CC BY
58DOI:10.24412/1999-6780-2019-4-48-53
УДК 616-094:616.596-002.828
МОРФОЛОГИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ SCOPULARIOPSIS BREVICAULIS - ВОЗБУДИТЕЛЯ ОНИХОМИКОЗА, ПРОБЛЕМНОГО ДЛЯ ТЕРАПИИ
Цурупа Е.Н. (врач-дерматовенеролог), Рябинин И.А. (м.н.с., ассистент кафедры)*, Котрехова Л.П. (доцент кафедры), Чилина Г.А. (зав. лаб.), Васильева Н.В. (директор НИИ, зав. кафедрой), Разнатовский К.И. (зав. кафедрой) Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина; кафедра медицинской микробиологии; кафедра дерматовенерологии, Санкт-Петербург, Россия
В работе представлена развернутая морфологическая характеристика Scopulariopsis brevicaulis, полученная на выборке из 9-ти штаммов. Исследование провели с помощью 4-х подходов: визуального наблюдения за динамикой роста, микроскопии в проходящем свете, стереомикроскопии непрозрачной части колонии и мицелия на стекле в отраженном свете. Все наблюдения выполнили на интактных пробирочных культурах, позволяющих регистрировать морфологическую организацию гриба без повреждений и артефактов. Выявили выраженный, особенно на микроскопическом уровне, полиморфизм штаммов, а также появление у них адаптивных особенностей морфогенеза, включая образование гифальных анастомозов, «гнездную» архитектуру поверхности колоний и конденсацию гиалиновых масс вокруг субстратных гиф. Полученные сведения дополняют типовое описание вида S. brevicaulis и могут быть использованы в культу-ральной диагностике онихомикоза и иных форм скопуляриопсидоза.
Ключевые слова: онихомикоз, полиморфизм, резистентность к антимикотикам, стереомикроскопия, Scopulariopsis brevicaulis
MORPHOLOGICAL POLYMORPHISM OF SCOPULARIOPSIS BREVICAULIS - THE CAUSE AGENT OF ONYCHOMICOSIS, PROBLEMATIC FOR THERAPY
Tsurupa E.N. (dermatologist), Ryabinin I.A. (junior scientific collaborator, assistant of the department), Kotrekhova L.P. (associate professor), Chilina G.A. (head of the laboratory), Vasilyeva N.V. (director of the Institute, head of the department), Raznatovsky K.I. (head of the department) North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov: Kashkin Research Institute of Medical Mycology; Department of Medical Microbiology; Department of Dermatology and Venerology, St. Petersburg, Russia
This report presents the detailed morphological characteristic of S. brevicaulis obtained from the sample of 9 strains. The study was carried out with using 4 approaches: visual observation of the growth dynamics, microscopy in transmitted light, stereomicroscopy of the opaque part of the colony and mycelium on glass in reflected light. All observations were performed on intact test tube cultures, allowing the morphological organization of the fungus to be recorded without damage and artifacts. Expressed polymorphism of strains, especially at the microscopic level, was revealed, as well as the appearance of adaptive features of morphogenesis in them, including the formation of hyphal anastomoses, the «nested»
* Контактное лицо: Рябинин Игорь Андреевич,
e-mail: Igor.Ryabinin@szgmu.ru
architecture of the colonies' surfaces and the condensation of hyaline masses around substrate hyphae. The obtained data supplement the typical description of S. brevicaulis and can be used in the cultural diagnosis of onychomycosis and other forms of scopulariopsidosis.
Key words: antimycotic resistance, onychomycosis, polymorphism, Scopulariopsis brevicaulis, stereomicroscopy
ВВЕДЕНИЕ
Scopulariopsis brevicaulis (Saccardo) Bainier, 1907 (скопуляриопсис короткостебельчатый) - вид условно-патогенных гиалогифомицетов, которые в медицинской практике известны как возбудители онихомикоза, иногда - отомикоза, а также инвазивных микозов у пациентов с иммуносупрессией [1-5]. Более ранние сообщения о скопуляриопсидозах человека представили Martin-Scott I. (1953), Franks G.A. (1956) и Tosti A. (1996). Среди представителей рода S. brevicaulis выделяют от человека наиболее часто. Как возбудитель поражения ногтей он представляет ряд проблем, актуальных для клинициста и микробиолога. В связи с тем, что это условно-патогенный гриб, при выявлении культуры этиологическую значимость изолята следует доказывать, в том числе количественным и повторным высевом [5]. Для экспресс-обнаружения S. brevicaulis в материале ногтевых пластин, наряду с другими возбудителями онихомикоза, целесообразно использовать мультиплексную ПЦР-тест-систему [6]. Терапия ско-пуляриопсидного онихомикоза отличается большой продолжительностью в сравнении со стандартной терапией [7].
Изоляты S. brevicaulis, для которых определяли чувствительность к противогрибковым препаратам, характеризуются высокими значениями минимальных ингибирующих концентраций триазолов, тербина-фина, флуцитозина и амфотерицина В, как сообщают Cuenca-Estrella M. (2003) и ряд других авторов [8, 9]. Молекулярные механизмы антимикотической устойчивости скопуляриопсисов до сих пор не выявлены. Решение этого вопроса тормозит то обстоятельство, что у S. brevicaulis подавляющее большинство изученных локусов генома являются таксономическими маркерами (ITS, TEF1-a, в-тубулин), используемыми для экспертной идентификации, но не дающими представление о биохимических особенностях гриба. Исторически S. brevicaulis ранее относили к роду Penicillium (P. brevicaule), однако отсутствие у скопуляриопсисов типичных кистевидных конидиеносцев и открытие ан-нелидного конидигенеза стали весомыми аргументами для изменения таксономического положения.
Аннелиды по структуре схожи с фиалидами аспер-гиллов и пенициллов, отличия проявляются на этапе отделения конидии: наиболее базальная часть клеточной стенки конидии откалывается от нее и в виде кольца остается на коларетте аннелиды. С высвобождением каждой последующей конидии аннелиды, таким образом, мерно увеличиваются в длину. Аннели-ды могут располагаться одиночно либо формировать на мицелии небольшие кластеры, похожие на примитивно организованную одномутовчатую, часто «сидящую» на мицелии кисть. Цепочки аннелоконидий обычно не очень протяженные. У конидий отчетливо заметен контур с «обрубленной» частью - зоной ан-неляции. Скопуляриопсис является своего рода «хрестоматийным» примером аннелидного конидиогенеза, который приводят во многих руководствах по общей
микологии [10, 11]. Другие микромицеты с аналогичным способом образования спор известны в значительно меньшей степени (Cephalotrichum, Pithoascus, Annellosporium, Melanconium, Spilocaea, Annellophora и другие).
S. brevicaulis - гетероталлический гриб, при скрещивании подходящих штаммов-партнеров противоположного знака образуются открытые сосудоподоб-ные плодовые тела типа перитециев; телеоморфу именуют Microascus brevicaulis.
Штаммы S. brevicaulis в настоящее время не находят практического применения, но ранее, по данным П.Н. Кашкина, эти грибы использовали в криминалистике при подозрении на отравление мышьяком. На обычных микологических средах культура S. brevicaulis обладает слабовыраженным плесневым ароматом, а при наличии в среде мышьяка (из экстракта пищевого продукта или тканей трупа) гриб источает сильный чесночный запах.
Описания вида S. brevicaulis помещено авторами в ряд определителей мицелиальных грибов, в том числе и для диагностических целей [12, 13]. Тем не менее, в силу морфологического полиморфизма, использование только эталонных описаний и снимков типовых культур для идентификации микромицетов часто приводит к ошибкам в их определении. В связи с этим обстоятельством изучение полиморфизма штаммов проблемных микромицетов внесет существенный вклад в решение этой проблемы.
Цель исследования - определение вариантов формирования колоний и элементов микроскопического строения у коллекционных штаммов S. brevicaulis.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Изучено 9 штаммов S. brevicaulis из Российской коллекции патогенных грибов (РКПГ F-165, 980, 1084, 1111, 1167, 1288, 1297, 1412, 1597). Реидентификацию штаммов проводили с использованием определителя [12], электронной экспертной системы Института биологического разнообразия грибов им. А. Вестердик [14], а также методом MALDI-TOF-масс-спектрометрии экстракта из мицелия [15].
Субкультивирование штаммов осуществляли в пробирках на модифицированной агаризованной питательной среде Сабуро по Эммонсу с добавлением 5 г/л дрожжевого экстракта при 28 °С до 12 суток. Фотофиксацию макроскопической картины роста проводили на 5-е, 8-е и 11-е сутки инкубации.
Микроскопическое исследование интактных культур выполняли в «проходящем свете» с помощью микроскопа МБР-1 (ЛОМО, Россия) с фокусировкой на воздушном мицелии, обрастающем стекло, а также в отраженном свете с помощью стереомикроскопа Stemi 2000-C с осветителем KL 1500 LCD (Carl Zeiss Jena, Германия) с фокусировкой на воздушном мицелии (как выше) и на уровне поверхности колонии. Для фото-сьемки колоний и элементов микроскопического строения использовали камеру Presto T55 (Rekam, Канада).
Цифровую обработку фотографий осуществляли с использованием редакторов XnView 2.35 и GIMP 2.8.6.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты MALDI-идентификации штаммов.
Все изученные штаммы успешно идентифицировали как «S. brevicaulis» со следующими показателями: кате-
гория идентификации «В», коэффициенты достоверности идентификации (Score Values) составили SVF-165=1,897; SVF-98O=1,780; SVF-1()84=2,023; SVFL1111=1,805; SVF-1167=1,765; SVf-1288=1,911; SVF-^1,812; SVF-MW=1,934;
SVF-1597=1,885.
Внешний вид колоний S. brevicaulis. На раннем этапе наблюдения (4-е сутки) заметили, что колонии распространяются по поверхности агарового скоса у разных штаммов неодинаково. Данный феномен может быть связан как с разной скорость роста штаммов, так и с неравным размером фрагментов агаровой культуры, взятых для посева, и соотношений содержания жизнеспособного мицелия и конидий в таких фрагментах. Колонии преимущественно пушистые, тускло-белые. Оборотная сторона почти не окрашена, желтовато кремовая.
На 8-е сутки (Рис. 1А) колонии максимально покрывают агаровый блок, оттенок их поверхности варьирует от тускло-белого до белесо-буровато-коричневого, поверхность - от бархатистой до войлочной. Белый воздушный мицелий покрывает культуры либо равномерно, либо больше в центральной части, либо развит сильнее при переходе культуры к росту со скоса среды на столбик агара. Рверзум окрашен слабо, варьирует от бело-желтоватого до бело-коричневатого. С оборотной стороны видно, как мицелий заполняет трещины в слое агара. В последующем наблюдении на 11-е сутки картина роста меняется слабо, колонии наиболее активно спороносящих штаммов становятся темнее, а реверзум приобретает более бурый оттенок.
Поверхность колоний S. brevicaulis, наблюдаемая при стереомикроскопии, имеет разнообразное строение в зависимости от степени развития воздушного мицелия и его пространственных взаимоотношений с участками развитого спороношения (Рис. 1А, где sit - участок интенсивного спороношения, sns - участок «гнездной» поверхности).
У штаммов, претерпевших наиболее длительный период музейного хранения, белый аспорогенный воздушный мицелий на поверхности колонии преобладает, а сама колония имеет войлочную консистенцию. Срединная часть колонии более возвышенная, на краю агарового скоса - более разреженная. Рисунок поверхности имеет вид сложной разнопетлистой сети из неправильно переплетенных гиф либо можно видеть более направленное распространение магистральных гиф по радиусу колонии. В иных случаях поверхность колонии отличается наличием ячеистых углублений.
У культур более позднего поступления (на музейное хранение), наряду с высоким белым воздушным мицелием, заметны более пологие коричневатые участки развитого спороношения. В одних случаях они просматриваются через ватообразные массы воздушных гиф, в других - полностью открыты для наблюдателя. Также возможно проступание участков спороношения среди слоя воздушного мицелия в форме «каньона». У сильно спороносящих культур области сосредоточения аннелид расположены больше по периферии, перемежаются с мелкими образованиями из воздушного мицелия в форме гифальных тяжей или компактно спутанных гиф. Открытые участки спороношения имеют мелкогранулярную текстуру.
При стереомикроскопии культур в отраженном свете мицелий, аннелиды и цепи конидий обладают
ярко выраженной блёскостью (Рис. 2).
В месте перехода культуры с вершины агарового скоса на стекло видны протяженные гифы, выходящие из стромы колонии под острыми углами к оси пробирки, эти гифы несут кластеры из аннелид, которые образуют спутывающиеся цепи аннелоконидий. В дис-тальных отделах такие кластеры меньше и образуются более разреженно.
Мицелий, обрастающий стекло, имеет вид островков разнопетлистой гифальной сети, которые местами соединяются рядами гиф почти параллельного расположения. В той части мицелия, обрастающей стекло, которая приближена к агаровому скосу, большие группы гиф отличаются наличием сильно утолщенных оболочек. Визуально такие оболочки состоят из некой аморфной гиалиновой субстанции (материал клеточной стенки? конденсация продуктов метаболизма культуры?). Часть мицелия на стекле, особенно в наиболее удаленных от агаровой культуры фрагментах, лишена аннелид.
Спороносный аппарат имеет разнообразную архитектонику. Аннелиды располагаются одиночно, рядами с унилатеральным и супротивным отхождением от конидиеносной гифы, а также в компактных кластерах. Анеллоконидии формируются в виде правильных цепочек почти прямых или извитых, иногда в виде скученной массы. Из кластеров аннелид образуется подобие рыхлой колонки или сильно спутанные конгломераты анеллоконидий.
Картина микроскопии мицелия, обрастающего поверхность стекла, в проходящем свете, показана на рисунке 1Б, где обозначены: mh - магистральные гифы, ah - гифы-«анастомозы», lb - латеральные ветви, ас - кластеры аннелид, sa - одиночные аннелиды, vm - стекловидные массы вокруг гиф, iac - объединение кластеров аннелид (примитивный конидиеносец), sh - спиральные гифы, twh - тонкостенные гифы, slf - звездчатые фигуры из гиф.
«Магистральные» гифы распространяются прямо от края культуры на значительном протяжении параллельно друг другу. Между ними под углом формируются гифы-«анастомозы» и неанастомозирующие боковые ветви, часто изогнутые. Аннелиды располагаются на них унилатерально и билатерально одиночно, а также по две и по три. В целом картина строения гриба, выявляемая этой техникой, аналогична наблюдаемой при стереомикроскопии, включая разнообразие положения аннелид, видоизменения мицелия и прочие характеристики. Дополнительно выявили особенности оптических свойств гиф: большинство отличаются довольно развитой клеточной стенкой, но встречаются гифы с сильно уплотненными септами, а клеточной стенкой визуально тонкой, прозрачной. Гифы-«крючки» в отдаленных участках мицелия на стекле находятся на стебельках либо формируются прямо, как латеральный («сидячий») вырост магистральной гифы. Иногда группы аннелид формируются сосредоточенно на воздушных гифах, которые обращены в полость пробирки. Такие образования можно расценивать как некое подобие конидиеносцев.
Наблюдали также своеобразные фигуры мицелия: гифы, растущие под разными углами, пересекаются в одной точке (звездчатые фигуры).
ОБСУЖДЕНИЕ
Воздушный мицелий края колонии, изученный у разных штаммов S. brevicaulis, находится на различных стадиях дифференцировки: от почти прямо направленных гиф до волнообразных пучков к формированию ямковидной или гнездной текстуры поверхности. Мы предполагаем, что в последнем случае такая текстура обеспечивает оптимальное дыхание культуры и способность конденсировать атмосферную влагу. Формирующиеся на мицелии, адгезированном на стекле, звездчатые фигуры из пересекающихся гиф, очевидно, являются зачатками объемных «гнезд» воздушного мицелия.
Особый интерес представляет феномен образования более или менее регулярных анастамозов между магистральными гифами на стекле. При росте из основного массива субстратного мицелия наиболее ба-зальные части гиф неизбежно отмирают, а рост обеспечивают апикальные сегменты, которые в отсутствии анастамозов оказались бы разрозненными. Благодаря анастомозом в наиболее отдаленном краевом регионе роста гриба гифы сохраняют способность обмениваться сигнальными и питательными веществами. Логично предположить, что в этом случае их физиологические акты являются согласованными.
Обнаруженные спиральные гифы, вероятно, являются аскогенными. Сосредоточение аморфной стекловидной массы вокруг субстратных гиф можно расценивать как способ запасания в мицелии гриба жидкости.
Разнообразие строения конидиогенного аппарата, по-видимому, не имеет какого-либо принципиального биологического значения, а является особенностью наблюдаемого штамма или его культуральной формы.
Свойства изученных в данной работе штаммов сопоставили с ранее проведенными нами наблюдениями за изолятами S. brevicaulis из учебной коллекции кафедры медицинской микробиологии (2; на солодовом агаре и картофельном агаре). Последние упомянутые изоляты отличаются более плоскими колониями с бархатистой текстурой и более выраженным коричневым пигментом. Принципиальное отличие в режиме поддержания учебных штаммов от коллекционных связано с более частым их пересевом, по сравнению со штаммами из РКПГ, что, наряду с иным составом питательных сред, определило контрастное своеобразие их субкультур.
Наряду с микологическим аспектом данной работы, следует особо подчеркнуть необходимость насколько возможно полного взаимодействия дерматологов и микробиологов в расшифровке этиологии онихомико-за, обусловленного недерматомицетами.
ВЫВОДЫ
1. Техника стереомикроскопии и микроскопии в проходящем свете позволяют получить тождественные результаты, но при совместном использовании дают возможность наиболее выгодно визуализировать отдельные элементы строения микромицета.
2. Микроскопическое наблюдение микромицета в интактной (пробирочной) культуре позволяет визуализировать его структурную организацию в наиболее естественном состоянии.
3. Штаммы S. brevicaulis проявляют морфологиче-
А. Внешний вид культур Sc. brevicaulis и стереомикроскопия поверхности
В. Микроморфология культур S. brevicaulis в проходящем свете. Ув. Х80. Micromorphology of S. brevicaulis cultures in transmitted light. Mag. X80.
Рис. 1. Внешний вид культур S. brevicaulis, особенности их поверхности и элементы строения, видимые в проходящем
свете. Обозначения в тексте.
Рис. 2. Элементы строения культур S. brevicaulis при стереомикроскопическом наблюдении. Ув. х30. Снимки-негативы.
ский полиморфизм на уровне макро- и микроскопической организации, видимый даже при работе с выборкой небольшой численности.
4. S. brevicaulis в культуре осуществляет адаптивные морфологические реакции, направленные, предположительно, на долгосрочное существование в режиме лимита питательных веществ и воды.
5. Гипертрофия воздушного мицелия является отличительной особенностью длительно сохраняемых штаммов S. brevicaulis в сравнении со штаммами, часто пересеваемыми и типовыми описаниями видов.
6. Выявленные особенности пространственной организации вегетативного мицелия и органов споро-ношения S. brevicaulis необходимо учитывать при диагностической лабораторной работе с посевами биома-
териала, содержащими колонии этого микромицета.
7. Использование ЫАЬ01-Т0Б-масс-спектромет-рии экстракта из мицелия, при достаточной квалификации микробиолога и комплектности базы типовых масс-спектро-профилей, позволяет идентифицировать изоляты S. brevicaulis, в том числе с необычными морфологическими характеристиками.
ПОДДЕРЖКА РАБОТЫ
Работа выполнена в соответствии с Государственным заданием Минздрава России «Разработка быстрых методов диагностики микозов и молекулярных маркеров резистентности клинически значимых микромицетов к противогрибковым препаратам» (№ ЛЛЛЛ-Л18-118052990083-4).
ЛИТЕРАТУРА
1. Myung H.L., et al. Onychomycosis caused by Scopulariopsis brevicaulis: report of two cases. Ann. Dermatol. 2012 May; 24 (2): 209-213. doi.org/10.5021/ad.2012.24.2.209
2. De Miguel-Martineza I., et al. Necrotising otitis externa due to Scopulariopsis brevicaulis in a patient without predisposing factors. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 2018; 36 (1): 62-64. doi.org/10.1016/j.eimce.2017.03.024
3. Iwen P. C., et al. Invasive Scopulariopsis brevicaulis infection in an immunocompromised patient and review of prior cases caused by Scopulariopsis and Microascus species. Med. Mycol. 2012; 50 (6): 561-569. doi: 10.3109/13693786.2012.675629
4. Salmon A., et al. Disseminated Scopulariopsis brevicaulis infection in an allogeneic stem cell recipient: case report and review of the literature. Clin. Microbiol. Infect. 2010; 16 (5): 508-512. doi.org/10.1111/j.1469-0691.2009.02878.x
5. Кубасова Н.Л., Пупкова М.А., Клиценко О.А., Васильева Н.В. Особенности диагностики и лечения онихомикоза стоп, обусловленного нитчатыми недерматомицетами и дрожжами. Проблемы медицинской микологии. 2010; 12 (3): 2528. [Kubasova N.L., Pupkova M.A., Klitsenko O.A., Vasilyeva N.V. Osobennosti diagnostiki i lecheniya onikhomikoza stop, obuslovlennogo nitchatymi nedermatomitsetami i drozhzhami. Problemy meditsinskoy mikologii. 2010; 12 (3): 25-28 (in Russ)].
6. Лавникевич Д.М., и др. Способ диагностики онихомикоза. Патент на изобретение. RUS 2584035 от 12.02.2015. Режим доступа: https://elibrary.ru/item.asp?id=37396340 [Lavnikevich D.M., et al. Sposob diagnostiki onikhomikoza. Patent for an invention. RUS 2584035 dated 12.02.2015. (in Russ)].
7. Ameen M., et al. British Association of Dermatologists' guidelines for the management of onychomycosis 2014. Br. J. Dermatol. 2014; 171 (5): 937-958. https://doi.org/10.1111/bjd.13358
8. Skora M., Macura A.B., Bulanda M. In vitro antifungal susceptibility of Scopulariopsis brevicaulis isolates. Med. Mycol. 2014; 52 (7): 723-727. doi.org/10.1093/mmy/myu039
9. Isidro A.M.B., et al. Fungal prosthetic mitral valve endocarditis caused by Scopulariopsis species: Case report and review of the literature. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2006; 131 (5): 1181-1183. doi.org/10.1016/j.jtcvs.2005.12.062
10. Conidium production in ascomycetes [Electronic resource]// Study Solutions. Mode of access: http://istudy.pk/conidium-production-in-ascomycetes/ Date of access 07.11.2019.
11. Phylum 6. Ascomycota. The Ascomycetes [Electronic resource] // Mycolog.com. Mycologue Publications. Mode of access: www. mycolog.com/CHAP4a.htm Date of access 07.11.2019.
12. de Hoog G.S., et al. Atlas of Clinical Fungi. Online Edition [Electronic resource]. Utrecht: Westerdijk Fungal Biodiversity Institute, 2019. Mode of access http://www.clinicalfungi.org/
13. Sciortino C.V. Atlas of Clinically Important Fungi. John Wiley & Sons, 2017: 456 pp. doi.org/10.1002/9781119069720
14. Medical fungi species database. Polyphasic identification [Electronic resource]. Utrecht: Westerdijk Fungal Biodiversity Institute. Mode of access http://www.wi.knaw.nl/Medical/Biolomicsid.aspx
15. Рябинин И.А., Ершова А.И., Батаева К.Д. Анализ процессов идентификации и группировки масс-спектров, получаемых при MALDI-TOF-масс-спектрометрии белковых экстрактов из культур Aspergillus fumigatus Fres. Проблемы медицинской микологии. 2015; 17 (1): 52-57. [Ryabinin I.A., Yershova A.I., Batayeva K.D. Analiz protsessov identifikatsii i gruppirovki mass-spektrov, poluchayemykh pri MALDI-TOF-mass-spektrometrii belkovykh ekstraktov iz kul'tur Aspergillus fumigatus Fres. Problemy meditsinskoy mikologii. 2015; 17 (1): 52-57 (in Russ)]. mycology.szgmu.ru/files/№1_2015.pdf
Поступила в редакцию журнала 07.11.2019
Рецензент: И.А. Босак
