CC BY
28
ОКИСЛЕНИЕ БЕЛОГО ФОСФОРА ЧЕРНЫМ АСПЕРГИЛЛОМ. ПОЯВЛЕНИЕ МУТАНТНОИ КУЛЬТУРЫ ASPERGILLUS NIGER AMI
УДК 579.695; 546.85; 502.55; 661.63
'А.З. Миндубаев, 'А.Д. Волошина, 'Е.К. Бадеева, 2Х.Р. Хаяров, 'Д. Г. Яхваров
'Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН,
mindubaev-az@yandex.ru 2 Казанский (Приволжский) федеральный университет
ОКИСЛЕНИЕ БЕЛОГО ФОСФОРА ЧЕРНЫМ АСПЕРГИЛЛОМ. ПОЯВЛЕНИЕ МУТАНТНОЙ КУЛЬТУРЫ ASPERGILLUS NIGER AMI
Исследована динамика превращений белого фосфора в культуральной среде, в которой рос Aspergillus niger АМ1, в сравнении со стерильной средой, методом ЯМР. Показано, что белый фосфор трансформируется в смесь продуктов - фосфат, фосфит, гипофосфит. Аспергилл не окисляет фосфит и гипофосфит, но совершенно устойчив к этим соединениям, обладающим выраженным фунгицидным действием. Отмечено появление мутантной культуры A. niger АМ1, более интенсивно растущей в среде с белым фосфором по сравнению с предковым штаммом и обладающей необычной морфологией.
Ключевые слова: белый фосфор; Aspergillus niger АМ1; культуральные среды; ядерный магнитный резонанс; мутация.
Введение
В предыдущих наших работах (Миндубаев и др., 2015; Миндубаев и др., 2016а,Ь; Миндубаев и др., 2017а,ЬД Миндубаев и др., 2018) было дано описание биологического обезвреживания белого фосфора. Несмотря на наличие роста микробных культур в средах с белым фосфором, однозначных доказательств биодеградации этого вещества до настоящего времени не существует. Только с применением стерилизации навесок белого фосфора ацетоном появилась возможность сравнивать превращения Р4 в стерильной среде и в присутствии растущей культуры микроорганизма (Миндубаев и др., 2017c).
Для наблюдения превращений соединений фосфора в культуральных средах мы решили применить метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР), поскольку по химическим сдвигам сигналов ядер атомов элемента можно достаточно точно устанавливать их атомное окружение, а следовательно, и строение молекул (Нифантьев, Ивченко, 2006). Для соединений фосфора метод ЯМР особенно хорошо подходит, поскольку природный фосфор на 100% состоит из магнитно активного изотопа фосфор-31. Таким образом, методом ЯМР можно обнаруживать фосфор даже в сравнительно низкой концентрации (Letcher, Van Wazer, 1966).
Методика исследования
Методика посев Aspergillus niger АМ1 описана нами ранее (Миндубаев и др., 2017b,c). Спектры 31Р ЯМР были сняты через 78 суток после посе-
ва. С целью приготовления образцов для съемки спектра среды отбирались при помощи инсулино-вых шприцев. Опытную среду очищали от гифов гриба при помощи фильтра Millex®-HV с диаметром пор 0.45 мкм (Syringe-driven Filter Unit), надеваемого на шприц. Параметры съемки спектров: Bruker Avance III 400 МГц 31P{1H} - (161.9 МГц, 25 °C). Количество сканов: для контроля 79000, для опыта 200000.
Культуру A. niger АМ1 пересеивали через 119 суток. Навеску белого фосфора с содержанием 0.2% использовали с предыдущего посева. В три колбы посеяли аспергилл, в четвертой среду оставили стерильной. 1 мл этой среды был использован в исследовании ее генотоксичности методом SOS-lux теста, описанном в работе (Миндубаев и др., 2017а). Культуры росли в термостате при 25 °С. Через 53 суток после посева в опытные и контрольный варианты добавляли равный объем культуральной среды с целью стимуляции поглощения фосфора культурами гриба. Через 78 суток после посева культуры убрали в холодильник, где они продолжали храниться при 4 °С.
Пробы для спектров ЯМР были отобраны через 13, 20, 35, 63 и 138 суток после посева. Начиная с 20 суток выполнялась съемка протонных спектров 1Н, где предварительно добавляли в образцы сред тяжелую воду D2O из расчета 0.1 мл дейтерированной воды к 0.3 мл среды, до высоты столба жидкости в ампулах для съемки спектров ЯМР 4 см. Дейтерированная вода хранилась в запаянной стеклянной ампуле.
Через 180 дней после посева произведен пере-
28
российский журнал прим экологии
сев исследуемой культуры A. niger АМ1 в богатую среду Лурия-Бертани (LB) и визуальное морфологическое исследование колонии.
Результаты и их обсуждение
Спектры 31Р ЯМР, снятые с контрольной и опытной сред, показали одинаковый результат. В обоих спектрах присутствует только один сигнал: в опыте при 0.42 ppm, в контроле при 0.47 ppm, т.е. сигнал принадлежит одному веществу - фосфату. Таким образом, за 80 суток эксперимента весь мелкодисперсный белый фосфор в средах окислился кислородом воздуха до фосфорной кислоты даже без участия микроорганизмов. Следовательно, для оценки влияния микроорганизмов на процесс окисления Р4 следует проводить анализ через более короткий срок.
После пересева культуры A. niger АМ1 первые признаки роста (появление бахромы субстратного мицелия белого цвета вокруг старых колоний) стали наблюдаться через 6 суток. Через 11 суток колонии образовали воздушный мицелий, окрасившийся в темно-желтый цвет. Через 12 суток появились первые конидиеносцы. Через 49 суток во всех повторах колонии были покрыты черной россыпью спор. Это доказывает, что и в среде с белым фосфором аспергилл может сохранять нормальную фертильность. Обращает на себя внимание тот факт, что в одном повторе колония стала развиваться быстрее, чем в других, хотя условия были совершенно идентичны. Различия в скорости роста стали наблюдаться через 19 суток. Возможно, это следствие мутации, обеспечившей лучшую приспособленность к необычным (и экстремальным) условиям существования.
После добавления равного объема культураль-ной среды на 53 день между лидирующей в росте культурой и остальными накопилось еще больше различий. Через 55 суток после посева лидирующая культура стала вырабатывать пигмент и приобретать более насыщенную желтую окраску. Через 59 суток окраска лидирующей колонии была визуально охарактеризована как темно-оранжевая. Колонии в остальных двух повторах растут медленнее и имеют гораздо более светлую окраску. Окрасилась не только колония, но и культу-ральная среда, т.е. пигмент хорошо растворим в воде.
Через 13 суток отобрали пробы для съемки спектров 31Р со стерильной среды и среды с будущим «рыжим» грибом. Из трех колб с грибом выбрали ту, в которой меньше всего осталось черного осадка (судя по всему, колония аспергилла в ней имеет самый интенсивный метаболизм). Стерильная среда на тот момент была прозрачная
и без взвесей, признаков роста микроорганизмов в ней не было. Поскольку заранее мы не могли знать, какие соединения фосфора образовались в среде, снимали всю область.
На 13 сутки в ЯМР спектре проявился один уширенный сигнал с вершиной при 2.43 ррт (табл.). Уширение сигнала наблюдается, вероятно, за счет присутствия в среде смеси близких по строению соединений фосфора, сигналы которых сливаются в один. Следует отметить, что фосфат проявляется в области 0 ррт (SanшgraЫ, 1^а11, 2005). Поэтому возникло предположение, что гриб в процессе роста активно поглощает фосфат, и оставляет в среде восстановленные соединения фосфора, например, фосфит, для которого как раз характерен сигнал в области 3 ррт. Это предположение укрепилось после того, как был снят спектр со стерильной среды. В нем также присутствует уширенный сигнал, но с вершиной при 0.99 ррт (табл.).
Возможно, такая картина была сформирована за счет наложения сигналов фосфата, фосфита и гипофосфита. Поскольку среда стерильная, в среде отсутствовали живые организмы, которые могли бы поглощать образовавшийся в ней фосфат. Этому эффекту можно найти и другое объяснение - поскольку гриб в процессе роста сбраживает глюкозу до органических кислот, происходит за-кисление среды, способное приводить к сдвигу шкалы спектра. Однако, в последующих спектрах, в среде с добавлением тяжелой воды, шкала выравнивалась по дейтерию, а смещение в средах с аспергиллом все равно наблюдалось.
Ту же самую картину (смещение сигнала на 2.5 ррт в опыте) можно было наблюдать и в последующих парах спектров (табл.). Добавление равного объема модифицированной культураль-ной среды Придхема-Готлиба на 53 сутки после посева не привело к заметному изменению картины в спектрах. В спектрах, снятых через 138 суток после посева, смещение сигнала уже не происходило - в обоих средах сигнал имел вершину в области 0.95-0.99 ррт. Вероятно, к этому времени началось отмирание биомассы гриба, и поглощенный ею фосфат путем диффузии снова вернулся в среду.
Поскольку спектры 31Р ЯМР оказались малоинформативными, начиная с 20 суток после посева параллельно выполнялась съемка 1Н ЯМР спектров с этих же образцов, что позволило получить больше информации. Если 31Р ЯМР позволяет видеть сигналы атомов фосфора, то 1Н ЯМР демонстрирует протоны, связанные с атомами фосфора.
В области слабых полей (6.9-7.2 ррт) спек-
1/2018
29
ОКИСЛЕНИЕ БЕЛОГО ФОСФОРА ЧЕРНЫМ АСПЕРГИЛЛОМ. ПОЯВЛЕНИЕ МУТАНТНОЙ КУЛЬТУРЫ ASPERGILLUS NIGER AMI
Таблица. Спектры НЯМР, снятые с опытной и контрольной сред
Среда с A. niger Стерильная среда
День Химический сдвиг, ppm День Химический сдвиг, ppm
13 2.43 13 0.99
20 2.00 20 0.73
35 2.37 35 0.35
63 2.14 63 0.58
138 0.99 138 0.95
тров 1Н ЯМР расположена группа очень необычных сигналов, которые в первую очередь обращают на себя внимание (рис.). Из них три более и три менее интенсивные, совершенно идентичные и правильно чередующиеся. Первоначально было сделано предположение, что это гексаплет, образуемый одним веществом. Интересно, что именно в этой области спектра должны проявляться протоны, связанные с атомом фосфора. Однако съемка спектра с подавлением фосфора не выявила различий (протоны при фосфоре должны были при этом изменить плетность). Поскольку сигналы одинаковы по высоте и расположены очень близко друг к другу, это не гексаплет, а, вероятно, сигналы трех очень близких по строению веществ, возможно, оптических изомеров. Эта группа сигналов появляется только после внесения в модифицированную среду Придхем-Готли-ба белого фосфора. В исходной среде без источников фосфора этих сигналов нет. Таким образом,
либо мы имеем дело с продуктами превращения белого фосфора, либо с веществами, не содержащими фосфор, но образовавшимися в результате реакций с Р4. Отдельно следует подчеркнуть, что это вещество (или группа веществ) очень устойчиво и не разлагается ас-пергиллом, хотя и не препятствует его развитию. Есть предположение, что данные сигналы принадлежат катионам гидрония ОН3+, образовавшимся в результате диссоциации
т—1 00 LO
СМ о ОЛ
* • •
о \ /
I I I
Рис. Фрагмент спектра Н ЯМР
кислот фосфора. В результате дейтерообмена могли образоваться частично дейтерированные катионы, этим и объясняется появление нескольких сигналов. Тем не менее, вопрос об идентификации данной группы сигналов остается дискуссионным. К сожалению, в спектрах не было отмечено сигналов протонов при атоме фосфора, которые нас интересовали в первую очередь. Возможно, они замаскированы сигналом протонов воды, и для их идентификации требуется съемка спектров в неводном растворителе. Таким образом, менее информативные спектры 31Р ЯМР демонстрируют, что гриб не потребляет (или потребляет очень медленно) соединения фосфора в промежуточных степенях окисления.
Конечной целью данной работы является сравнение состава стерильной и опытной сред для того, чтобы установить, участвует аспергилл в окислении белого фосфора и его продуктов до фосфата, или он вырабатывает устойчивость к восстановленным соединениям фосфора и живет в их присутствии. Для этого следует определиться, в какие соединения превращается белый фосфор после внесения в модифицированную среду Придхем-Готлиба. Образование черного осадка указывает на образование фосфидов металлов. В работе (Акбаева и др., 2015) сообщается о том, что в водной среде при температуре 50-70 °С в присутствии кислорода и катализатора - солей меди - желтый фосфор окисляется до смеси фосфористой и фосфорной кислот в течение 20-40 мин. Отмеченный нами рост аспергилла происходит при 25 °С, а после 78 суток - при 4 °С. К тому же, концентрация ионов двухвалентной меди в среде Придхем-Готлиба очень мала, тогда как в катализаторе (Акбаева и др., 2015) концентрация меди высокая. С другой стороны, временной интервал, в котором велись наблюдения, очень велик и вполне достаточен для полного окисления белого фосфора и его производных. К сожалению, метод ЯМР в данном случае оказался малоинформативным. 31Р ЯМР показал уширенный сигнал, образовавшийся при наложении сигналов кислот фосфора, а 1Н ЯМР вообще не позволил увидеть соединения фосфора в культуральных средах. К сожалению, достоверные различия в составе соединений фосфора в стерильной среде и в среде с растущим «рыжим» грибом установить не удалось, из чего следует вывод, что гриб не усваивает фосфор в промежуточных степенях окисления, либо усваивает их очень медленными темпами.
Культура «рыжего» А. niger АМ1 после пересева через 180 суток имела необычную морфологию. Воздушный мицелий низкий, споры формируются здесь почти на поверхности среды. В пер-
30
российский журннл ориклний экологии
вые двое суток культура отличалась от предковой выделением в среду желтого пигмента, но после созревания спор становилась такой же черной и неотличимой. Это является еще одним свидетельством того, что в культуре произошла мутация. Впрочем, требуется более детальное изучение морфологии этого аспергилла. Судя по тому, что «рыжий» гриб эффективнее набирал биомассу в среде с белым фосфором, эта мутация повышает его приспособленность к существованию в данной среде.
Заключение
В ходе эксперимента обнаружено спонтанное появление в среде с белым фосфором культуры Aspergillus niger АМ1 с измененной морфологией и окраской, быстрее растущей в среде с исследуемым ксенобиотиком. Метод ЯМР не подтвердил факт полной биодеградации белого фосфора культурой черного аспергилла. Продукты неполного окисления Р4 сохраняются даже спустя сто с лишним суток после начала культивирования микроорганизма. В этой связи целесообразно изучить динамику окисления белого фосфора другими культурами микроорганизмов.
Использованная в работе концентрация белого фосфора в среде находилась на пороге обнаружения методом ЯМР. Возможно, с этим связаны уширения сигналов, вплоть до их слияния, в спектрах 31Р, и отсутствие интересующих сигналов в спектрах 1Н.
За весь период эксперимента роста «рыжий» A. niger АМ1 не окислил до конца восстановленные соединения фосфора. Одна из возможных причин этого кроется в избыточном содержании фосфора в культуральной среде Придхем-Готли-ба. Чтобы убедиться в незначительности влияния содержащихся в среде ионов меди на процесс превращения Р4, следует провести её дальнейшую модификацию.
Список литературы
1. Акбаева Д.Н., Сейлханова Г.А., Бектигулова А.Н., Кен-жалина Ж.Ж., Имангалиева А.Н., Копышев А.М., Полимбе-това Г.С., Ибраимова Ж.У., Борангазиева А.К. Каталитическая система на основе полиакриловой кислоты и хлорида меди (II) в реакции окисления желтого фосфора // Известия Национальной академии наук Республики Казахстан. 2015. Т.4. №5. С. 12-17.
2. Миндубаев А.З., Бабынин Э.В., Волошина А.Д., Са-хапов И.Ф., Яхваров Д.Г. Изучение генотоксичности белого фосфора // Российский журнал прикладной экологии. 2017a. № 2. С. 42-46.
3. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Бабынин Э.В., Бадеева Е.К., Хаяров Х.Р., Минзанова С.Т., Яхваров Д.Г. Микробиологическая деградация белого фосфора // Экология и промышленность России. 2018. Т. 22, № 1. С. 33-37.
4. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Алимова Ф.К., Яхваров Д.Г. Возможность обезвреживания промышленных стоков, содержащих белый фосфор, при помощи микрофлоры // Российский журнал прикладной экологии. 2015. № 3. С. 42-47.
5. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Кулик Н.В., Сахапов И.Ф., Валидов Ш.З., Яхваров Д.Г. Рост гриба аспергилла в среде с белым фосфором и фосфатом. Стерилизация навесок белого фосфора // Российский журнал прикладной экологии. 2017b. № 3. С. 37-40.
6. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Хаяров Х.Р., Сахапов И.Ф., Бадеева Е.К., Стробыкина А.С., Валидов Ш.З., Бабаев В.М., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Акосах Й.А., Яхваров Д.Г. Динамика превращений белого фосфора культурой черного аспергилла // Бутлеровские сообщения. 2017c. Т. 51, № 8. С. 1-26.
7. Миндубаев А.З., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Яхваров Д.Г. Влияние зеленой массы амаранта на скорость деградации белого фосфора // Российский журнал прикладной экологии. 2017d. №1. С. 50-54.
8. Миндубаев А.З., Сапармырадов К.А., Горбачук Е.В., Панкова А.В. Селекция микроорганизмов на устойчивость к белому фосфору // Российский журнал прикладной экологии. 2016a. № 2. С. 42-46.
9. Миндубаев А.З., Сапармырадов К.А., Алимова Ф.К. Сравнение антагонистических свойств стрептомицетов из различных биотопов // Российский журнал прикладной экологии. 2016b. № 3. С. 28-32.
10. Нифантьев И.Э., Ивченко П.В. Практический курс спектроскопии ядерного магнитного резонанса. М.: МГУ, 2006. 200 с.
11. Letcher J.H., Van Wazer J.R. Theoretical Interpretation of 31P NMR Chemical Shifts // The Journal of Chemical Physics. 1966. V. 44, № 2. P. 815-829.
12. Sannigrahi P., Ingall E. Polyphosphates as a source of enhanced P fluxes in marine sediments overlain by anoxic waters: Evidence from 31P NMR // Geochem. Trans. 2005. V. 6, № 3. P. 52-59.
A.Z. Mindubaev, A.D. Voloshina, E.K. Badeeva, Kh.R. Khayarov, D.G. Yakhvarov. Oxidation of white phosphorus by black aspergill. Emergence of a mutant culture Aspergillus niger AM1.
The dynamics of the transformation of white phosphorus in the culture medium in which Aspergillus niger AMI grew, in comparison with the sterile medium, by the NMR method, was studied.It is revealed that white phosphorus is transformed into a mixture of products - phosphate, phosphite, hypo-phosphite. Aspergillum does not oxidize phosphite and hypophosphite, but is completely resistant to these compounds, which has a pronounced fungicid-al effect.The emergence of the mutant A. niger AMI culture, which is growing more intensively in the medium with white phosphorus than in the ancestral strain and having an unusual morphology is noted.
Keywords: white phosphorus; Aspergillus niger AMI; culture media; nuclear magnetic resonance; mutation.
1/2018
31
