CC BY
13
УДК 579.695; 546.85; 502.55; 661.63
'А.З. Миндубаев, 1А.Д. Волошина, 1Н.В. Кулик, 'И.Ф. Сахапов,
2Ш.З. Валидов, 1Д. Г. Яхваров
'Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН,
mindubaev@iopc.ru 2Казанский (Приволжский) федеральный университет
РОСТ ГРИБА АСПЕРГИЛЛА В СРЕДЕ С БЕЛЫМ ФОСФОРОМ И ФОСФАТОМ. СТЕРИЛИЗАЦИЯ НАВЕСОК БЕЛОГО ФОСФОРА
Посев A. niger АМ1 в среду, содержащую два источника фосфора (фосфат и белый фосфор) продемонстрировал, что Р4 не проявляет токсические свойства по отношению к этому микроорганизму. В присутствии белого фосфора он растет с такой же скоростью, как в его отсутствии. Это единственный пример отсутствия токсичности белого фосфора для живого организма. Расчет показал, что концентрация содержащихся в модифицированной среде Придхем-Готлиба солей меди слишком мала для осуществления абиотического диспропорционирования вносимого в нее белого фосфора. Следовательно, говорить о биодеградации есть основания. Посев A. niger АМ1 в среду с белым фосфором, стерилизованным ацетоном, показал, что в контрольных средах рост отсутствовал спустя 117 дней. Это указывает на то, что стерилизация навесок Р4 ацетоном эффективна.
Ключевые слова: белый фосфор; биодеградация; культуральные среды; Aspergillus niger АМ1.
Введение
Биодеградация является одним из наиболее популярных и часто применяемых на практике методов обезвреживания промышленных стоков, обогащенных неприродными веществами самых разнообразных классов, зачастую очень токсичных (Хоменков и др., 2008). Главное преимущество биодеградации, по сравнению с иными методами обезвреживания стоков, заключается в том, что при ее использовании в окружающую среду не вносятся новые химические загрязняющие агенты. В основе метода лежит способность микроорганизмов адаптироваться к самым неблагоприятным условиям существования.
Ряд наших публикаций (Миндубаев и др., 2015Ь; Миндубаев и др., 2016 а, сД Миндубаев и др., 2017а,Ь,с) посвящен микробиологическому превращению токсичного элементного (белого) фосфора в биогенный фосфат. При исследовании роста микроорганизмов в средах, содержащих белый фосфор, но лишенных фосфата, постоянно возникал вопрос об изменении рН данных сред в процессе развития микроорганизмов и детоксикации Р4. Окисление белого фосфора приводит к образованию кислот и росту кислотности, особенно заметному в отсутствии фосфатного буфера. Соли фосфорной кислоты в культуральных средах выполняют не только роль источника фосфора, но и роль буфера, гасящего колебания рН. Именно поэтому фосфорная подкормка во все применяемые в настоящее
время культуральные среды вносится в виде точно рассчитанного соотношения гидрофосфата и дигидрофосфата. Поэтому посев в среду, содержащую сразу два источника фосфора -смесь гидрофосфата и дигидрофосфата, а также белый фосфор,- вызывает большой интерес.
Одной из серьезнейших проблем, возникавших при посеве микроорганизмов в среды с белым фосфором, было отсутствие эффективного метода стерилизации. Как выяснилось (Миндубаев и др., 2015а), даже такой токсичный и агрессивный реактив как белый фосфор содержит жизнеспособные споры микроорганизмов (в первую очередь, плесневых грибов), подавляющих рост и вытесняющих высеянные культуры. В этой связи представлялась важной разработка метода стерилизации Р4 в мягких условиях, без применения высоких температур.
Методика исследования
Посев А. niger АМ1 в четыре варианта сред был произведен аналогично ранее описанной схеме (Миндубаев и др., 2015а,Ь) с некоторыми модификациями. Культура А. niger АМ1 выращивалась в чашках Петри с подложкой из фильтровальной бумаги над агаризованной средой. При этом посев производился не в трех, а в четырех вариантах: 1) модифицированная среда Придхем-Готлиба без источников фосфора, 2) с фосфатом, 3) с 0.2% белого фосфора и 4) с 0.2% Р4 и с фосфатом (в той же концентрации,
что во втором варианте: 0.0475 М или 0.15% в пересчете на чистый фосфор). Все варианты посева выполнены в трех повторах.
Для определения эффективности стерилизации белого фосфора ацетоном A. niger АМ1 сеяли в модифицированную среду Придхем-Готлиба, состав которой был представлен ранее (Миндубаев и др., 2015а). Среда была приготовлена в двух вариантах, различающихся источником фосфора. Опытный вариант содержал белый фосфор в концентрации 0.04 М (0.2%), контрольный -смесь гидрофосфата и дигидрофосфата калия в концентрации 0.0475 М (0.15% в пересчете на чистый фосфор), указанной в (Миндубаев и др., 2015 а). Культура A. niger АМ1, взятая для посева, до него росла в среде идентичного состава с 0.2% Р В данном посеве в принципе впервые применена стерилизация белого фосфора ацетоном. В шленк с навеской белого фосфора (0.95 г) влили 20 мл ацетона и выдержали 15 мин. при перемешивании (ручное взбалтывание) без нагрева. Слив ацетон и не дожидаясь его испарения, влили в шленк 50 мл дистиллированной воды, стерилизованной автоклавированием. Затем приготовили 2% эмульсию белого фосфора в этой воде (ультразвуковая ванна Сапфир (Россия), 30 мин., 50 °С, аргон). Эмульсию смешивали со средой без источников фосфора в соотношении 2:18 мл, в результате получалось по 20 мл среды с содержанием Р4 0.2%. Приблизительно через 12 суток культура A. niger АМ1 достигла стадии зрелости, когда уже стало возможным исследование экспрессии генов. Культура хранилась в замороженном виде.
Результаты и их обсуждение
На 12 сутки после посева A. niger АМ1 в четыре варианта среды, наблюдалась следующая картина (рис. 1). В средах без источников фосфора рост практически не наблюдается (одна-две крошечные колонии без спороношения на чашку) (рис., вариант 1). В средах с фосфатом аспергилл хорошо растет и спороносит, однако культура не чистая. В ней, помимо черных колоний аспергилла, присутствуют колонии других микроорганизмов кремового и зеленого цветов (рис., вариант 2). В средах с 0.2% белого фосфора колонии аспергилла имеют бледно-серый цвет (пониженная фертильность) (рис., вариант 3).
Очень интересный результат показал четвертый вариант посева - с белым фосфором и фосфатом (рис., вариант 4). Колонии растут очень хорошо, даже более развитые, чем в среде с фосфатом, причем в двух случаях из трех выросла чистая культура (в одном
появилась кремовая колония неизвестного вида). Таким образом, медленный рост аспергилла в среде с белым фосфором объясняется не токсичностью последнего для данного штамма, а исключительно его труднодоступностью в качестве источника фосфора. Возможно, играют роль и буферные свойства фосфата. Соли фосфорной кислоты в культуральных средах выполняют не только роль источника фосфора, но и роль буфера, гасящего колебания рН. Водные растворы дигидрофосфатов имеют кислую реакцию (рКа1=2.1), гидрофосфатов - близкую к нейтральной (рКа2=7.2), незамещенных фосфатов - сильнощелочную (рКаЗ = 12.7) (Е^е1к^, 2015). Именно поэтому фосфорная подкормка во все применяемые в настоящее время культуральные среды вносится в виде точно рассчитанного соотношения гидрофосфата и дигидрофосфата.
Судя по полученным данным, Р4 нетоксичен для данного гриба. Конкуренция с другими видами сильнее тормозит рост, чем присутствие белого фосфора. Следует отметить, что на 14 сутки после посева стал наблюдаться рост аспергилла и в среде без источников фосфора за счет очень незначительного количества фосфата, присутствовавшего в бумаге.
Рис. Первый пересев устойчивых A. niger АМ1 Варианты: 1 - среда без источников фосфора; 2 - с фосфатом; 3 - с белым фосфором (0.2%);
4 - с 0.2% Р4 и фосфатом
Одной из серьезнейших проблем, с которой мы ранее сталкивались, производя посевы микроорганизмов в среды с белым фосфором, было отсутствие эффективного метода стерилизации. Стерилизация автоклавированием при 120 °С белого фосфора и содержащих его сред слишком опасна по причине агрессивности данного вещества. Стерилизация ультрафиолетом
38
российский журнал прииой экологии
не годится из-за превращения белого фосфора в красный фосфор под действием высокоэнергетических квантов света.
Нами предлагается метод стерилизации Р4 в более мягких условиях. Для этого навеска ксенобиотика погружалась на 15 минут в липофильный органический растворитель - ацетон, который легко проникает через гидрофобные оболочки микробных спор и умерщвляет их (McDonnell, Russell, 1999). Белый фосфор растворим в большинстве органических растворителей. Ацетон был выбран именно по причине сравнительно низкой растворимости в нем белого фосфора: при 25 °С в литре ацетона растворяется всего 1.4 г Р4 тогда как в литре значительно менее полярного хлороформа при той же температуре растворяется 25 г данного вещества. К тому же, ацетон не нужно смешивать с водой до нужной концентрации, как этанол. Встряхивая навеску белого фосфора в ацетоне при комнатной температуре, мы не наблюдали ее растворения. Поскольку в низких концентрациях ацетон легко усваивается микроорганизмами в качестве источника углерода (Hausinger, 2007), переходя далее к процедуре эмульгирования белого фосфора ультразвуком мы не стремились удалять остатки ацетона из шленка с навеской.
В опыте со стерильной средой стерилизация навески белого фосфора ацетоном в шленке показала, что навеска растворяется мало, т.е., растворитель выбран удачно. Тем не менее, частичное растворение наблюдалось. Так, при вливании ацетона после стерилизации в раствор медного купороса наблюдается выпадение густого черного осадка (реакция на Р4). При испарении этого ацетона наблюдались вспышки белого фосфора с выделением белого дыма. Соответственно, масса навески после стерилизации несколько уменьшалась. В данном посеве эмульсия белого фосфора готовилась не в дистиллированной воде, а в физиологическом растворе, изотоничном внутренней среде живых клеток и создающем более благоприятные условия для роста микроорганизма. Культура A. niger АМ1, взятая для посева, до него росла в среде идентичного состава, с 0.2% Р Через 29 суток рост отсутствовал: культура за период хранения утратила всхожесть. В те же среды сеяли культуру A. niger АМ1. Через 20 суток на поверхности сред наблюдался воздушный мицелий (колонии диаметром 1-3 мм, покрывающие всю поверхность сред) желтоватого цвета; отмечалось появление первых конидиеносцев со спорами черного цвета. В контрольных средах рост отсутствовал даже спустя 117 дней, они остались прозрачными без
опалесценции и взвесей. Это указывает на то, что стерилизация навесок Р4 ацетоном эффективна.
Существовало обоснованное опасение, что «метаболизм» и «биодеградация» белого фосфора на самом деле представляют собой абиотическое диспропорционирование в присутствии ионов переходных металлов. Их соли всегда присутствуют в средах для культивирования микроорганизмов, поскольку металлы являются биогенными микроэлементами и входят в активные центры многих ферментов (Бертини и др., 2013а Ь). Тем более, что внесение эмульсии Р4 в культуральные среды всегда сопровождается образованием взвеси черного цвета, оседающей на дно как в реакции белого фосфора с медным купоросом. Однако, при комнатной температуре Р4 реагирует только с ионами меди. Проведенный расчет показал, что в используемых культуральных средах белый фосфор присутствует в избытке от одного до четырех порядков. Белый фосфор реагирует с ионами меди в молярном соотношении 9:40 (т.е. при избытке меди), а содержание пятиводного сульфата меди в среде Придхем-Готлиба настолько мало (0.1 г/л, при среднем объеме среды в чашке Петри 20 мл), что даже при минимальной использованной концентрации белого фосфора 0.001% по массе его молярное содержание в 25 раз выше (1). Поэтому он не может целиком прореагировать с ними, по крайней мере, за короткий срок. Следовательно, большая часть его взаимодействует с клетками микроорганизмов. Этот факт, наряду с аргументами, полученными нами ранее, свидетельствует в пользу метаболизма белого фосфора.
9Р4 + 40С^04 + 64Н20 ^ 16Н3Р04 + 10Си| + 10Си3Р2| + 40Н£04
При максимальной концентрации Р4 1% его содержание в молях превышает содержание медного купороса уже в 25000 раз, т.е. белый фосфор не может полностью прореагировать с двухвалентной медью (Миндубаев и др., 2016Ь). Поэтому значительная его часть обезвреживается все-таки микроорганизмами. Разумеется, любой метаболический процесс, особенно в случае микроорганизмов, всегда сопровождается абиотическими химическими реакциями. В природе абиотические и биотические процессы неотделимы, а зачастую неотличимы друг от друга.
Заключение
Результаты посева А. niger АМ1 в среду, содержащую одновременно фосфат и белый фосфор показал, что данный штамм не только
устойчив к высоким концентрациям белого фосфора. Белый фосфор, по крайней мере, в концентрации 0.2% в отношении A. niger не обнаружил токсичности. Используя в качестве источника фосфора легкодоступный растворенный фосфат, гриб растет в присутствии белого фосфора с такой же скоростью, как и в его отсутствии. По всей видимости, замедленное развитие устойчивого штамма в средах с белым фосфором без фосфата объясняется не токсическим действием, а сравнительно малой доступностью белого фосфора в качестве источника биогенного элемента.
Если принять во внимание, что A. niger АМ1 изначально был выделен из химического реактива белого фосфора, вместе с которым он был случайно внесен в среду, то вполне возможно, что устойчивость у него возникла задолго до начала наших исследований, например, в условиях предприятия, производящего белый фосфор. Подобные результаты противоречат имеющемуся статусу белого фосфора как биоцида, что дает основания для его пересмотра.
До сих пор невозможность стерилизации сред с Р4 была серьезным фактором, сдерживавшим дальнейшее развитие микробиологических исследований. Предлагаемый эффективный способ стерилизации навесок белого фосфора ацетоном позволяет делать пересевы микроорганизмов без риска занесения посторонней микрофлоры с навесками Р4.
Список литературы
1. Бертини И., Грей Г., Стифель Э., Валентине Дж. Биологическая неорганическая химия: структура и реакционная способность // БИНОМ. 2013 а. Т.1. 456 с.
2. Бертини И., Грей Г., Стифель Э., Валентине Дж. Биологическая неорганическая химия: структура и реакционная способность // М.: БИНОМ. 2013 b. Т.2. 623 с.
3. Миндубаев А.З., Алимова Ф.К., Волошина А.Д., Горба-чук Е.В., Кулик Н.В., С.Т. Минзанова, Р.И. Тухбатова, Яхва-ров Д.Г. Способ детоксикации белого фосфора с применением штамма микроорганизмов Trichoderma asperellum ВКПМ F-1087. Патент на изобретение № 2603259 от 1.11.2016 а.
4. Миндубаев А.З., Бабынин Э.В., Волошина А.Д., Са-хапов И.Ф., Яхваров Д.Г. Изучение генотоксичности белого фосфора // Российский журнал прикладной экологии. 2017 a. № 2. С. 40-44.
5. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Валидов Ш.З., Кулик Н.В., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Яхваров Д.Г., Аккизов А.Ю. Рост культуры Aspergillus niger АМ1 в среде с двумя источниками фосфора. Обоснованность определения «биодеградация» в отношении белого фосфора // Бутлеровские сообщения. 2016 b. Т. 46. №5. С.1-20.
6. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Валидов Ш.З., Яхваров Д.Г. Биодеградация белого фосфора // Природа. 2017 b. № 5. С. 29-43.
7. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Алимова Ф.К., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Сапар-мырадов К.А., Хаяров Х.Р., Яхваров Д.Г. Включение белого
фосфора в природный круговорот веществ. Культивирование устойчивой микрофлоры // Бутлеровские сообщения. 2015 а. Т. 41. № 3. С. 54-81
8. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Алимова Ф.К., Яхваров Д.Г. Возможность обезвреживания промышленных стоков, содержащих белый фосфор, при помощи микрофлоры // Российский журнал прикладной экологии. 2015 b. № 3. С. 42-47.
9. Миндубаев А.З., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Яхваров Д.Г. Влияние зеленой массы амаранта на скорость деградации белого фосфора // Российский журнал прикладной экологии. 2017c. №1. С. 50-54.
10. Миндубаев А.З., Сапармырадов К.А., Горбачук Е.В., Панкова А.В. Селекция микроорганизмов на устойчивость к белому фосфору // Российский журнал прикладной экологии. 2016. № 2. С. 42-46.
11. Миндубаев А.З., Сапармырадов К.А., Алимова Ф.К. Сравнение антагонистических свойств стрептомицетов из различных биотопов // Российский журнал прикладной экологии. 2016 d. № 3. С. 28-32.
12. Хоменков В.Г., Шевелёв А.Б., Жуков В.Г., Загустина Н.А., Безбородов А.М., Попов В.О. Организация метаболических путей и молекулярно-генетические механизмы биодеградации ксенобиотиков у микроорганизмов (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т.44, №2. С. 133-152.
12. Engelking L.R. Textbook of Veterinary Physiological Chemistry. Academic Press, 2015. 786 p.
13. Hausinger R.P. New Insights into Acetone metabolism // J. Bacteriol. 2007. V.189, №3. P. 671-673.
14. McDonnell G., Russell A.D. Antiseptics and Disinfectants: Activity, Action, and Resistance // Clinical Microbiology Reviews. 1999. V. 12, №1. P. 147-179.
A.Z. Mindubaev, A.D. Voloshina, N.V. Kulik, I.F. Sakhapov, Sh.Z. Validov, D.G. Yakhvarov. Growth of the fungus aspergillusin a medium with white phosphorus and phosphate. Sterilization of white phosphorus samples.
Inoculation of A. niger AMI in a medium containing two sources of phosphorus (phosphate and white phosphorus) demonstrated that P4 does not exhibit toxic properties in relation to this microorganism.lt grows at the same rate in the presence of white phosphorus as in its absence. This is the only example of the absence of toxicity of white phosphorus for a living organism.The calculation showed that the concentration of copper salts contained in the modified Pridham-Gottlieb medium is too small for abiotic disproportionation of the appliedwhite phosphorus.Therefore there is a reason to talk about biodegradation.Inoculation of A. niger AM1 in a medium with the white phosphorus sterilized with acetonedemonstrated absence ofgrowth in the control medium after 117 days.This indicates that the sterilization of the P4 samples with acetone is effective.
Keywords: biodegradation; white phosphorus; culture mediums; Aspergillus niger AMI.
4!
российский журннл орииной экологии
