CC BY
31
УДК 579.695; 546.85; 502.55; 661.63
'А.З. Миндубаев, 'А.Д. Волошина, 2Е.В. Горбачук, 'Н.В. Кулик, 'С.Т. Минзанова, 'Л.Г. Миронова, 2Ф К. Алимова, Д.Г. Яхваров
'Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН, mindubaev@iopc.ru
2 Казанский (Приволжский) федеральный университет
ВОЗМОЖНОСТЬ ОБЕЗВРЕЖИВАНИЯ ПРОМЫШЛЕННЫХ СТОКОВ, СОДЕРЖАЩИХ БЕЛЫЙ ФОСФОР, ПРИ ПОМОЩИ МИКРОФЛОРЫ
Показано, что белый фосфор в осадке сточных вод (ОСВ) окисляется до водорастворимых соединений. Впервые получены культуры микроорганизмов, растущих на субстратах с содержанием белого фосфора до 0.1%. Скорость снижения концентрации Р4 в средах обратно пропорциональна продолжительности лаг-фазы роста микрофлоры. Это указывает на наличие биодеградации белого фосфора.
Ключевые слова: белый фосфор; детоксикация; биодеградация; осадки сточных вод.
Введение
Белый фосфор Р4 широко применяется в промышленности, являясь ключевым соединением при производстве фосфорных удобрений, лекарств, полимеров и ряда других практически значимых веществ и материалов. В то же время, он является одним из самых опасных загрязнителей окружающей среды (Тохюо^юа1 ..., 1997). Хроническое отравление приводит к глубокой инвалидности, с поражением всех систем органов и тканей (Вербовой, 2002). Не исключается попадание белого фосфора в окружающую среду. Достаточно вспомнить экологическую катастрофу на Украине, где в результате железнодорожной аварии воспламенились цистерны с техническим фосфором (Бадюгин, 2009). Международной «Конвенцией о конкретных видах обычного оружия», датированной 1980 годом, официально запрещено использование белого фосфора в военных целях, в качестве боезаряда снарядов и бомб. Тем не менее, положения этого документа постоянно нарушаются, что влечет за собой человеческие жертвы и сильные загрязнения окружающей среды.
Из анализа описанных на настоящий момент в литературе методов детоксикации белого фосфора в природных условиях, можно заключить, что эффективные методы очистки природных сред от данного вещества до сих пор не созданы (Тохюо^юа1 ..., 1997). Таким образом, разработка методов детоксикации и деградации белого фосфора в окружающей среде является актуальной задачей современной науки.
В работе (Bohn et а1., 1970) сообщается о естественной детоксикации белого фосфора в почве, однако авторы предполагают абиотическое окисление. Известны попытки применения бе-
лого фосфора в качестве фосфорного удобрения (Rodriguez et al., 1972), но без большого успеха. Между тем, у элемента фосфора есть уникальное качество - будучи сильнейшим ядом в виде простого вещества, в окисленном состоянии он абсолютно необходим для всех форм жизни. Таким образом, возможна его полная детоксикация (Миндубаев и др., 2014).
Следует отметить, что биодеградация является одним из наиболее популярных и часто применяемых на практике методов обезвреживания промышленных, бытовых и сельскохозяйственных стоков, химического оружия и взрывчатых веществ (Наумова, 1985). Однако в литературных источниках нами не найдено сведений о доказанных примерах биологической деградации белого фосфора, а также не прослежен его метаболический путь.
Целью настоящего исследования являлась переработка белого фосфора при помощи микроорганизмов, населяющих осадки канализационных стоков и получение экспериментальных данных, подтверждающих путь биологической деградации белого фосфора.
Методика
При проведении экспериментов использовали смесь уплотненного и обезвоженного осадка сточных вод (ОСВ) МУП Водоканал г. Казани. Применялся уплотненный ОСВ, собранный из колодца, а также обезвоженный ОСВ, произведенный фильтрованием на фильтр-прессе. При проведении каждого эксперимента использовали ОСВ одной партии, с идентичными показателями.
В качестве дополнительного субстрата, позволяющего сокращать лаг-фазу роста микрофлоры активного ила, в контроль и опыт добавлялась
42
российский журнал приютной экологии
растительная биомасса - зеленая масса растения амарант (Amaranthus cruentus L), который является эффективным стимулятором метанового брожения (Миндубаев и др., 2009). Фитомасса смешивалась с ОСВ в соотношении 1:1 на сухой вес. В одном из экспериментов фитомасса амаранта перед внесением в субстрат была измельчена до состояния порошка на ручном блендере.
Белый фосфор перед внесением в субстрат был диспергирован в воде при помощи ультразвукового диспергатора «Сапфир» (рабочая частота 35 кГц, 30 мин) при температуре 50 °С в инертной атмосфере (азот) до образования однородной эмульсии со средним диаметром сферических частиц менее 0.1 мм. Далее эмульсия белого фосфора вносилась в субстраты пипеткой при перемешивании: ее объем соответствовал рассчитанной конечной концентрации белого фосфора в субстрате.
Анаэробная переработка сырья осуществлялась в реакторах лабораторного масштаба, непрерывно термостатировавшихся в мезофильном (38 °С) и термофильном (50 °С) режимах, при которых P4 представляет собой твердое вещество и жидкость соответственно (белый фосфор плавится при температуре 44.1 °С). Загрузка реактора составляла 150-300 г субстрата, в зависимости от объема реактора (200-400 мл). В эксперименте с измельченной фитомассой на 48 сутки во все повторы было добавлено по 60 г инокулята, после чего объемы субстратов достигли 360 мл, а концентрация белого фосфора в сериях опытов снизилась с 1 : 10000 и 1 : 100000 до 1 : 8333 и 1 : 83333, соответственно. Объем выделяющегося газа измерялся ежедневно волюмометрическим методом. Качественный и количественный состав газа определялся еженедельно с помощью метода газожидкостной хроматографии (ГЖХ) на колонке Porapak Q длиной 2.4 метра, детектор по теплопроводности, газ-носитель - гелий. Температурный режим: колонка 85±5 °С, испаритель 130±10 °С, детектор 130±10 °С. Каждая проба газа отбиралась дважды, полученные значения -средние.
Для контроля переработки P4 были использованы ЯМР спектрометр высокого разрешения Avance 400 (Bruker) и газовый хроматомасс-спек-трометр Shimadzu GCMS-QP2010Ultra (Япония). Для поиска белого фосфора спектры 31Р ЯМР снимались с экстрактов ОСВ в органическом растворителе (диэтиловый эфир), для поиска метаболитов - с отфильтрованной водной фазы ОСВ.
Микробиологический посев из субстрата с исходным содержанием белого фосфора 0.1% производился после окончания анаэробной пе-
реработки. Посевы производили на плотную питательную среду МПА в чашке Петри. Инкубация продолжалась 48 часов (температура 37 °С). Идентификацию выделенных бактериальных культур проводили путем изучения морфологии бактерий и их колоний. Также проводился посев из субстратов с исходным содержанием белого фосфора 0.01%. Для выделения чистых культур актиномицетов использовали крахмало-аммиач-ный агар (КАА). Фрагменты колоний из исследуемых проб с помощью иглы переносили на пластинки КАА в чашках Петри. Через 2-3 суток при 25 °С на поверхности среды вырастали колонии актиномицетов. Для микроскопирования использовался световой микроскоп МБС-10, оснащенный цифровой видеокамерой Moticam 350 (Китай) с программным обеспечением Motic Images (увеличение в 60 раз).
Нами впервые произведен посев устойчивой микрофлоры на искусственную культуральную среду, содержащую в качестве единственного источника фосфора белый фосфор, и наблюдался рост на этой среде. Посев чистой культуры Bacillus subtilis из субстрата с исходным содержанием белого фосфора 0.1% (Миндубаев и др., 2015) производился на модифицированную среду Придхем-Готлиба. Классическая среда Придхем-Готлиба не содержит источники углерода: в качестве таковых выступают нефтепродукты. Наша модификация включает глюкозу, но не содержит источники фосфора (в качестве такового выступает белый фосфор). Параллельные повторы: среда без фосфата + 10 мл эмульсии Р4 с культурой Bacillus, среда с фосфатом без эмульсии Р4 с культурой Bacillus и среда без источников фосфора с культурой Bacillus. Среды разлиты в 200 мл склянки по 100 мл. Культивирование продолжалось 19 суток при температуре 37 °С.
Результаты и их обсуждение
При содержании белого фосфора в субстрате порядка 0.1% по массе, наблюдалось значительное угнетение жизнедеятельности микрофлоры по сравнению с контролем, выражающееся в снижении выделения газообразных продуктов жизнедеятельности, вплоть до временного прекращения выделения газа (Миндубаев и др., 2014) (рис. 1).
Тем не менее, даже при такой концентрации токсичного вещества не наблюдалась полная гибель микроорганизмов. При содержании белого фосфора в иле 0.01% по массе, наблюдалось значительное угнетение, вплоть до полного прекращения выделения газа, в течение приблизительно 2-3 недель, причем угнетение наблюдалось не вначале эксперимента, а спустя приблизительно
100 90
70 60 50 40 -j 30 -20 1 10 о
Скверы
□ Мончегорск
□ Мурманск
Larix sibirica
Syringa Rosa rugosa Spiraea Spiraea josikaea media salieifolia
Улицы
100 ц-
qq _ □ Мончегорск
80 ^ □ Мурманск | |
Рис. '. Кинетика выделения газа в зависимости от концентрации белого фосфора. Удельные выходы газа составили 30.5 мл газа/мл субстрата в контроле, 28.3 мл газа/мл субстрата при конц. 0.00'%, '6.0 мл газа/мл субстрата при конц. 0.0'% и 5.8 мл газа/мл субстрата при конц. 0.'%, соответственно. Все точки на диаграммах усреднены из трех повторов. Продолжительность эксперимента '48 суток
месяц. Удельный выход газа снижался вдвое по сравнению с контролем. При содержании белого фосфора в иле 0.001% по массе наблюдалось незначительное угнетение жизнедеятельности микрофлоры, без перерыва в выделении газа, указывающее на устойчивость природных популяций микроорганизмов активного ила к Р4 при разбавлении до указанной концентрации. Термофильный режим оказался несколько менее продуктивным по удельному выходу газа, однако зависимость количества выделившегося газа от концентрации Р4 сохраняется. После периода угнетения, жизнедеятельность микрофлоры, выраженная через выделение и состав газообразных продуктов метаболизма, начинала восстанавливаться (рис. 1).
Из субстратов с концентрацией Р4 0.01% (масс.) первая проба для 31Р ЯМР анализа была взята на 35 день. Спектры продемонстрировали наличие в эфирном экстракте одного сигнала, соответствующего белому фосфору. Значит, вне зависимости от режима термостатирования, срок в 35 дней недостаточен для переработки Р4 ОСВ. Вторая проба из субстрата с концентрацией белого фосфора 0.01% (мезофильный режим) была отобрана на 63 день. Спектр показал отсутствие сигналов фосфорных соединений, в том числе белого фосфора. Таким образом, срок продолжительностью 63 суток оказался достаточным для переработки белого фосфора в концентрации 0.01%.
Характер кинетики газообразования различается от эксперимента к эксперименту. В некото-
рых случаях наблюдается необратимое угнетение жизнедеятельности микрофлоры даже при концентрации белого фосфора 0.01%. Вероятно, это вызвано различиями в свойствах ОСВ разных партий. Такие эксперименты можно было признать неудачными, однако они дают ценную информацию о скорости биотрансформации белого фосфора. В спектре, снятом на 153 день эксперимента, присутствует сигнал в области 523 ррт, свидетельствующий о наличии белого фосфора в субстрате. Методом масс-спектрометрии показано, что белый фосфор в таких субстратах сохраняется даже через 333 суток после начала эксперимента. Таким образом, установлена взаимосвязь между интенсивностью метаболических процессов анаэробной микрофлоры и продолжительностью деструкции белого фосфора. Следует отметить, что на поверхности субстратов с добавлением белого фосфора 0.01% наблюдался рост колоний микроорганизмов (Миндубаев и др., 2014). В контрольных образцах без белого фосфора рост микроорганизмов не наблюдался. Микроорганизмы идентифицировали как представителей рода Streptomyces. Таким образом, во всех субстратах с содержанием белого фосфора 0.01%, вне зависимости от характера влияния данного ксенобиотика, наблюдается интенсивный рост стрептомицетов.
При одинаковом разведении из опытного (с белым фосфором) субстрата с содержанием белого фосфора 0.1%, на МПА выросло больше колоний бактерий, чем из контрольного. Плот-
44
российский журил прикин и!
ность клеточной суспензии в контроле составляла 2.5 х 108 клеток/мл субстрата, а в опыте -1.5 х 1010 клеток/мл субстрата, т.е. на два порядка больше. Выращенные бактерии имеют форму палочек и окрашиваются по Граму. Микроорганизмы были идентифицированы по морфологическим признакам как представители рода Bacillus. Представители данной группы часто выступают в роли деструкторов неприродных соединений, однако устойчивость к белому фосфору наблюдается для них впервые. Итак, во всех случаях мы наблюдаем сходное явление - отсутствие или ослабление роста микроорганизмов в контрольных субстратах после прекращения выделения газа, которое кажется парадоксальным, - получается, что в присутствии токсичного ксенобиотика микроорганизмы лучше растут по сравнению с контролем. Вероятно, это различие вызвано тем, что микроорганизмы, наблюдаемые в опытных субстратах, лучше адаптируются к присутствию белого фосфора. В контрольных субстратах они угнетены присутствием других групп микроорганизмов.
Отличие последнего эксперимента от предыдущих, описанных нами ранее (Миндубаев и др., 2014), состоит в том, что вносимая в субстраты подкормка - фитомасса амаранта, была измельчена до состояния порошка. Это резко активировало метаболические процессы в первые сутки эксперимента, как в контроле, так и в опытах. При этом интенсивно выделялся сероводород, образующийся при анаэробном разложении белковых веществ амаранта. Известно, что сероводород оказывает токсическое действие на микроорганизмы (Karhadkar et al., 1987). Накопление сероводорода
привело к постепенному прекращению выделения газообразных продуктов во всех образцах. Следует особо подчеркнуть, что токсичное влияние белого фосфора в опытах в этот период не наблюдалось: характер затухания метаболических процессов в контролях и опытах был одинаковым. По этой причине на 48 день эксперимента во все субстраты был добавлен инокулят. После его внесения микрофлора субстратов активировалась, но не одновременно в разных повторах. В одном из трех повторов, включая контроль, жизнедеятельность микрофлоры восстановилась сразу после внесения инокулята (рис. 2а). Кинетика второго повтора носит колебательный характер - чередование подъемов и спадов активности жизнедеятельности микрофлоры (рис. 2а). Третий повтор не активировался и спустя 240 дней после внесения инокулята (рис. 2а). Результат эксперимента однозначно свидетельствует о биологической деградации белого фосфора: разложение ксенобиотика начинается только после преодоления микрофлорой интоксикации сероводородом. На 223 сутки после внесения инокулята, из трех повторов опыта были отобраны пробы для хрома-томасс-спектрометрического анализа. Интенсивность сигнала белого фосфора в трех повторах оказалась обратно пропорциональна активности микробного метаболизма в них. Концентрация белого фосфора во втором повторе в 7.8 раз интенсивнее по сравнению с первым, а в третьем она в 13.3 раза интенсивнее, чем в первом (рис. 2б). Это означает четкую зависимость между скоростью исчезновения белого фосфора в субстрате и интенсивностью микробного метаболизма
1 12 23 34 45 56 67 78
100 111 122 133 144 155 166 177 188 199 210 221 232 243 254 265 276 287 Продолжительность процесса, супш
'-Первый повтор -"-Второй повтор Третий повтор
а. Кинетика выделения газа в опыте с содержанием Р4 0.01% (три повтора). Удельная продуктивность первого, второго и третьего повторов 27.3, 17.2 и 2.4 мл газа/мл субстрата за 288 суток, соответственно
б. Спектр ГХМС для трех повторов, снятый на 223 сутки эксперимента
Рис. 2. Различия интенсивности сигнала ГХМС белого фосфора для повторов опыта (наименее интенсивный сигнал - первого повтора, средний по интенсивности - второго, наиболее интенсивный - третьего). Для большей наглядности нужно сравнить с диаграммами (а)
о
нЛ""Н H
Фосфин
Быть ni фосфор
н / ^н
H
Фосфнноксид
H
Фо с ф о рнов атистая
н-ррон он
Фосфористая
но^рн
Фосфорная кислота
Рис. 3. Предполагаемый метаболический путь белого фосфора (знаком вопроса обозначены еще не обнаруженные превращения)
в нем. Если бы белый фосфор подвергался абиогенной деструкции (теоретически также возможной), скорость его разложения и интенсивность сигнала ГХМС во всех трех повторах была бы одинаковой.
Хотя химия белого фосфора достаточно хорошо известна, однако его метаболизм до сих пор не раскрыт, а из литературы удается почерпнуть о нем только фрагментарные сведения (Toxicological profil for white phosphorus, 1997). Наши предыдущие исследования показали, что анаэробная микрофлора угнетается белым фосфором не сразу, а спустя продолжительный промежуток времени. Причем активность жизнедеятельности снижается плавно. Из этого наблюдения можно сделать вывод, что белый фосфор нетоксичен для микрофлоры, а угнетение осуществляется полупродуктами его метаболизма.
Известно, что гипофосфиты проявляют бактерицидные свойства (Sieber et al., 2014). Таким образом, вполне вероятно, что подавление жизнедеятельности микрофлоры в наших опытах было обусловлено накоплением гипофосфита. Тем не менее, микрофлора смогла нейтрализовать предполагаемое воздействие гипофосфит-анио-нов. В статье (Foster et al., 1978) как раз описано микробное окисление гипофосфита и фосфита до фосфата в анаэробных условиях. Продуктом окисления гипофосфита является фосфористая кислота, которую бактерии сравнительно легко метаболизируют в фосфат - наиболее естественную форму фосфора в живом организме.
В опытном спектре 31Р ЯМР, снятом с водной фазы, проявились сигналы в области 0.3, 3.7 и
6.2 ррт, соответствующие фосфиту и гипофос-фиту. Таким образом, он соответствует соединениям, которые, предположительно, являются метаболитами белого фосфора, т.е., является подтверждением предполагаемого нами метаболического пути. Спектр, снятый с контрольного образца одновременно с опытным, на том же приборе и в тех же условиях, не содержит аналогичные сигналы. Это служит доказательством того, что обнаруженные соединения действительно являются метаболитами белого фосфора.
Итак, если объединить информацию, полученную из наших экспериментальных данных и из рассмотренных литературных источников, то можно изобразить следующую схему предполагаемого метаболизма белого фосфора (Миндубаев и др., 2014) (рис. 3).
Бациллы растут очень интенсивно на среде, содержащей фосфат. В среде без источников фосфора признаки жизнедеятельности вообще не наблюдаются, среда прозрачна, отсутствует показатель брожения глюкозы - выделение газа. Самый интересный результат демонстрирует среда с белым фосфором. В ней присутствуют отдельные мелкие колонии. Наблюдалось выделение газа. Значит, бациллы смогли расти, хоть и очень медленно, на продуктах окисления белого фосфора, включающие незначительные количества фосфата и фосфита! Поскольку в литературе отсутствуют сведения о микроорганизмах, устойчивых к Р представленная работа имеет бесспорную новизну. Следующим важнейшим этапом исследований станет поиск ферментных систем, способных принимать активное участие в разложении белого фосфора.
российский журил прикиной и!
Заключение
Впервые показана возможность деградации белого фосфора (Р4) под действием ОСВ биологических очистных сооружений. Показано, что белый фосфор угнетает рост микроорганизмов за счет образования токсичных промежуточных продуктов его деградации. Получены культуры микроорганизмов, растущих на субстратах с содержанием белого фосфора 0.01-0.1% масс. Установлено, что снижение концентрации Р4 обратно пропорционально продолжительности лаг-фазы роста и прямо - активности метаболических процессов микрофлоры. В работе проведен поиск метаболитов белого фосфора и предложен путь его метаболизма. Впервые произведены посевы микроорганизмов на культуральные среды, содержащие белый фосфор в качестве единственного источника фосфора. На данных средах микроорганизмы росли и не испытывали фосфорное голодание. Это первый пример включения белого фосфора в биосферный круговорот элемента фосфора.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 14-08-31091 мол а).
Cписок литературы
1. Бадюгин И.С. Зажигательные и токсические свойства фосфора. Уроки Львовской аварии // Военно-медицинский журнал. 2009. Т. 330. № 9. С. 20-26.
2. Вербовой А.Ф. Состояние костной ткани и кальций-фосфорного обмена у рабочих фосфорного производства // Казанский медицинский журнал. 2002. Т. 83, № 5. С. 147-150.
3. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Алимова Ф.К., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Сапар-мырадов К.А., Хаяров Х.Р., Яхваров Д.Г. Включение белого фосфора в природный круговорот веществ. Культивирование устойчивой микрофлоры // Бутлеровские сообщения. 2015. Т. 41, № 3. С. 54-81.
4. Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Ахоссийенагбе С.К., Алимова Ф.К., Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Панкова А.В., Болормаа Ч., Сапармырадов К.А., Яхваров Д.Г. Белый фосфор как новый объект биологической деструкции // Бутлеровские сообщения. 2014. Т. 40, № 12. С. 1-26.
5. Миндубаев А.З., Минзанова С.Т., Скворцов Е.В., Миронов В.Ф., Зобов В.В., Ахмадуллина Ф.Ю., Миронова Л.Г.,
Белостоцкий Д.Е., Коновалов А.И. Стимулирующее влияние сухой фитомассы амаранта Amaranthus cruentus на биоме-таногенез в трудноферментируемых субстратах // Вестник Казанского технологического университета. 2009. № 4. С. 220-226.
6. Наумова Р.П. Микробный метаболизм неприродных соединений. Казань: Изд-во Казанского университета, 1985. 239 с.
7. Bohn H.L., Johnson G.V., Cliff J.H. Detoxification of White Phosphorus in Soil // J. Agr. Food chem. 1970. V. 18, № 6. P.1172-1173.
8. Foster T.L., Winans L., Helms J.R., Helms S.J.S. Anaerobic Utilization of Phosphite and Hypophosphite by Bacillus sp. // Applied and environmental microbiology. 1978. V. 35, № 5. P. 937-944.
9. Karhadkar P.P., Audic J.-M., Faup G.M., Khanna P. Sulfide and sulfate inhibition of methanogenesis // Water Research. 1987. V. 21, № 9. P. 1061-1066.
10. Rodriguez A., Bohn H.L., Johnson G.V. White phosphorus as a phosphatic fertilizer // Soil Sci. Soc. Am. Proc. 1972. V. 36, № 2. P. 364-366.
11. Sieber J.R., Le H.M., McInerney M.J. The importance of hydrogen and formate transfer for syntrophic fatty, aromatic and alicyclic metabolism // Environmental Microbiology. 2014. V. 16. № 1. P. 177-188.
12. Toxicological profil for white phosphorus / U.S. Department of health and human services. USA, 1997. 248 p.
A.Z. Mindubaev, A.D. Voloshina, E.V. Gorba-chuk, N.V. Kulik, S.T. Minzanova, L G.Mironova, F.K. Alimova, D.G. Yakhvarov. The detoxication of wastewaters containing white phosphorus by microflora
The possibility of white phosphorus oxidation to water-soluble compounds in sewage sludge was shown. Microorganisms cultures, growing on substrate containing white phosphorus up to 0.1% were obtained and demonstrated for the first time. The P4 concentration decreasing is in inverse proportion to the microflora growth lag-phase duration. This fact indicates the white phosphorus biodegradation process.
Key words: detoxication, white phosphorus, sewage sludge, anaerobic conditions, gas secretion kinetics, gas chromatography-mass spectrometry, metabolic pathway, nuclear magnetic resonance.
