Китая 71.1%, США 8.6%, Казахстана 8.1%, Западной Европы 5.8%, Индии 0.7% (Gleason, 2007). Опасность обращения и контакта с белым фосфором привела к появлению значительного числа работ по его обезвреживанию. Как правило, оно заключается в окислении до фосфорной кислоты сильными окислителями (например, смесью азотной и серной кислот), которые сами по себе представляют угрозу для окружающей среды (Sullivan et al., 1994). Между тем, все большую популярность приобретает метод биодеградации токсичных отходов.

Биодеградация белого фосфора до начала наших исследований не была известна (Миндубаев и др., 2017а,ЬД Миндубаев и др., 2015; Миндубаев и др., 2016а,Ь , Миндубаев и др., 2018), хотя этот метод гармонично вписывается в естественные биосферные процессы, и в настоящее время широко применяется (Миндубаев, 2018).

Методика исследования

Для дальнейшего исследования A. niger АМ1, растущего на белом фосфоре и фосфате, посев A. niger АМ1 производился аналогично описанному в работе (Миндубаев и др., 2017c). Однако, помимо посева в четыре варианта сред, произвели еще пятый вариант посева - в среду с фосфатом в качестве источника фосфора, и без круга фильтровальной бумаги на поверхности среды. Этот посев произведен для установления природы устойчивости аспергилла к белому фосфору

(Миндубаев и др., 2017b). Кусочки Р4 извлекались из емкости с водой пинцетом на фильтровальную бумагу с целью осушения. Затем они помещались в заранее взвешенный бюкс с дистиллированной водой и взвешивались (с точностью 0.0001 г). После взвешивания кусочки белого фосфора снова осушались на фильтровальной бумаге, после чего вносились пинцетом в шленк с ацетоном для стерилизации. Фильтровальную бумагу, контактировавшую с белым фосфором, нейтрализовали раствором медного купороса во избежания самовозгорания. Эмульгирование проводили при 50 °С в ультразвуковой ванне Сапфир, в атмосфере аргона, в физиологическом растворе. Рост A. niger АМ1 производился в термостате при 25 °С. Через 11 суток после посева чашки поместили в холодильник (4 °С). Морфологическое описание культур A. niger и Streptomyces sp. A8 производилось при помощи микроскопа Carl Zeiss Observer A1.

Результаты и их обсуждение

Штамм Streptomyces sp. A8

Штамм выделен 10.09.2012 г. на среде Гаузе 1 с минеральным азотом из осадка сточных вод МУП Водоканал г. Казани после добавления в него эмульсии белого фосфора (Миндубаев и др., 2015). Идентификация S. sp. A8 проведена с использованием анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК и культурально-морфо-логических характеристик. Определение уровня сходства с типовыми штаммами ближайших видов проводилось с использованием ресурсов и алгоритмов сайта EzBioCloud (www.ezbiocloud.net). Определение культурально-морфологических ха-

2/2018

47

рактеристик штамма проведено с использованием сред Гаузе (Гаузе и др., 1983; Миндубаев и др., 2016a).

Ниже перечислены характерные признаки штамма S. sp. A8. Цепочки спор прямые, споры с гладкой поверхностью. На минеральном агаре (Гаузе1) воздушный мицелий (ВМ) светло-серого цвета, субстратный мицелий (СМ) буроватый, серовато-коричневый, не содержит растворимый пигмент (РП). На овсяном агаре ВМ имеет серый цвет, СМ - бесцветный, РП отсутствует. На глицерин-нитратном агаре ВМ светло-серый, СМ желто-серый, РП отсутствует. На органическом агаре ВМ белый или светло-серый, СМ желтоватый до буроватого, РП отсутствует. Меланоидные пигменты не образует.

Штамм Streptomyces sp. А.8 утилизирует глюкозу, обладает гидролитической активностью в отношении крахмала. Восстанавливает нитраты до нитритов.

Культивировать в течение 3-4 дней при температуре 28°С.

Для длительного хранения культуру замораживают (-80оС) в 30% глицерине, а также хранят в ампулах в лиофилизированном состоянии (защитная среда - обезжиренное молоко) (Гаузе и др., 1983).

При секвенировании амплифицированного фрагмента гена 16S рРНК получена нуклеотид-ная последовательность размером 1209 нуклеоти-дов (Миндубаев и др., 2016a).

Результаты анализа фрагмента гена 16S рРНК показали, что штамм А8 относится к роду Streptomyces, поскольку процент сходства с 30 типовыми штаммами ближайших видов Streptomyces составляет, согласно данным с сайта EzBioCloud, от 98.4 до 99.67%, наиболее близок (99.67%) к типовому штамму Streptomyces albidoflavus DSM 40455T (Миндубаев и др., 2017b). Однако, данный процент сходства не позволяет установить видовую принадлежность штамма - для этого он должен составить не менее 99.9% сходства с конкретным видом.

Штамм Aspergillus niger Tiegh АМ1.

Дата выделения штамма 07.10.2014 г.

Колонии на картофельно-глюкозном агаре (КГА) при 25°C за 9 суток имеют диаметр 58 мм, черные, поверхность зернистая, край ровный; мицелий белый, септированный, на чашке эксудат не обнаружен. Конидиальные головки шаровидные. Конидиеносцы (стайпы) несептированные, гладкостенные с среднем измерением 960 - 1150 мкм х 9 - 11 мкм. Везикулы сферические, диаметр около 58 мкм; стеригмы двухъярусные, ме-

тулы очень плотно покрывают всю поверхность везикулы. Конидии черные, шаровидные, около 4 мкм в диаметре, толстостенные, поверхность шероховатая.

При росте на высоких (более 0.2%) концентрациях белого фосфора мицелий гриба приобретает желтый цвет. Температура культивирования 25°С. Культура растет на картофельно-глюкозном агаре (КГА). Срок выращивания 7 суток.

Споры аспергилла хранятся в пробирке с завинчивающейся крышкой, заполненной 30% водным глицерином при 30 °С более 2 лет.

Культура относится к IV группе патогенности (СП 1.3.2322-08).

Определение культурально-морфологиче-ских характеристик штамма проведены с использованием сайта коллекции CBS (http://www. westerdijkinstitute.nl) и определителя (Билай, Коваль, 1988).

Посев A. niger АМ1 в пяти вариантах был проведен в качестве подготовительного этапа для дальнейшего протеомного анализа данного микроорганизма. Через 11 суток после посева он достиг зрелости.

Результат очень похож на описанный нами ранее (Миндубаев и др., 2017c). Через 11 суток после посева аспергилл лучше всего растет в среде с фосфатом, чуть медленнее в среде с фосфатом и белым фосфором, в среде с белым фосфором отмечено отставание в росте и пониженная фер-тильность, в среде без источников фосфора -очень медленный рост. Тем не менее, даже в этой среде гриб осуществил спороношение. По всей видимости, подложка из фильтровальной бумаги стала для него источником фосфата, хотя жесткий дефицит его все равно сказался на развитии, культуры в этом варианте посева практически не наращивали биомассу. В средах, содержащих белый фосфор, обращает внимание желтая окраска колоний, нехарактерная для черного аспергилла. Такая же окраска наблюдалась и в предыдущих посевах в среды с Р4. Разумеется, в среде с фосфатом гриб рос очень хорошо.

Пересев культур A. niger АМ1, росших до этого в средах с фосфатом и в средах с белым фосфором, показал интересную картину. Ожидалось, что после роста в благоприятных условиях - в среде с фосфатом - микроорганизм мог утратить устойчивость к белому фосфору и не расти, или расти медленнее, чем та же культура, росшая до пересева в среде с Р4. В действительности, гриб, росший до пересева на фосфате, рос быстрее. Уже через трое суток после посева субстратный мицелий гриба, росшего на фосфате, покрыл дно чашек Петри. Гриб, росший до этого на белом

48

российский журнал прииой экологии

Рис. Пересев в среду с 0.2% белого фосфора A. niger АМ1, росшего до пересева в среде с белым фосфором (ряд слева) и в среде с фосфатом (ряд справа). Снимок сделан через 10 суток после посева.

фосфоре, через 3 суток тоже рос, но колонии имели меньший размер. Через 10 суток после посева, когда колонии уже покрылись спорами, некоторое отставание в росте (хотя уже менее выраженное) у грибов, росших в среде с белым фосфором, все еще наблюдалось (рис.). Из этой картины можно сделать вывод, что резистентность к белому фосфору у исследуемого нами штамма черного аспергилла закреплена в геноме и является наследуемым признаком, передающимся в ряду поколений даже в отсутствие Р Более быстрый рост гриба, пересеянного со среды с фосфатом, можно объяснить предшествующим накоплением фосфата в мицелии. Начиная расти, культура гриба уже содержала в себе некоторое количество биогенного фосфора, необходимого для роста. Штамм Aspergillus niger Tiegh АМ2 Дата выделения штамма АМ2 08.12.2016 г. Фенотипические признаки схожи с исходным штаммом АМ1. Штамм получен в процессе отбора при культивировании Aspergillus niger АМ1 в жидкой модифицированной среде Придхем-Гот-либа с 0.2% белого фосфора по большей скорости роста (на четвертые сутки после посева разница составила 1.5 раза) и продукции оранжевого пигмента в сравнении с исходным штаммом.

Колонии на КГА при 25°C за 7 суток имеют диаметр 45-48 мм, черные, поверхность зернистая, край ровный; мицелий белый, септированный, на чашке эксудат не обнаружен. Конидиальные головки шаровидные. Конидиеносцы несептиро-

ванные, гладкостенные со средним размером 8701140 мкм х 8-10мкм. Везикулы (апикальные расширения) сферические, диаметр около 47 мкм; стеригмы двухъярусные, метулы очень плотно покрывают всю поверхность везикулы. Конидии черно-коричные, шаровидные, 3-4 мкм в диаметре, толстостенные, поверхность шероховатая.

Мицелий гриба и культуральная среда приобретает оранжевый цвет, иногда маскирующийся черным при спороношении.

Заключение

Сделаны морфологическое, биохимическое и таксономическое описания культур микроорганизмов, имеющие очень важное значение. Это открывает возможность для дальнейшего создания коллекционных штаммов микроорганизмов.

Не менее интересным результатом является обнаружение сохранения штаммом черного ас-пергилла признака устойчивости к белому фосфору даже при росте в отсутствии этого вещества. Данный факт указывает на то, что устойчивость закреплена в геноме этого штамма, и здесь открывается поле для дальнейших перспективных исследований.

Список литературы

1. Билай В.И., Коваль Э.З. Аспергиллы. Определитель. Киев: Наукова думка, 1988. 204 с.

2. Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномице-тов. М.: Наука, 1983. 258 с.

3. Миндубаев А.З. Кто съел полиэтилен? // Наука и жизнь. 2018. № 4. С. 32-38.

4. Миндубаев А.З., Бабынин Э.В., Волошина А.Д., Са-хапов И.Ф., Яхваров Д.Г. Изучение генотоксичности белого фосфора // Российский журнал прикладной экологии. 2017a. № 2. С. 42-46.

5. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Бабынин Э.В., Ва-лидов Ш.З., Сапармырадов К.А., Хаяров Х.Р., Бадеева Е.К., Барсукова Т.А., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Акосах Й.А., Яхваров Д.Г. Обезвреживание белого фосфора посредством микробиологического разложения // Бутлеровские сообщения. 2017b. Т. 52, № 12. С. 87-118.

6. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Бадеева Е.К., Хаяров Х.Р., Яхваров Д. Г. Окисление белого фосфора черным ас-пергиллом. Появление мутантной культуры Aspergillus niger AM1 // Российский журнал прикладной экологии. 2018. № 1. С. 25-28.

7. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Алимова Ф.К., Яхваров Д.Г. Возможность обезвреживания промышленных стоков, содержащих белый фосфор, при помощи микрофлоры // Российский журнал прикладной экологии. 2015. № 3. С. 42-47.

8. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Кулик Н.В., Сахапов И.Ф., Валидов Ш.З., Яхваров Д.Г. Рост гриба аспергилла в среде с белым фосфором и фосфатом. Стерилизация навесок белого фосфора // Российский журнал прикладной экологии. 2017с. № 3. С. 37-40.

9. Миндубаев А.З., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г.,

2/2018

49

Яхваров Д.Г. Влияние зеленой массы амаранта на скорость деградации белого фосфора // Российский журнал прикладной экологии. 2017d. №1. С. 50-54.

10. Миндубаев А.З., Сапармырадов К.А., Алимова Ф.К. Сравнение антагонистических свойств стрептомицетов из различных биотопов // Российский журнал прикладной экологии. 2016a. № 3. С. 28-32.

11. Миндубаев А.З., Сапармырадов К.А., Горбачук Е.В., Панкова А.В. Селекция микроорганизмов на устойчивость к белому фосфору // Российский журнал прикладной экологии. 2016b. № 2. С. 42-46.

12. СП 1.3.2322-08. Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителям паразитарных болезней.

13. Gleason W. An Introduction to Phosphorus: History, Production, and Application // JOM. 2007. V. 59. №6. P. 17-19.

14. Sullivan J.M., Trasher R.D., Edwards R.E. Recovery of phosphates from elemental phosphorus bearing wastes. Патент: US5275639, 4.01.1994.

Mindubaev A. Z., Voloshina A.D., Akosah Y.A., Badeeva E.K. Morphological description of fungus strainsand streptomycetes, resistant to white phosphorus.

The article gives a morphological description of strains of the fungi Aspergillus niger AMI, Aspergillus niger AM2 and streptomycetes Streptomyces sp. A8, involved in the process of white phosphorus biodegradation. Their taxonomic relationship with type representatives was analyzed. Preliminary results of studying showed that the resistance to white phosphorus ofA. nigerAMl is fixed in the genome.

Keywords: white phosphorus; Aspergillus niger АМ1; Aspergillus niger АМ2; Streptomyces sp. A8; morphological description; taxonomy.

5!

российский журннл орииной экологии