CC BY
79
УДК 579.695; 546.85; 502.55; 661.63
'А.З. Миндубаев, 2К.А. Сапармырадов, 2Е.В. Горбачук, 2А.В. Панкова
1Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН,
mindubaev-az@yandex.ru 2Казанский (Приволжский) федеральный университет
СЕЛЕКЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ НА УСТОЙЧИВОСТЬ
К БЕЛОМУ ФОСФОРУ
Впервые зарегистрировано и изучено развитие микроорганизмов на синтетических культу-ральных средах, содержащих белый фосфор в качестве единственного источника фосфора. В данных средах микроорганизмы росли и не испытывали фосфорного голодания. Экспериментально показано, что максимальная концентрация белого фосфора в среде соответствует превышению его ПДК в сточных водах в 5000 раз.
Ключевые слова: детоксикация; белый фосфор; Bacillus, Streptomyces sp. А8; Aspergillus niger АМ1; Trichoderma asperellum F-1087; культуральные среды; селекция.
Введение
Предыдущие работы авторов (Миндубаев и др., 2014 (b)) позволили пролить свет на практически неизученный вопрос токсичности белого фосфора для прокариот. Однако главная цель работы - доказательство биологической деградации белого фосфора, активное участие в процессе его обезвреживания микроорганизмов, до сих пор не была достигнута. Результаты представленного исследования служат аргументом в пользу биодеградации. Нами наблюдалось включение белого фосфора в природный круговорот этого элемента. Кроме того, наблюдалась адаптация микроорганизмов к возрастающим концентрациям белого фосфора в средах, вплоть до его содержания 1% по массе (что соответствует превышению ПДК в сточных водах в 5000 раз (Barber, 1996)). Это открывает перспективы для практического применения метода биодеградации для ликвидации загрязнений белым фосфором. Также, были проведены исследования по выращиванию микроорганизмов в средах с белым фосфором в качестве единственного источника фосфора. При этом впервые наблюдался рост устойчивости микроорганизмов. Так, если исходная культура черного аспергилла росла при концентрации белого фосфора в среде до 0.5% по массе, а стрептомицетов - до 0.2% (Миндубаев и др., 2015 (b)), то после седьмого пересева те же самые культуры росли при концентрации Р4 в среде до 1% (Миндубаев и др., 2015 (а)). Для дальнейшей, более углубленной работы с выделенным устойчивым к белому фосфору штаммом гриба, была необходима его идентификация с привлечением методов генетического анализа. Ставилась цель определить видовую принадлежность плесневого гриба, по морфологическим признакам предварительно отнесенно-
го к виду черный аспергилл (Aspergillus niger), а также зарегистрировать полученный нами новый штамм (к тому же один из первых, устойчивых к белому фосфору) в международной базе нукле-отидных последовательностей GenBank (Миндубаев и др., 2015 (a)).
Материалы и методы исследования
Культуры бактерий были идентифицированы на приборе Bruker Daltonik MALDI Biotyper на базе протеомного центра КФУ. Идентификация проводилась на основе анализа белкового состава микробной клетки.
Нами впервые произведен посев устойчивой микрофлоры в искусственную культуральную среду, содержащую в качестве единственного источника фосфора белый фосфор, и наблюдался рост в этой среде. Посев чистой культуры Bacillus subtilis из субстрата с исходным содержанием белого фосфора 0.1% производился в модифицированную среду Придхем-Готлиба. Классическая среда Придхем-Готлиба не содержит источники углерода: в качестве таковых выступают нефтепродукты. Наша модификация включает глюкозу, но не содержит источники фосфора (в качестве такового выступает белый фосфор). Посев Aspergillus niger, споры которого были внесены вместе с белым фосфором, производили в аналогичную среду, источник фосфора в которой - белый фосфор в концентрации 0.01 и 0.05% по массе. В контрольные среды К (+) вносился фосфат. В контрольные среды К (-) источники фосфора не вносились. Белый фосфор диспергировали в стерилизованной автоклавированием дистиллированной воде. Изначально планировался посев устойчивых бацилл, однако в среды попали споры A. niger, вероятно, с белым фосфором, кото-
42
российский журнал приютной экологии
рый не подвергался стерилизации. Произвели посев выросших A. niger в контрольные среды К (+) и К (-). Второй пересев A. niger произведен в среды аналогичного состава, третий - в среды с увеличенной концентрацией белого фосфора: 0.05, 0.1 и 0.2% по массе. Аналогично был произведен посев Streptomyces sp., выделенного из осадков сточных вод (ОСВ) с 0.01% белого фосфора, по-видимому, соответствующий или родственный Streptomyces sp. A8, описанному в работе (Болормаа и др., 2014). Четвертый пересев проводился в среды с концентрацией белого фосфора 0.5 % по массе.
Бактерии Pseudomonas alcaliphila, выделенные на кафедре биохимии КФУ, высевали в среды идентичного состава, содержащие 0.01 и 0.05% белого фосфора, в чашки Петри и в плоскодонные колбы на 50 мл с целью создания накопительных культур. Оптическая плотность измерялась на фотоэлектроколориметре АР-101 (Apel, Япония) при длине волны 540 нм. Второй посев той же культуры P. alcaliphila был произведен через 42 дня.
Для определения антибиотической активности Streptomyces sp. A8, выделенного из осадка с белым фосфором, в качестве тест-организмов использованы бактерии Bacillus megaterium и Pseudomonas putida, пекарские дрожжи Saccharomy-ces cerevisiae. Для определения фитотоксичности использовались семена сорных растений щирица запрокинутая (Amaranthus retroflexus) и лебеда го-лостебельная (Atriplex nudicaulis), а также одноклеточная зеленая водоросль (Chlorella vulgaris). Секвенирование фрагмента гена 16S РНК S. sp. A8 с целью установления его видовой принадлежности, проводили в ЗАО Евроген (г. Москва) (Болормаа и др., 2014; Миндубаев и др., 2015 (b)).
Посев A. niger АМ1, T. asperellum F-1087 и Streptomyces sp. A8 производили в среду ПГА (Миндубаев и др., 2015 (а); Миндубаев и др., 2015 (b)). В качестве источника фосфора в среде был использован белый фосфор в концентрации 0.01 и 0.05% по массе. Через 60 дней биомассу микро-мицетов и актиномицетов пересевали на концентрации белого фосфора 0.05, 0.1 и 0.2%. После следующих 60 дней штаммы пересевали на более высокие концентрации Р4 0.5, и 1%.
Был произведен посев S. sp. А8 из среды с фосфатом и S. sp. А8 из среды с содержанием белого фосфора 0.5% (при которой не наблюдался рост микроорганизмов) в среду Сабуро, с целью сравнения устойчивости этих двух линий микроорганизма.
Метаболическое профилирование S. sp. A8 проводили с помощью системы GEN III
OmniLog® II Combo Plus (Biolog, Inc., Хейворд, США) на микропланшетах GEN III. Планшеты были инокулированы штаммами S. sp. А8 в двух повторах согласно протоколу производителя и инкубировались при 28°С (Garland, Mills, 1991). Определяли оптическую плотность при 590 нм по снижению тетразолия фиолетового, который реагирует на окисление субстратов, через каждые 24 часа.
Генетический анализ проводился следующим образом. Образцы ДНК из культуры гриба A. niger АМ1 выделялись по методике, описанной в (Sambrook, Russell, 2001). Далее проводилась по-лимеразная цепная реакция (ПЦР) полученных фрагментов ДНК.
Результаты и их обсуждение
Анализ рибосомных белков, проведенный на кафедре биохимии Казанского федерального университета, позволил обнаружить пять видов бактерий: Pseudomonas alcaliphila, Raoultella terrigena, Paenibacillus polymyxa, Lysinibacillus boronitolerans, Bacillus megaterium. Псевдомонады и ряд бацилл известны как эффективные деструкторы неприродных веществ, однако устойчивость к белому фосфору выявлена для них впервые (Миндубаев и др., 2015 (b)).
Бациллы растут очень интенсивно в среде, содержащей фосфат. В среде без источников фосфора признаки жизнедеятельности вообще не наблюдаются, среда прозрачна, отсутствует показатель брожения глюкозы - выделение газа. Самый интересный результат демонстрирует среда с белым фосфором. В ней присутствуют отдельные мелкие колонии. Наблюдалось выделение газа, что свидетельствовало о росте бацилл с использованием продуктов окисления белого фосфора, включающих незначительные количества фосфата и фосфита.
Посев Aspergillus niger и Streptomyces sp., производили в среду, в которой единственный источник фосфора - белый фосфор в концентрации 0.01 и 0.05% по массе. Рост аспергилла стал неожиданностью. По всей видимости, споры плесневого гриба попали в среды с навесками белого фосфора, стерилизовать который автоклавиро-ванием слишком опасно. В контрольные среды К (+) вносился фосфат. В контрольные среды К (-) источники фосфора не вносились. Белый фосфор диспергировали в стерилизованной ав-токлавированием дистиллированной воде. Через пять суток произвели посев выросших A. niger в контрольные среды К (+) и К (-). Второй пересев аспергилла был произведен в среды аналогичного состава. В средах с 0.01% белого фосфора вырос-
1/2016
43
ло множество мелких колоний A. niger, а в средах с 0.05% - меньшее число колоний, но более крупных. По всей видимости, это означает, что в среде с большей концентрацией ксенобиотика не все споры смогли прорасти. Пересеяли культуру A. niger, выросшую при 0.05% белого фосфора, в контрольные среды К (+) и К (-). В среде К (-) без источников фосфора колонии выросли немногочисленные, занимающие сравнительно большую площадь, но очень слабые (практически прозрачные, с неразвитым мицелием) (рис. 1). По всей видимости, сказалась нехватка фосфора. Любопытно, что в среде с 0.05% белого фосфора колоний выросло меньше, чем в К (+), однако они производят впечатление совершенно нормальных, не испытывающих дефицит питательных веществ (рис. 1). Отсюда следует вывод, что в среде с белым фосфором выживают не все споры гриба, но выжившие обладают способностью использовать в качестве источника фосфора либо сам белый фосфор, либо продукты его химических превращений. Третий пересев был произведен в среды с более высокой концентрацией белого фосфора, 0.05; 0.1 и 0.2% Р с целью адаптации гриба к ней, четвертый - 0.5 %. Последняя, самая высокая концентрация соответствует превышению ПДК белого фосфора в сточных водах в 2500 раз! Несмотря на столь высокое содержание белого фосфора в среде на четвертый день после посева наблюдался рост колоний гриба, хотя и медленный. Тем не менее, результаты посева позволяют заключить, что черный аспергилл переносит присутствие белого фосфора в среде даже в концентрации 0.5%.
Стрептомицеты также устойчиво выдерживают концентрации Р4 вплоть до 0.2%. Внешне колонии актиномицета, выросшие при трех концентрациях белого фосфора, практически не отличались. Было показано, что бактерии Pseudomonas alcaliphila (Миндубаев и др., 2015 (b)), в отличие от грибов и стрептомицетов, не растут в средах, содержащих белый фосфор в качестве единственного источника фосфора.
44
Можно предположить следующую гипотетическую схему биодеградации белого фосфора. На первом этапе Р4 диспропорционирует до смеси фосфидов, гипофосфитов, фосфитов и фосфатов. Далее микроорганизмы употребляют водорастворимые окисленные продукты и тем самым смещают химическое равновесие в сторону дальнейшего окисления фосфора.
Вызывает интерес тот факт, что штамм S. sp. А8 совершенно не проявлял фитотоксическое влияние на оба сорняка (Болормаа и др., 2014). Вероятно, это связано с тем, что в среде обитания этого штамма (осадки сточных вод) отсутствуют высшие растения. По этой же причине большинство штаммов стрептомицетов, в том числе S. sp. А8, не подавляли рост пекарских дрожжей. Зато данный штамм эффективно подавляет зеленые водоросли и бациллы - организмы, близкие к обитающим в сточных водах (Болормаа и др., 2014). В работе (Миндубаев и др., 2014 (а)) сообщается, что представители рода Bacillus также вырабатывают адаптации к присутствию белого фосфора, следовательно, бациллы и S. sp. А8 могут конкурировать даже в условиях сильнейшего химического загрязнения, что не может не вызывать удивление. Этим и объясняется угнетающее влияние S. sp. А8 на B. megaterium. Возможно, и присутствие ядовитого вещества повлияло на свойства культуры, у которой пропала необходимость синтезировать собственные токсины.
На основании полученных данных по морфологии видовая принадлежность штамма А8 была определена как Streptomyces xanthocidicus, но данные по геномике ее не подтвердили. Поэтому правильно продолжать называть штамм Streptomyces sp. A8.
Третий пересев Streptomyces sp. впервые продемонстрировал рост устойчивости микроорганизмов к белому фосфору в процессе селекции. На 22 сутки после посева наблюдался рост стрепто-мицета в среде, содержащей 0.5% белого фосфора. В предыдущих посевах S. sp. рос при концен-
Рис. 1. Первый пересев устойчивых аспергилл. Слева - среда без источника фосфора: на ней наблюдается рост 33 ослабленных колоний аспер-гилла. Вверху - среда с фосфатом: наблюдается рост 49 спорообразующих колоний A. niger. Справа - среда с 0.05% белого фосфора: наблюдается рост 11 крупных спорообразующих колоний A. niger. Чашки сфотографированы через шесть суток после пересева.
рюшй журнал прикладной и!
трациях не более 0.2%, хотя в среде с 0.5% сохранял жизнеспособность, что продемонстрировал посев в среду Сабуро. Разумеется, рост начался после длительной задержки. Даже на 20 сутки после посева признаки роста были неочевидными. На 22 сутки стрептомицет представлял собой субстратный мицелий. В среде с 0.2% белого фосфора рост происходил значительно быстрее - уже на 13 сутки колонии имели воздушный мицелий, т.е. микроорганизм готовился к спороношению. На 27 сутки & sp. при 0.2% белого фосфора уже приступил к спороношению, а при 0.5% студенистая колония занимает значительную часть объема среды. На 27 сутки после шестого посева A. niger наблюдается начало роста гриба в среде с 1% белого фосфора. В предыдущих посевах максимальная концентрация белого фосфора, при которой рос аспергилл, составляла 0.5%. То есть, A. niger, как и стрептомицет, после нескольких пересевов выработал значительно большую устойчивость по сравнению с изначальной. T. asperellum F-1087 в среде с 1% белого фосфора тоже начала расти на 27 сутки: в предыдущем посеве она не могла расти при такой концентрации (возможно, сказывалось стрессовое воздействие при повторном посеве в токсичную среду). При меньших концентрациях белого фосфора аспергилл и три-ходерма уже интенсивно растут. На 44 сутки аспергилл и триходерма уже сформировали значительный по объему субстратный мицелий в среде с 0.5% белого фосфора: он имеет вид бесцветной хлопьевидной массы в толще среды. К формированию воздушного мицелия и спороношению они еще не приступили. В среде с 1% белого фосфора грибы на 44 сутки тоже сформировали субстратный мицелий, но заметно меньшего размера (налицо отставание в развитии). & sp. в среде с 0.5% белого фосфора на 44 сутки к спороношению еще не приступил.
Четвертый пересев стрептомицетов продемонстрировал дальнейший рост устойчивости. На четвертые сутки рост стрептомицетов наблюдался в среде с 1% белого фосфора. Колонии были мелкими и имели белый цвет, т.е. еще не приступили к спороношению, а в среде с 0.5% белого фосфора колонии стрептомицетов уже имели более крупный размер и темную окраску, т.е. уже приступили к размножению. Следовательно, устойчивость стрептомицетов заметно возросла по сравнению даже с предыдущим посевом. Грибы развиваются заметно медленнее, тем не менее, в средах с более низким содержанием Р4 рост более интенсивный. На одиннадцатые сутки наблюдается спороношение у стрептомицетов в среде с 1% белого фосфора.
Пересев в среду Сабуро показал следующее. Актиномицет S. sp. А8, пересевавшийся ранее в среды с белым фосфором, сохранил жизнеспособность при концентрации белого фосфора в среде 0.5%, и стал интенсивно расти в среде Сабуро. Следует отметить отсутствие роста S. sp. А8, пересевавшегося в среду с фосфатом. Вероятно, этот микроорганизм, изначально выделенный из ОСВ с белым фосфором, частично утратил устойчивость после длительного культивирования без Р4 , что вызвало его гибель в среде с 0.5% белого фосфора. То есть устойчивость к белому фосфору, также как известные признаки устойчивости к другим ксенобиотикам, является приобретенной и может усиливаться или ослабевать в зависимости от условий культивирования микроорганизмов.
Таким образом, наибольшую приспособляемость к белому фосфору проявили стрептоми-цеты. Через пять последовательных посевов их устойчивость возросла пятикратно. Грибы растут и адаптируются медленнее (у аспергилла после восьми посевов устойчивость выросла вдвое), однако их устойчивость изначально была выше, чем у актиномицетов, особенно у триходермы. Метаболическое профилирование Streptomyces sp. A8 продемонстрировало пищевые предпочтения S. sp. A8. Например, на метилглюкозиде культура растет отлично, а на слизевой кислоте к концу недели ее плотность остается прежней (Миндубаев и др., 2015 (a)).
Для генетической идентификации микромице-та, устойчиво метаболизирующего белый фосфор и по морфологическим признакам отнесенного к виду A. niger, была определена нуклеотидная последовательность его регионов ITS1 и ITS2 (Internal Transcribed Spacer, между 18Sи 25S ри-босомальными генами, включающий 5.8S ген): транскрибируемые спейсеры между генами 18S - 5.8S, и 5.8S - 28S генами рРНК, соответственно. Сравнение полученной последовательности с последовательностями базы данных GenBank с помощью системы BLAST (Altschul et al, 1990) выявила 99% гомологию с ITS1 и ITS2 регионами описанных штаммов Aspergillus niger NJA-1 (Acc. KJ365316.1) и KAML02 (KC119204.1), что позволяет идентифицировать данный микроорганизм, как новый штамм Aspergillus niger. Ему мы присвоили номер A. niger АМ1 (Миндубаев и др., 2015 (a)). Нуклеотидная последовательность штамма направлена в базу данных GenBank, где ей присвоен номер KT805426.
Известно, что белый фосфор нестабилен и легко диспропорционирует в щелочных условиях. Однако, рН осадков сточных вод на протяже-
1/2016
45
нии выдерживания в анаэробных условиях снижается. Сходные процессы закисления сбраживаемого в анаэробных условиях субстрата описаны нами в работе (Миндубаев и др., 2009). рН среды измерялся в непрерывном режиме портативным рН-метром. Свежий ОСВ имеет среду, близкую к нейтральной (рН 7 или чуть выше), а после сбраживания в течение более двух месяцев рН падает до 6 и даже ниже, за счет процессов брожения и накопления органических кислот. Кислая среда способствует росту устойчивости белого фосфора; следовательно, его распад легче объяснить влиянием ферментативных систем микрофлоры, чем абиотической деструкцией. Это служит еще одним аргументом в пользу биодеградации.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 14-08-31091 мол а). Авторы выражают искреннюю признательность Д.Г. Яхваро-ву, А.Д. Волошиной, С.Т. Минзановой и Ш.З. Вали-дову за неоценимую помощь в работе.
Список литературы
1. Болормаа Ч., Сапармырадов К.А., Алимова Ф.К., Миндубаев А.З. Сравнение показателей фитотоксичности, фунгицидной и бактерицидной активности стрептомице-тов из различных местообитаний // Бутлеровские сообщения. 2014. Т. 38, № 6. С. 147-152.
2. Миндубаев А.З., Алимова Ф.К., Ахоссийенагбе С.К., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Яхваров Д.Г. Метаболиты и устойчивая микрофлора в субстратах с содержанием белого фосфора 0.1%// Бутлеровские сообщения. 2014. Т. 37, № 3. С. 67-78.
3. Миндубаев А.З., Ахоссийенагбе С.К., Болормаа Ч., Горбачук Е.В. Разложение белого фосфора микроорганизмами // Сб. науч. трудов республ. молод. экологической конференции, Казань, 2014. С. 74-83.
4. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Ва-лидов Ш.З., Кулик Н.В., Алимова Ф.К., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Белостоцкий Д.Е., Сапармырадов К.А., Тухбатова Р.И., Яхваров Д.Г. Адаптация микроорганизмов к белому фосфору, как результат направленной селекции. Генетическая идентификация устойчивого аспергилла и
метаболическое профилирование стрептомицета А8 // Бутлеровские сообщения. 2015. Т. 44, № 12. С. 1-28.
5. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Алимова Ф.К., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Сапармырадов К.А., Хаяров Х.Р., Яхваров Д.Г. Включение белого фосфора в природный круговорот веществ. Культивирование устойчивой микрофлоры // Бутлеровские сообщения. 2015. Т. 41, № 3. С. 54-81.
6. Миндубаев А.З., Минзанова С.Т., Скворцов Е.В., Миронов В.Ф., Зобов В.В., Ахмадуллина Ф.Ю., Миронова Л.Г., Белостоцкий Д.Е., Коновалов А.И. Оптимизация параметров выработки биогаза в лабораторном масштабе // Вестник Казанского технологического университета. 2009. № 4. С. 233239.
7. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. Basic local alignment search tool // J. Mol. Biol. 1990. V. 215, №3. P. 403-410.
8. Barber J.C. Processes for the disposal and recovery of phossy water // Патент US5549878, заявлен: 24 мая 1995, выдан: 27 августа 1996.
9. Garland J.L., Mills A.L. Classification and characterization of heterotrophic microbial communities on the basis of patterns of community-level sole-carbon-source utilization // Appl. Environ. Microbiol. 1991. V. 57, №8. P. 2351-1359.
10. Sambrook J., Russell D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. V. 1, 2, 3 // Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York. 2001. P. 2001-2344.
A.Z. Mindubaev, K.A. Saparmyradov, E.V. Gor-bachuk, A.V. Pankova. Selection of microorganisms for resistance to white phosphorus.
The growth of inoculated microorganisms on a synthetic culture medium containing white phosphorus as the sole source of phosphorus was recorded and studied for the first time. Inthese media microorganisms were growing and did not experience phosphorus starvation. It is experimentally shown that the maximum concentration of white phosphorus in the media corresponds to the excess of its MPC in wastewater 5 000 times.
Keywords: detoxication; white phosphorus; Bacillus, Streptomyces sp.; Aspergillusniger; Trichoder-maharzianum; culture medium; selection.
российский журнал прикладной экологии
