CC BY
50УДК 582.282.123.4
КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕДКИХ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ АСПЕРГИЛЛЁЗА, УСТОЙЧИВЫХ К ВОРИКОНАЗОЛУ
Рябинин И.А. (м.н.с.)*, Спиридонова В.А. (н.с.), Богомолова Т.С. (зав. лаб.), Выборнова И.В. (н.с.), Борзова Ю.В. (зав. клиникой), Фролова Е.В. (зав. лаб.), Шадривова О.В. (доцент), Чилина Г.А. (зав. лаб.), Филиппова Л.В. (с.н.с.), Учеваткина А.Е. (с.н.с.), Игнатьева С.М. (в.н.с.), Тараскина А.Е. (зав. лаб.), Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой) Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова: НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина; кафедра медицинской микробиологии; кафедра клинической микологии, аллергологии и иммунологии, Санкт-Петербург, Россия
В статье представлены культуральные свойства ворикона-зол-резистентных штаммов Aspergillus spp. Проведено расширенное культуральное микологическое исследование этих изолятов с использованием различных питательных сред, упоминаемых в отечественной нормативной базе.
Ключевые слова: Aspergillus, вориконазол, гигантские колонии, культуральное исследование, противогрибковая резистентность
CULTURAL AND MORPHOLOGICAL CHARACTERISTIC OF RARE STRAINS OF THE ASPERGILLOSIS CAUSATIVE AGENTS RESISTANT TO VORICONAZOLE
Ryabinin I.A. (junior scientific collaborator), Spiridonova V.A. (scientific collaborator), Bogomolova T.S. (head of the laboratory), Vybornova I.V. (scientific collaborator), Borzova Y.V. (head of the clinic), Frolova E.V. (head of the laboratory), Schadrivova O.V. (assosiate professor), Chilina G.A. (head of the laboratory), Filippova L.V. (senior scientific collaborator), Uchevatkina A.E. (senior scientific collaborator), Ignatyeva S.M. (leading scientific collaborator), Taraskina A.E. (head of the laboratory), Vasilyeva N.V. (director of the institute, head of the department)
North-Western State Medical University named after I.I. Mechnikov: Kaschkin Research Institute of Medical Mycology, Department of Medical Microbiology; Department of Clinical Mycology, Immunology and Allergy, St. Petersburg, Russia
This report highlights the cultural properties of voriconazole-resistant strains of Aspergillus spp. An extended cultural mycological study of these isolates using different nutrient media mentioned in the domestic regulatory framework was carried out.
Key words: Aspergillus, antifungal resistance, cultural research, giant colonies, voriconazole
Контактное лицо: Рябинин Игорь Андреевич, e-mail: Igor.Ryabinin@szgmu.ru
ВВЕДЕНИЕ
Вориконазол является препаратом выбора для противогрибковой химиотерапии инвазивного аспер-гиллёза лёгких [1]. В последние три десятилетия неуклонно прогрессирует количество находок ворико-назол-устойчивых изолятов Aspergillus spp. во многих странах мира [2-4]. Такие штаммы обнаруживают как в биоматериале человека, так и в объектах больничной и внебольничной окружающей среды. Когда аспергил-лы, резистентные к вориконазолу, выступают в качестве этиологических агентов инвазивных микозов, работники клинической и лабораторной сферы сталкиваются с рядом нетривиальных проблем, в числе которых следующие:
Для определения чувствительности Aspergillus spp. к вориконазолу и другим антимикотикам необходимо применять экспертный международный протокол, который в целом отличается трудоёмкостью. Многие расходные средства дорогостоящи и не всегда доступны.
Для выявления природно-устойчивых к ворикона-золу аспергиллов микробиолог должен в совершенстве владеть техникой морфологической идентификации либо (и) иметь возможность определения изолята путём таргетного ДНК-секвенирования таксономически значимых локусов генома.
Разнообразие культуральных и микроморфологических свойств природно-устойчивых изолятов представителей рода Aspergillus позволило различным авторам и авторским коллективам составить ключи и определители отдельных видов этих микромицетов [5-8]. Тем не менее только путём использования существующей справочной литературы полностью решить проблему идентификации аспергиллов, в том числе для выявления изолятов резистентных видов, не удаётся в силу существования (а) «криптических» видов [9] и (б) ярко выраженного полиморфизма микроми-цетов. И первое, и второе обстоятельство требуют сбора и представления данных на основе крупных выборок штаммов отдельных видов, в том числе с использованием молекулярно-генетических и физико-химических методов. В связи с эти мониторинг свойств штаммов актуальных возбудителей микозов и обмен полученными данными между микробиологическими лабораториями и специалистами смежных областей, в том числе путём публичного представления, чрезвычайно важны.
Цель исследования - составить характеристику изолятов Aspergillus spp. с высокими минимальными ингибирующими концентрациями вориконазола на основе культуральных и микроморфологических свойств.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы Aspergillus spp. клинического происхождения депонированы в Российской коллекции патогенных грибов: A. glaucus РКПГ F-1250, A. calidoustus РКПГ F-1595, A. flavus РКПГ F-1611.
Видовую идентификацию штаммов осуществляли с помощью трёх подходов: морфологического, физико-химического и молекулярно-генетического. Данные о морфологической идентификации штамма РКПГ F-1250 заимствованы из паспорта культуры; для двух других изолятов - установлены на основании «Atlas
í--
of clinical fungi» [7]. Определение видовой принадлежности при помощи MALDI-TOF-масс-спектрометрии клеточного экстракта провели, как описано ранее [10].
MALDI-масс-спектры, использованные для идентификации штаммов, графически представлены на рисунке 1.
В качестве экспертного метода применяли таргет-ное ДНК-секвенирование регионов в-тубулина и внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) согласно протоколу CLSI MM 18-A [11].
Определение чувствительности штаммов к во-риконазолу методом серийных разведений выполнили, руководствуясь клиническими рекомендациями [12].
Рис. 1. MALDI-масс-спектры низкомолекулярной фракции протеома вориконазол-резистентных штаммов Aspergillus spp. (наложение в реальном масштабе без искусственного выравнивания до базовой линии).
Составление культурально-морфологической характеристики указанных штаммов провели на осно-
ве архива фото- и микрофотоснимков, собранного в 2012-2017 гг. При создании оригинального фотоархива для исследуемых штаммов применяли следующие питательные среды и режимы инкубации (надстрочный индекс «М» означает, что в отношении культуры с данной среды также выполняли микроскопическое исследование). Для A. glaucus РКПГ F-1250:
• на агаре Сабуро в модификации Эммонса: трёхто-чечный посев на чашку Петри (стандарт) с инкубацией 10 суток при 30 °C;
• на глюкозо-пептонно-дрожжевой среде (УРО-агаре)М - трёхточечный посев на чашку Петри с инкубацией 10 суток при 30 °C;
• на картофельно-глюкозной-дрожжевом агаре (КГДА)М - трёхточечный посев на чашку Петри с инкубацией 7 суток при 30 °C.;
• на среде Чапека-ДоксаМ - трёхточечный посев на чашку Петри с инкубацией 10 суток при 28 °C;
• на среде Чапека с дрожжевым экстрактом: посев газоном в чашку Петри (7 суток) и в пробирку (30 суток) с инкубацией при 25 °C;
• на среде Чапека с дрожжевым экстрактом и лактозой (вместо сахарозы) трёхточечный посев на чашку Петри с инкубацией при 30 °C;
• на среде Чапека с дрожжевыми экстрактом и 20% сахарозы - одноточечный посев в колбу и газонный посев в пробирку с инкубацией 30 суток при 25 °C.
• Для A. calidoustus РКПГ F-1595:
• на агаре Сабуро в модификации Эммонса: многоточечный посев с инкубацией 10 суток при 30 °C;
• на КГДАМ - многоточечный посев с инкубацией 5 суток при 30 °C;
• на среде Чапека с дрожжевым экстрактомМ - одноточечный посев в чашку Петри с инкубацией 7 суток при 25 °C;
• на среде Чапека с дрожжевым экстрактом и лактозой - трёхточечный посев чашку Петри с инкубацией 7 суток при 30 °C.
• Для A. flavus РКПГ F-1611:
• на среде Сабуро в модификации ЭммонсаМ - трёх-точечный посев на чашку Петри с инкубацией 5 суток при 30 °C;
• на среде Чапека с дрожжевым экстрактомМ - трёх-точечный посев в чашку Петри с инкубацией 10 суток при 30 °C.
Фотосъёмку культур осуществляли с помощью камеры Presto T55 (Reram, Канада); микрофотосъёмку провели на микроскопе Leica DM LB2 со встроенной камерой DFC320 (Leica, Германия) и на микроскопе Leica CME с помощью камеры Presto T55.
Питательные среды готовили по принятым, ранее использованным прописям [13], а среду Чапека-Докса получили из коммерческого сухого препарата производства HiMedia, Индия (кат № М1170).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Приводим расширенную культурально-морфоло-гическую характеристику изученных штаммов.
Культуральные свойства «A. glaucus» РКПГ F-1250. Штамм выделили от пациента с диссеминиро-ванным аспергиллёзом. Результат морфологической идентификации «A. glaucus» исправили благодаря работе Ю.В. Михайловой и соавторов [14], которые подвергли генетический материал штамма таргетному
ДНК-секвенированию по локусам ß-тубулина и внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS). Действительная видовая принадлежность штамма: Aspergillus hollandicus (анаморфная форма) / Eurotium amstelodami (телеоморфная форма). По данным MALDI-TOF-масс-спектрометрии экстракта из мицелия изолят демонстрировал различные свойства при повторных исследованиях: в одних случаях его масс-спектро-профиль был более схож с «A. glaucus», в других - с «Е. amstelodami».
Хотя описываемый штамм на большинстве микологических питательных сред проявляет способность к половому спороношению, упоминая его в медицинском аспекте, целесообразно употреблять имя анамор-фы A. hollandicus, поскольку именно споры анаморфы, что особо подчеркивал Н.П. Елинов [15], являются ин-вазивной формой микромицета для человека.
На среде Сабуро штамм развивается умеренно быстро. Его колонии резко отличаются от других клинически значимых представителей рода Aspergillus очень неравномерными фестончатыми краями. На большем протяжении колонии плоские, их поверхность бархатистая. Рельеф образован сравнительно ровными, регулярно расположенными радиальными бороздами, отходящими от центра, который окаймлен кольцевидной бороздой. В месте посева в центре колонии видно неглубокое вдавление неправильной формы. Около половины площади колонии в центре имело тёмно-коричнево-зеленоватую пигментацию. Ближе к краям колоний наблюдали компактные желтоватые пятна - места формирования клейстотециев. Края колоний составляли наиболее возвышенную их часть: здесь сильно развит воздушный мицелий, очерчивающий контуры колонии пушистым белым валом. Реверзум культуры тускло-буро-коричневатый, диффундирующего в среду пигмента нет.
При пассаже на YPD-агаре характеристики роста штамма в какой-то мере сравнимы со средой Сабуро, но кажутся «гипертрофированными». Рельеф колонии неровный в центральной части - мелкобугристый и несколько возвышенный, оттуда к периферии идут борозды неправильной формы, нерегулярно расположенные. Колония, исключая краевую зону, тускло-глинисто-коричневая, бархатистая. Также ближе к периферии находятся группы клейстотециев в очень крупных кластерах, ясно видимых невооруженным глазом. Вершины кластеров гифами даже прикрепляются к крышке чашки Петри. Неровный фестончатый край колонии отмечен неравномерным по толщине очень высоким валом белого воздушного мицелия, который на некоторых участках имеет «разрывы». Оборотная сторона колонии, как на среде Сабуро, тускло-буро-тёмная, но более интенсивно пигментированная, почти до чёрной. При просмотре посева создается впечатление, что с реверзума идёт слабое пропитывание среды тёмным пигментом (вероятно, это липофильное вещество).
Культуры на картофельно-глюкозно-дрожжевой среде формируют ограниченно растущие, медленно расширяющиеся колонии, имеющие почти равномерный рельеф. При посеве спор такие колонии бархатистые, с правильным, почти циркулярным контуром. Центр колоний бархатистый, тёмно-зелёный, а край желтоватый по причине продукции там клейстотеци-
ев. Реверзум схож с картиной на других средах. При посеве массивного инокулюма из фрагмента агаровой культуры также наблюдали образование крупных колоний неправильной формы, врастающих в среду с образованием глубоких нерегулярных борозд. Поверхность таких колоний бугристая, неравномерно-окрашенная, на большом протяжении - коричневато-кре-мово-белёсая, край зеленоватый.
При использовании модифицированной среды Ча-пека-Докса получили культуры с отличающимися характеристиками. Так, в одном из пассажей штамм образовал ограниченные колонии округлых очертаний с бородавчатой поверхностью, мелко фестончатым краем, тускло-тёмно-зелёной пигментацией с коричневыми прожилками. В других посевах получали мелкие округлые колонии с ровной бархатистой поверхностью, плоские, тёмно-зелёные с тонким желтоватым краем; также наблюдали образование расширяющихся колоний с хлопьевидной текстурой, у которых была отчётливо выражена зональность. Чередовались широкие зоны бесполого спороношения и более узкие пояса клейстотециев. Во всех случаях реверзум культур не был окрашен.
Стандартная питательная среда для идентификации Aspergillus spp. - агар Чапека с дрожжевым экстрактом позволил получить тускло-тёмно-зелёную колонию неровных очертаний с бугристо-бархатистой текстурой. По поверхности культуры нерегулярно расположены мелкие кластеры жёлтых клейстотециев.
Пассаж на модифицированном агаре Чапека с дрожжевым экстрактом и лактозой сопровождался формированием колоний с почти ровным контуром и бархатистой поверхностью. Большая часть колоний спороносила, становилась тёмно-синевато-зелёной. По периферии и по складкам в центральной зоне компактно расположен белый воздушный мицелий. Также вокруг контура основной колонии образуется кольцевидная, отделённая от основного массива зона воздушного мицелия. Признаков продукции клейстотециев не наблюдали. Оборотная сторона колоний тускло-тёмно-бурая.
Специальной средой, адаптированной для культивирования аспергиллов секции Aspergillus (телеморф-ный род Eurotium), является агар Чапека с дрожжевым экстрактом и 20% сахарозы. На данной питательной среде штамм A. hollandicus растёт неограниченно, образуя тёмно-зелёные бархатистые распростёртые колонии, которые от периферии к центру обильно покрываются хлопьевидными ярко-жёлтыми кластерами клейстотециев.
Микроморфологические свойства «A. glaucus» РКПГ F-1250.
Культура на среде Чапека-Докса состоит только из вегетативного мицелия и конидиеносцев. Мицелий стекловидный, прозрачный, с гомогенным содержимым. Клетки-ножки конидиеносцев «теряются» в субстратном мицелии. Диаметр конидиеносцев слегка увеличивается по мере приближения к терминальному расширению, имеющему сферическую форму и покрытому короткими зубчатыми стеригмами в один ряд. Конидии сферические и субсферические, гладкие, в массе зеленоватые. В колониях на среде YPD микроскопиро-вали кластеры клейстотециев. У изученного штамма A. hollandicus клейстотеции разновеликие, их формы
Рис. 2. Гигантские колонии и элементы микроскопического строения «А. д!аиси$» (А. 11о!!апСки$) РКПГ Р-1250: А, Г, Д -на УРЭ-агаре, Б, В - на среде Сабуро, Е, Ж - на среде Чапека-Докса, З, И - на среде Чапека с дрожжевым экстрактом и лактозой. К - вегетативный мицелий; Л - конидиеносец, М - клейстотеции и конидиеносец (ув. х200).
от сферической и субсферической до неправильной. Цвет клейстотеция - зеленовато-коричневый; оболочка состоит из крупных полигональных клеток. Заметны отдельные сравнительно короткие конидиеносцы, прямые и изогнутые, по протяжённости сравнимые с диаметром клейстотеция. В некоторых случаях терминальное расширение заполнено малопрозрачным гомогенным красновато-бурым содержимым.
В культурах на картофельно-глюкозно-дрожже-вой среде вегетативный мицелий очень полиморфный, разного диаметра, интенсивно ветвится дихотомически под острым углом, в некоторых гифах - полон округлыми светопреломляющими включениями или вакуолизирован. Конидиенсцы сравнительно короткие с клеточной стенкой коричневатого оттенка, более тёмной, чем у вегетативных гиф. У многих конидиенос-цев видны равноплечие клетки-ножки. В месте отхож-дения от клетки-ножки конидиеносец обычно сужен. Переход в терминальное расширение оформлен раз-
лично: (1) плавным расширением, (2) сужением или (3) боковым изгибом. Терминальное расширение сферическое до субсферического, иногда несколько грушевидное, прозрачное. Стеригмы однорядные, сильно растопырены, покрывают терминальное расширение на протяжении 3/4 площади или более. Встречаются карликовые конидиеносцы с гиалиновыми стенками, относительно мелким терминальным расширением в сравнении со зрелыми стеригмами на нём. В отдельных головках стеригмы могут сильно различаться по высоте, также наблюдали аномальное прорастание вегетативных гиф из конидиальных головок: прорастание конидий (?) или трансформация стеригм (?). Чаще конидиеносцы связаны со структурами неизмененного вегетативного мицелия, но нам также удалось обнаружить их отхождение от примитивно устроенной синнемы из 2-3 гиф. Помимо этого, нашли трихотомическое ветвление конидиеносца: на протяжении конидиеносная гифа завершалась сферическим взду-
тием, а от него отходили 3 кондиеносца нормального строения. Конидии субсферические до слегка лимоновидных, иногда вздутые, в массе - зеленоватые. Формирование клейстотециев сходно с особенностями на других питательных средах.
Иллюстрации к культурально-морфологической характеристике штамма «А. glaucus» РКПГ Б-1250 показаны на рисунке 2.
Культуральные свойства А. саШотШз РКПГ ¥-1595. Штамм выделен из бронхоальвеолярного лава-жа больного аспергиллёзом лёгких [16].
При использовании масс-спектрометрической идентификации микромицет определяется, как А. шШ$. Ранее мы привели особенности культуральных свойств этого изолята на среде Сабуро в примакуль-туре, агаре Чапека с дрожжевым экстрактом и карто-фельно-морковном агаре [17]. В данном сообщении дополнительно приводим характеристики колоний на картофельно-глюкозном-дрожжевом агаре, среде Чапека с дрожжевым экстрактом (с сахарозой и лактозой), а также дегенеративной культуры на среде Са-буро.
В посеве на среде Чапека с дрожжевым экстрактом (после четырехлетнего хранения штамма в виде живой культуры) колонии имели ровные контуры, пушистые, белые, в глубине проступала буро-сероватая пигментация вследствие спороношения. Иногда развитие колоний происходит неравномерно в силу секторальной изменчивости. Встречаются пушисто-бархатистые сектора с явно развитым спороношени-ем, а также сектора, состоящие преимущественно из вегетативного мицелия с неправильной хлопьевидной текстурой и утолщенным краем. Продукция экссудата отсутствует. Реверзум окрашен слабо, под хорошо спо-роносящими секторами имеет желтовато-зеленоватый оттенок.
На среде Чапека с дрожжевым экстрактом и лактозой колонии в краевой части низкие, бархатистые, с ровным краем, светло-серые. Хорошо развито спо-роношение. Не менее 2/3 площади колонии занимает ровно очерченная центральная зона из белого воздушного мицелия, закрывающего споровый аппарат. Оборотная сторона колоний светлая, не окрашенная.
Колонии на картофельно-глюкозно-дрожжевом агаре широко распространённые, с ровным округлым контуром. Большая часть колонии совершенно плоская, покрыта плотным сплетением воздушного тускло-желтоватого мицелия. Центральная часть имеет ровный рельеф, а по периферии видны многочисленные, близкорасположенные радиальные борозды, однако они неглубокие, затрагивают только воздушный мицелий и не видны с оборотной стороны. Спороно-шение развито только в краевой зоне на отдельных участках, описывающих небольшие дуги окружности. Такие фрагменты бархатистые, буровато-серые. Ревер-зум пигментирован слабо.
Интересно, что в одном из пассажей на среде Сабуро этот штамм проявил нехарактерную для аспер-гиллов плёнчатую дегенерацию. В белых распространённых колониях центральная часть, покрытая белым воздушным мицелием, была куполообразно приподнята. Периферическая часть, составляющая около 2/3 площади колонии, состояла практически только из полупрозрачного слоя субстратного мицелия, исчерчен-
ного мелкими радиальными бороздами. Оборотная сторона посева пигментации не имела.
Микроморфологические свойства А. саШотШв РКПГ ¥-1595. При стереомикроскопическом исследовании спороносящих участков колонии на кар-тофельно-глюкозно-дрожжевой среде выявили на поверхности культуры тонкую разнопетлистую сеть воздушного мицелия. Ниже неё наблюдали хаотично расположенные на разных уровнях конидиальные головки, имеющие форму растрёпанной кисти. В некоторых местах видны разновеликие капли экссудата - от бесцветного до желтоватого. Микроморфология изолята на средах КГДА и Чапека с дрожжевым экстрактом, просматриваемая в препарате «раздавленная капля», тождественна типовым характеристикам видов А. шЫв и А. саН4ошШ$.
Культуральные свойства А. /¡аут РКПГ Б-1611.
Штамм выделили из подкожного абсцесса пациента с диссеминированным аспергиллёзом. Результат идентификации подтвержден однозначно благодаря и таргетному ДНК-секвенированию, и ЫАЬ01-Т0Б-масс-спектрометрии.
Культура этого штамма на среде Сабуро, как и на агаре Чапека с дрожжевым экстрактом, по своим макро- и микроморфологическим свойствам полностью соответствовала типовым характеристикам вида А. /1а,уш (радиально-головчатый вариант). В связи с этим обстоятельством приводим свойства колоний А. /1ауш РКПГ Б-1611 в сравнении с другими штаммами комплекса видов А. /1ауш/отугав, чувствительных к вори-коназолу (17 субкультур, агар Сабуро), характеристики которых мы кратко обсуждали ранее [18].
Оригинальная субкультура А. /1ауш РКПГ Б-1611 на среде Сабуро формирует широко распространённые колонии с ровным округлым контуром. Рельеф колонии образован радиальными складками, проходящими через весь радиус колонии, либо не доходящими до края, либо начинающимися от края, но обрывающимися в периферической зоне. Радиальные борозды хорошо видны с оборотной стороны посева, а на их лицевой стороне отчётливо прослеживаются только по белому низкому краю культуры. Около 3/4 площади колоний заняты конидиеносцами. При этом в центре формируется поверхностный тонкий слой воздушного мицелия с «тающими» краями. Окраска конидиенос-ной зоны традиционного для вида травянисто-зелёного цвета, но пигментация распределена неравномерно: ближе к центру - насыщенно-зелёная, ближе к периферии - желтовато-зелёная. Продукцию склероциев у этого изолята не наблюдали. Оборотная сторона практически не окрашена, кремово-желтоватая темнеющая под отдельными секторами.
У других изученных штаммов этого вида рельеф колоний в целом похож, различия отмечали в плотности расположения радиальных борозд, а также в оформлении центра колонии, который в одних случаях отделялся кольцевидной бороздой, в других - включал несколько извилистых борозд неправильной формы. Пигментация колоний варьировала от изумрудно-зелёной (у штаммов А. отугав) до травянисто-зелёной, жёлто-зелёной и жёлтой до жёлто-оранжевой. Спо-роношение может быть равномерно плотным почти по всей поверхности. В таких колониях тонкий белый край, в центральной зоне видны элементы хлопьевид-
ного воздушного мицелия. Часто наиболее плотное расположение конидиеносцев формируется в центре колонии над точкой посева, а в других частях споро-ношение более разреженное, оттенок колонии более светлый; иногда зона спороношения имеет вид неправильной многолучевой звезды. Даже наблюдали развитие спороношения от края колонии к центру. У отдельных атипичных штаммов над конидиеносцами по объёму сильно преобладал высокий войлочный воздушный мицелий без пигментации. У штаммов, близких A. oryzae, за счёт развития крупных конидиальных головок колония приобретает гранулярную текстуру.
На среде Чапека с дрожжевым экстрактом колонии с сильным спороношением, бархатистые, слегка зональные, без признаков плеоморфной дегенерации, по характеристикам соответствуют классическим признакам вида.
По данным референс-теста определения чувствительности изолятов к вориконазолу получили следующие значения минимальных ингибирующих концентраций этого препарата для изученных культур: A. glaucus РКПГ F-1250 - 8 мг/л; A. calidoustus РКПГ F-1595 - 16 мг/л, A. flavus РКПГ F-1611 - >16 мг/л. В отношении указанных видов критерии интерпретации МИК еще не сформулированы, однако на том основании, что полученные значения в 4-8 раз превосходят порог отнесения к резистентным для наиболее частых возбудителей (2 мг/л) и приближаются к пределу ряда разведений антимикотика, можно, судить об устойчивости изученных изолятов к вориконазолу.
ОБСУЖДЕНИЕ
Для того чтобы в диагностической практике эффективно выявлять представителей видов, штаммы которых нами описаны выше, необходимо иметь представление о разнообразии доступных источников морфологических описаний и снимков культур, а также микроскопических элементов их строения. Далее приводим краткий обзор такой информации по отдельным видам.
Первое описание вида Eurotium amstelodami опубликовано французским ботаником Манженом Л.А. (Louis Alexandre Mangin, 1852-1937) в периодическом издании «Анналы естественных наук. Ботаника» (фр. Annales des sciences naturelles. Botanique) в 1909 г. Впоследствии синонимами вида признаны: Eurotium repens var. amstelodami Vuillemin, 1920; Aspergillus (Eurotium) heterocaryoticus Christensen et al., 1965; Aspergillus (Eurotium) vitis Новобранова, 1972; Aspergillus (Eurotium) vitis var. montevidensis Kozakiewicz, 1989 и другие. В современной научной литературе, однако, некоторые авторы высказывают сомнения в правомочности использования данного видового имени, утверждая, что «A. (E.) amstelodami» сам является синонимом других видов [19, 20]. Тем не менее это утверждение желательно подкрепить не только на основании анализа видовых описаний в определителях, но и путем исследования выборки коллекционных штаммов.
Обращаясь к ранним источникам, следует отметить, что описание роста E. amstelodami на среде Чапека в классическом исполнении и в модификации с 20% сахарозы со снимками культур (в том числе - микроснимком кластера из клейстотециев, аскоспор и кони-диеносца) представлено в монографии классиков ис-
следований трихокомовых аскомицетов - Чарльза Тома и Кеннета Рапера [Thom Ch., Raper K.B. The Aspergillus glaucus group. Washington, D.C.: US Department of Agriculture. Miscellaneous publication. 1941. № 426. 46 pp.]. Снимки колонии A. amstelodami на среде Чапека и описание вида в анаморфном и телеоморфном состоянии приведены в известной отечественной монографии Билай В.И. и Коваль Э.З. «Аспергиллы» (1988 г.), информация об этом виде имеется также в позднейшем российском атласе Кулько А.Б. [6]. В определителе Klich M.A. (2002) для данного вида автором помещены только размеры колоний на различных питательных средах и данные микрометрии, но видовое описание, фотоснимки или схемы отсутствуют.
Табличная характеристика вида представлена на сайте Института биологического разнообразия грибов им. А. Вестердик (Утрехт, Нидерланды), хотя культу-ральные свойства описаны здесь довольно кратко: авторы указали, в частности, что A. amstelodami образует на солодовом агаре желтые колонии, а пигментация конидий на среде Чапека с дрожжевым экстрактом варьирует от желтой до коричневой. Из микроморфологических свойств обращает внимание то, что авторы указывают на наличие бородавчатого рельефа кониди-еносцев, который мы ни разу не наблюдали у изученного штамма. Фенотипическую характеристику вида дополняет перечень типовых коллекционных штаммов с указанием секвенированных ДНК-локусов для экспертного определения видовой принадлежности [21]. Только детальный пересмотр свойств этих штаммов, по нашему мнению, может служить правомочным основанием для дискуссии о существовании вида A. hollandicus / E. amstelodami.
Хорошо иллюстрирован представитель данного вида в тематическом фотокаталоге на сайте Пражского университета химии и технологии [22]. Распространенные на агаре колонии изученного изолята здесь имеют равномерный лимонно-желтый оттенок (по-видимому, из-за обилия клейстотециев), сравнительно ровный рельеф, слегка приподнятый и складчатый в центре, и нечеткие контуры, однако авторы не указали тип питательной среды. На стереомикроснимке видна сплошная масса клейстотециев, а структуры, напоминающие конидиальные головки, единичны. В качестве иллюстраций микроскопического строения помещены снимки зрелых клейстотециев с высвобождающимися аскоспорами в препаратах, окрашенных хлопковым голубым.
На соответствующей странице ресурса «Грибы и лишайники Великобритании и Ирландии» поместили снимок E. amstelodami на солодовом агаре с 20% сахарозы (агар «М20», трехточечный посев) [23]. Колонии штамма тут оказались распространенными и зональными, с бархатисто-войлочной текстурой и нечетким контуром. Пигментация колоний - темно-зеленая (малахи-тово-зеленая) с желтыми вкраплениями, такой же окрас колоний наблюдали и у изученного нами изолята на среде Чапека с дрожжевым экстрактом и 20% сахарозы.
В ресурсе «Грибы Тайваня» для E. amstelodami приводят морфологическое описание, фото колоний на классической среде Чапека и среде Чапека с 20% сахарозы, световые микроснимки конидиальной головки, конидий и аскоспор, а также электроноптические снимки конидий и аскоспор [24]. Приведенное здесь
описание содержит признаки, которые мы наблюдали у A. hollandicus РКПГ F-1250 при использовании ряда питательных сред, однако иллюстрации культур на сайте имеют иную пигментацию, нежели в описании для оттенков конидиальных головок. Вызывает сомнение видовая специфичность приведенных на сайте данных, поскольку помещенный здесь каталожный номер коллекции BCRC (Тайвань) №32306 отсылает к штамму Aspergillus montevidensis.
В отношении A. flavus Link, 1809 следует отметить, что это этот вид хорошо известен микробиологам, за более чем двухсотлетнюю историю изучения накоплен богатый описательный и иллюстративный материал по его культуральным свойствам и микроморфологии, информацию об этом микромицете можно найти в любом определителе аспергиллов и в периодических сообщениях. В практике лабораторий, участвующих в программах EUCAST, известен факт наличия сравнительно высоких МИК A. flavus в отношении ворико-назола, что также нашло отражение в отечественных клинических рекомендациях по определению антимикробной чувствительности [12].
A. calidoustus Varga, Houbraken & Samson, 2008 описан наиболее поздно, на момент открытия штаммы этого нового вида обнаружили как в биоматериале человека, так и в объектах внешней среды [Varga J., Houbraken J., Van Der Lee H. et al. Aspergillus calidoustus sp. nov., Causative Agent of Human Infections Previously Assigned to Aspergillus ustus. Eukaryot Cell. 2008; 7(4): 630-638]. В сообщении с официальным описанием вида приведены черно-белые снимки, а годом ранее авторы того же учреждения дали подробную характеристику всех известных на тот момент представителей секции Usti с цветными снимками [Houbraken J., Due M., Varga J., et al. Polyphasic taxonomy of Aspergillus section Usti. Stud. Mycol. 2007; 59: 107-128]. A. calidoustus очень похож на A. ustus, и, по-видимому, ранее штаммы A. calidoustus определяли как A. ustus или как иных видов аспергиллов секции Usti, поэтому для получения представления о нем возможно использовать источники, вышедшие позднее 2007 г. и включающие описания штаммов, идентифицированных с использованием типовых таксономически значимых последовательностей генома. В оригинальной публикации с описанием вида даны иллюстрации картин роста типового штамма A. calidoustus CBS 121601T на среде Чапека с дрожжевым экстрактом и солодовом агаре, а также диаметр колоний на креатин-сахарозном агаре и сахарозно-дрожжевой среде. Отмечено, что вид отличается от A. ustus положительной реакцией Эрлиха и способностью к росту при 37 °С. Интересно, что приведенная авторами культура на среде Чапека с дрожжевым экстрактом образует радиально-складчатые колонии, а также клетки Хюлле неправильной формы; эти признаки мы не наблюдали у A. calidoustus РКПГ F-1595.
В сообщении авторов из Кувейта показаны микро-
снимки A. calidoustus на среде Сабуро, где видны ко-нидиеносцы, подогнутые вблизи образования кониди-альной головки [25]. Такие изогнутые конидиеносцы мы обнаружили в примакультуре штамма A. calidoustus РКПГ F-1595 из биоматериала на той же среде. Данный признак непостоянен, виден лишь на некоторых кони-диеносцах. Также описание культуры с серией микроснимков конидиеносцев и конидий приводят иранские исследователи [26]. Из сетевых источников заслуживает внимания известный блог «Fun with Microbiology», где вновь показаны культуральные свойства штамма A. calidoustus на агаре Сабуро [27]. Культура сходна с A. calidoustus РКПГ F-1595, но не производит диффундирующий зеленоватый пигмент, как изолят из российской коллекции. Серия микроснимков конидиального аппарата позволяет видеть его структуру достаточно подробно, но здесь гриб окрашен хлопковым голубым (cotton blue B), поэтому невозможно выявить естественный цвет элементов его строения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Как видно из приведенных результатов, штаммы вориконазол-резистентных возбудителей аспергил-леза отличаются своеобразным сочетанием свойств: один из видов (A. flavus) хорошо известен микробиологам, два других (A. calidoustus, A. hollandicus) в клинической практике пока описаны по немногочисленным находкам; в отношении одного вида накопленный опыт позволяет проводить сравнения с культуральны-ми свойствами ранее изученных штаммов (A. flavus, A. hollandicus), в отношении другого (A. calidoustus) -объем хорошо паспортизированных штаммов, даже в мировом масштабе, сравнительно невелик. Теоретически не существует каких-либо таксономических барьеров для появления резистентность-обусловливающих мутаций в генах, кодирующих изоформы фермента ланостерол-14а-деметилазы - мишени триазольных антимикотиков, а также активации иных механизмов резистентности к триазолам, поэтому появление вори-коназол-устойчивых изолятов можно ожидать среди любых видов Aspergillus spp. В связи с этими фактами следует принять во внимание необходимость следующих мер повышения качества (информативности) диагностики инвазивного аспергиллеза и эпидемиологического надзором за этой инфекцией: (1) подготовка микробиологов диагностического звена по вопросам медицинской микологии, связанным с идентификацией и биоразнообразием возбудителей аспергиллеза человека и (2) депонирование антимикотикоустойчивых штаммов Aspergillus spp. из диагностических лабораторий в Российской коллекции патогенных грибов.
Данная работа выполнена в рамках государственного задания Минздрава России «Разработка быстрых методов диагностики микозов и молекулярных маркеров резистентности клинически значимых микромицетов к противогрибковым препаратам» (№ AAAA-A18-118052990083-4).
ЛИТЕРАТУРА
1. Ullmann A.J., Aguado J.M., Arikan-Akdagli S., et al. Diagnosis and management of Aspergillus diseases: executive summary of the 2017 ESCMID-ECMM-ERS guideline. Clinical Microbiology and Infection. 2018; 24 (suppl. 1): e1-e38.
2. Rocchi S., Pongot M., Morin-Crini N., et al. Determination of azole fungal residues in soils and detection of Aspergillus fumigatus-resistant strains in market gardens of Eastern France. Environ Sci. Pollut. Res. Int. 2018; 25 (32): 32015-32023.
3. Abdolrasouli A., Scourfield A., Rhodes J., et al. High prevalence of triazole resistance in clinical Aspergillus fumigatus isolates in a specialist cardiothoracic centre. Int. J. Antimicrob. Agents. 2018; 52 (5): 637-642.
4. Paul R.A., Rudramurthy S.M., Dhaliwal M., et al. Magnitude of voriconazole resistance in clinical and environmental isolates of Aspergillus flavus and investigation into the role of multidrug efflux pumps. Antimicrob. Agents. Chemother. 2018; 62 (11): pii: e01022-18.
5. Seifert K.A. ASP45, a synoptic key to common species of Aspergillus. Integration of modern taxonomic methods for Penicillium and Aspergillus / ed. by R.A. Samson and J.I. Pitt. Amsterdam: Harwood Academic Publishers, 2000: 139-146.
6. Кулько А.Б. Атлас условно-патогенных грибов рода Aspergillus - возбудителей бронхолегочных инфекций. М.: Типография «Новости», 2012; 155 с. [Kulko A.B. Atlas uslovno-patogennykh gribov roda Aspergillus - vozbuditeley bronkholegochnykh infektsiy. M.: Tipografiya «Novosti», 2012; 155 s. (In Russ)].
7. de Hoog G.S., Guarro J., Gene J., Figuares M.F. Atlas of clinical fungi. 2Nd ed. Utrecht: CBS, 2000; 1126 pp.
8. Рябинин И.А., Расулова С.С. Разработка синоптического ключа для идентификации медицински значимых Aspergillus spp. Синергия наук. 2018; 21: 249-264. [Ryabinin I.A., Rasulova S.S. Razrabotka sinopticheskogo klyucha dlya identifikatsii meditsinski znachimykh Aspergillus spp. Sinergiya nauk. 2018; 21: 249-264 (In Russ)].
9. Howard S.J. Multi-Resistant Aspergillosis due to Cryptic Species. 2014; 178 (5-6): 435-439.
10. Vasilyeva N., Riabinin I., Rasulova S., et al. Features of clusterization of mass-spectra of Aspergillus spp. cellular extracts. 28th ECCMID, 2018. Mode of access: http://www.eccmidlive.org/#resources/features-of-clusterization-of-mass-spectra-of-aspergillus-spp-cellular-extracts
11. Petti C.A., Brandt M.E., Church D.E., et al. MM18. Interpretive criteria for identification of bacteria and fungi by targeted DNA sequencing. 2nd Ed. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2018; 152 pp.
12. Васильева Н.В., Климко Н.Н., Богомолова Т.С. и др. Раздел 3. Метод серийных разведений в жидкой питательной среде для определения МПК противогрибковых препаратов в отношении конидиеобразующих плесневых грибов. Клинические рекомендации. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Версия 2018-03. 2018: 195-206. [Vasilyeva N.V., Klimko N.N., Bogomolova T.S., et al. Razdel 3. Metod seriynykh razvedeniy v zhidkoy pitatel'noy srede dlya opredeleniya MPK protivogribkovykh preparatov v otnoshenii konidiyeobrazuyushchikh plesnevykh gribov. Klinicheskiye rekomendatsii. Opredeleniye chuvstvitel'nosti mikroorganizmov k antimikrobnym preparatam. Versiya 2018-03. 2018: 195-206 (In Russ)].
13. Atlas R.M. The handbook of microbiological media for the examination of food. Boca Raton: CRS Press. 2006; 464 pp.
14. Михайлова Ю.В., Чилина Г.А., Полищук А.Г. Молекулярная идентификация представителей Aspergillus spp. из Российской коллекции патогенных грибов. Проблемы медицинской микологии. 2012; 14 (4): 46-49. [Mikhaylova Y.V., Chilina G.A., Polishchuk A.G. Molekulyarnaya identifikatsiya predstapviteley Aspergillus spp. iz Rossiyskoy kollektsii patogennykh gribov. Problemy meditsinskoy mikologii. 2012; 14 (4): 46-49 (In Russ)]
15. Елинов Н.П. Некоторые преодолимые проблемы для медицинской микологии. Проблемы медицинской микологии. 2010; 12 (1): 3-9. [Yelinov N.P. Nekotoryye preodolimyye problemy dlya meditsinskoy mikologii. Problemy meditsinskoy mikologii. 2010; 12 (1): 3-9 (In Russ)].
16. Пономаренко В.А., Шадривова О.В., Борзова Ю.В. и др. Случай успешного лечения инвазивного аспергиллеза легких, обусловленного Aspergillus calidoustus, у гематологического пациента. Проблемы медицинской микологии. 2018; 20 (2): 104. [Ponomarenko V.A., Shadrivova O.V., Borzova Y.V., et al. Sluchay uspeshnogo lecheniya invazivnogo aspergilleza legkikh, obuslovlennogo Aspergillus calidoustus, u gematologicheskogo patsiyenta. Problemy meditsinskoy mikologii. 2018; 20 (2): 104 (In Russ)]
17. Рябинин И.А., Чилина Г.А., Богомолова Т.С., Михайлова Ю.В. Необычные варианты Aspergillus spp. в культуре. Проблемы медицинской микологии. 2014; 16 (4): 26-31. [Ryabinin I.A., Chilina G.A., Bogomolova T.S., Mikhaylova Y.V. Neobychnyye varianty Aspergillus spp. v kul'ture. Problemy meditsinskoy mikologii. 2014; 16 (4): 26-31 (In Russ)].
18. Рябинин И.А., Лякишева Е.В. Многофакторный подход к различению Aspergillus flavus link и A. oryzae (Ahlburg) Cohn. Материалы XI съезда ВНПОЭМП «Обеспечение эпидемиологического благополучия: вызовы и решения», Москва, 1617 ноября 2017 года. Под ред. А.Ю. Поповой. СПб.: ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, 2017: 445. [Ryabinin I.A., Lyakisheva E.V. Mnogofaktornyy podkhod k razlicheniyu Aspergillus flavus link i A. oryzae (Ahlburg) Sohn. Materialy XI s'yezda VNPOEMP «Obespecheniye epidemiologicheskogo blagopoluchiya: vyzovy i resheniya», Moskva, 16-17 noyabrya 2017 goda. Pod red. A.Y. Popovoy. SPb.: FBUN NII epidemiologii i mikrobiologii imeni Pastera, 2017: 445 (In Russ)].
19. Hubka V., Kolarik M., Kubatova A., Peterson S.W. Taxonomic revision of Eurotium and transfer of species to Aspergillus. Mycologia. 2013; 104 (4): 912-937.
20. Chen A.J., Hubka V., Frisvad J.C., Visagie C.M. et al. Polyphasic taxonomy of Aspergillus section Aspergillus (formerly Eurotium), and its occurrence in indoor environments and food. Studies in Mycology. 2017; 88: 37-135.
21. Aspergillus amstelodami. Aspergillus & Penicillium Database. Westerdijk Fungal Biodiversity Institute. Mode of access: http:// www.westerdijkinstitute.nl/Aspergillus/BioloMICS.aspx?Table=Aspergillus%20and%20Penicillium&Rec=11&Fields=All. Date of access: 20.10.18.
22. Miniatlas Mikroorganismu. Plisne. University of Chemistry and Technology Prague. - Mode of access: http://old.vscht.cz/ obsah/fakulty/fpbt/ostatni/miniatlas/images/plisne/. Date of access: 20.10.18.
23. Eurotium amstelodami. Media. Fungi and Lichens of Great Britain and Ireland. All Fungi. Mode of access: http://fungi.myspecies. info/all-fungi/eurotium-amstelodami. Date of access: 20.10.18.
24. Eurotium amstelodami. Taiwan fungal flora knowledge. Bioresource collection and Research Center. Mode of access: http:// www.bcrc.firdi.org.tw/fungi/fungal_detail.jsp?id=FU200802030004. Date of access: 20.10.18.
25. Khan Z., Ahmad S, Joseph L. Aerial prevalence of Aspergillus calidoustus isolates in and around a tertiary care hospital in Kuwait and assessment of their pathogenicity. J. Clin. Microbiol. 2014; 52 (9): 3402-3405.
26. Asgari B., Zare R., Zamanizadeh H., Rezaee S. Systematics of Aspergillus species of subgenus Nidulantes in Iran. Rostaniha. 2012; 13: 126-151.
27. Aspergillus calidoustus [Electronic resource]. Fun with microbiology (What's Buggin' You?). Short descriptions and photographs of some photogenic microorganisms. Mode of access: http://thunderhouse4-yuri.blogspot.com/2012/10/p.html. Date of access: 26.08.2019.
Поступила в редакцию журнала 26.08.2019
Рецензент: В.С. Митрофанов
