CC BY
21УДК 582.282.123.4
ВВЕДЕНИЕ
ВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ АСПЕРГИЛЛЕЗА ИЗ РОДА NEOSARTORYA MALLOCH & CAIN. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Рябинин И.А. (аспирант)*
Северо-западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова (кафедра медицинской микробиологии), Санкт-Петербург, Россия
© Рябинин И.А., 2014
В обзоре описаны морфологические и молекулярные подходы к видовой идентификации медицински значимых представителей рода Neosartorya. Даны подробные видовые описания N. fischeri, N. pseudofischeri, N. spinosa, N. hiratsukae, N. udagawae, а также ключ для идентификации на основании сканирующей электронной микроскопии. Кратко представлены данные о видовой идентификации с применением ДНК-сиквенирования.
Ключевые слова: аспергиллез, ДНК-сиквенирование, Neosar-torya
SPECIES IDENTIFICATION OF ASPERGILLOSIS CAUSATIVE AGENTS BELONGS TO GENUS NEOSARTORYA MALLOCH & CAIN. REVIEW OF LITERATURE
Ryabinin I.A. (postgraduate student)
Mechnikov North-Western State Medical University (Chair of Medical Microbiology), St. Petersburg, Russia
© Ryabinin I.A., 2014
Morphological and molecular approaches to identification of medical significant species belongs to genus Neosartorya have been described in this review. Detailed species descriptions of N. fischeri, N. pseudofischeri, N. spinosa, N. hiratsukae, N. udagawae are performed. Also is presented the intensification key based mainly on results of scanning electron microscopy. The data about species identification by DNA-sequencing are briefly described.
Key wards: aspergillosis, DNA-sequencing, Neosartorya
Контактное лицо: Рябинин Игорь Андреевич, Тел.: (812) 303-51-40
В обсуждении лабораторной диагностики инва-зивного аспергиллеза все чаще обращают внимание на проблему так называемых «криптических» видов. Это виды, представители которых обладают морфологическими характеристиками, близкими к наиболее частым возбудителям аспергиллеза - Aspergillus fumigatus, A. niger, A. flavus, практически значимым свойством которых является видоспецифичная резистентность к ряду антимикотиков (англ. intrinsic resistance). К таким видам относят, например, в секции Nigri - A. awamori, A. brasiliensis, A. carbonarius, A. tubingensis (двойники A. niger); а в секции Fumigati - A. fumigatiaffinis, A. fumisynnematus, A. lentulus и др. (двойники A. fumigatus).
Ключевые отличительные признаки данных видов (электронноптическая морфология, профиль микотоксинов, особенности 18Б-рибосомальных РНК-генов) обычно труднодоступны для исследования в диагностических лабораториях. Среди группы «криптических видов» особое место занимают представители рода Neosartorya spp., морфологически близкие A. fumigatus. Информация о них слабо представлена в отечественной литературе, в данном обзоре предпринята попытка восполнить это недостаток.
Историческая справка.
Анаморфную форму из данной группы впервые описал Wehmer в 1907 г. под названием Aspergillus fischeri. В 1972 г. D. Malloch и R.F. Cain опубликовали работу, посвященную известным и новым совершенным формам семейства Trichocomaceae, в которой дали описание рода Neosartorya, взяв в качестве типового вид A. fischeri [Malloch D., Cain R.F. // Canadian J.of Botany, 1972]. Во второй половине XX века в зарубежной литературе были опубликованы описания большинства видов неосарторий. Начало XXI века ознаменовалось для этой группы чередой открытий новых видов, что, очевидно, связано с внедрением в микологию молекулярных методов исследования.
Билай В.И. и Коваль Э.З. в единственном отечественном академическом определителе «Аспергил-лы» (1988) неосарторий поместили в группу A. fumigatus (старое деление рода), секцию A. fischeri. В этом разделе представлены описания N. aurati, N. aureoli, N. fennelliae, N. fischeri (N. fischeri var. glaber и N. fischeri var. spinosus), N. quadricincta, N. stramenii и их анаморф.
По-видимому, первый случай выделения Neosartorya sp. из мокроты (N. pseudofischeri), относится к 1929 г. Его клинические подробности не известны. Штамм возбудителя, выделенный в Вашингтоне доктором Сайерсом, был направлен известному микологу Тому Ч., который идентифицировал культуру как A. fischeri. Затем штамм перешел из его личной коллекции в музей культур Службы Сельскохозяйственных Исследований Сельскохозяйственного департамента США (ранее - NRRL, теперь - ARS Culture
*
Collection), позднее видовая принадлежность была пересмотрена Peterson S.W. [Peterson S.W. // Mycol. Res., 1992].
Систематическое положение и разнообразие.
Как и другие аспергиллы, неосартории относят к отделу Ascomycota, подотделу Pezizomycotina, классу Eurotiomycetes, порядку Eurotiales, семейству Tricho-comaceae. Неосартории на данный момент рассматривают в составе секции Fumigati рода Aspergillus, несмотря на то, что обозначаются иным родовым именем. Анаморфы неосарторий носят родовое имя Aspergillus. Neosartorya spp. составляют большую часть секции Fumigati и на сегодня насчитывают 25 видов. Это преимущественно почвенные грибы, некоторые из них поражают растения. Были описаны в качестве возбудителей микозов у человека представители 5 видов: N. fischeri, N. spinosa (=N. fischeri var. spinosa), N. pseudofischeri, N. udagawae, N. hirat-sukae. В научной литературе, среди прочих клинических изолятов секции Fumigati, также упоминают N. koreana и N. fennelliae, но их патогенность не была доказана [1].
Общая характеристика рода Neosartorya.
Неосартории - совершенные формы аспергиллов секции Fumigati, имеющие типичное для представителей данной секции строение органов бесполового спороношения. В культуре происходит половой процесс, который приводит к образованию закрытых плодовых тел - клейстотециев, или клейстокарпиев (аском). Клейстотеции покрыты псевдопаренхиматозным перидием из нескольких слоев уплощенных клеток. Аски тонкостенные, сферические, расположены нерегулярно, несут 8 аскоспор. Аскоспо-ры линзовидные, без перегородок и придатков, от стекловидных до бледно-желто-коричневых, чаще - с бугристой стенкой, несут 2-4 экваториальных гребешка. Среди неосарторий есть как гомоталли-ческие, так и гетероталлические виды. У последних для инициации полового процесса необходимо провести скрещивание особей с различными типами спаривания. Для этого на чашку с овсяным агаром на 4 сектора в шахматном расположении засевают штаммы-партнеры и инкубируют при 25-28 °С несколько недель. Клейстотеции в этом случае будут образовываться при слиянии колоний. Таким способом, например, были получены половые формы у A. fumigatus (N. fumigata) и A. lentulus.
Процесс образования клейстотециев описан Kwon-Chung и Kim у N. fennelliae. На молодых верхушечных ветвях гиф вегетативного мицелия образуются аскогенные гифы, которые спирально закручиваются. Завитки сближаются, аскогенная гифа начинает септироваться. Таким образом формируется зачаток клейстотеция - аскоген, к которому тянутся гифы противоположного знака спаривания (они могут образовываться у того же штамма или расти от колонии штамма-партнера) и сближаются с завитками. Аскоген оплетают тонкие гифы, внутри него происходит половой процесс, формируются аски [Билай
В.И., Коваль Э.З. Аспергиллы, 1988].
Неосартории могут расти на различных средах, пригодных для культивирования аспергиллов (агар Чапека в различных модификациях, агар с мальт-экстрактом, овсяный агар, агар с глюкозой и дрожжевым гидролизатом, креатин-сахарозный агар и др.). Неосартории по пигментации колоний можно разделить на 3 группы: образующие белые или кремовые колонии (N. coreana, N. denticulata, N. glabra, N. hiratsukae, N. pseudofischeri и ряд других); образующие золотисто-желтые или слегка желтоватые колонии, не содержащие патогенных представителей (N. aurata, N. aureola, N. lacinosa, N. multiplicata, N. stramenia); формирующие колонии с оттенками зеленого или серого цвета (N. udagawae, N. spathulata, N. fennelliae). Образование экссудата или диффундирующих пигментов не характерно. Neosartorya spp. -термофильные грибы [2].
Рис. 1. Микроморфология неосарторий по В.И. Билай и Э.З. Коваль, 1988: а, б - конидиальные головки N. fischeri; в - аски N. fischeri; г - конидии N. fischeri; д - аскоспоры N. fischeri; е - аскогенная гифа N. fennelliae; ж-и - формирование клейстотеция N. fennelliae; к - клейстотеций N. fennelliae; л - аски и аскоспоры N. fennelliae Описание медицински значимых видов Neosartorya spp.
Neosartorya fischeri (Wehmer) Malloch and Cain.
Анаморфная стадия - Aspergillus fischerianus Samson and W. Gams (ранее - A. fisheri Wehmer). Вид гомо-таллический.
Колонии на овсяном агаре быстрорастущие, мучнистые до войлоковидных, беловатые с серо-голубыми оттенками, до некоторой степени розоватые вокруг клейстотециев; обратная сторона колоний белого оттенка до розоватого. Хорошо растет при 37 °С.
Конидиеносцы гладкостенные, стекловидные до бледно-зеленых, 300-500 мкм. Конидиальные головки столбчатые, в завершении до некоторой степени радиальные, бледно-сине-серые, однорядные. Апикальное расширение колбовидное, в диаметре до 18 мкм. Стеригмы однорядные стекловидные до бледно-серо-зеленых. Конидии субсферические, бородавчатые, 2-3 х 2,0-2,5 мкм, бледно-серо-зеленые.
Клейстотеции с тонкой ломкой оболочкой из 2-3 слоев сплющенных клеток, окружены рыхлой сетью гиф (псевдопаренхиматозный перидиний), сферические, бледно-розовые, диаметром до 400 мкм. По-
являются клейстотеции одиночно или небольшими группами. Аски созревают одновременно и заполняют клейстотеций за несколько дней, быстро высвобождают аскоспоры. Аски сферические до субсферических, 8-споровые, 10-12 х 8-10 мкм. Аскоспоры субсферические двояковыпуклые, с двумя выдающимися, изгибающимися экваториальными гребешками, диаметром около 5 мкм (не включая гребешки), стекловидные, полушария несут анастомозирующие хребты (сеть).
Описан вариант N. fischri var. spinosus, который в последнее время именуют как отдельный вид N. spinosa (Raper & Fennel) Kozakiewicz. Ее анаморфная стадия - A. spinosus Kozakeiwicz. Этот вариант (вид) отличается гладкими конидиями, бледно-желтыми клейстотециями и иной орнаментацией аскоспор -выпуклые поверхности покрыты множеством шипов (от чего вид получил свое название).
Neosartorya pseudofischeri Peterson. Анаморфная стадия - A. thermomutatus (Paden) Peterson. Вид гомоталлический.
Колонии, образующиеся на агаре Чапека при 25 °С, состоят из низкого рыхлого воздушного мицелия высотой 1-5 мм, оборотная сторона колоний не окрашена или слегка желтоватая, экссудат и растворимый пигмент отсутствуют. Инкубация при 37 °С усиливает образование конидий. Колонии достигают диаметра на агаре Чапека 60-70 мм, на агаре Чапека с добавлением 20% сахарозы - 90 мм, на агаре с мальт-экстрактом - 90 мм.
На мальт-агаре при 25 С° колонии обильно образуют клейстотеции, а количество конидиальных головок ограничено, таким образом, внешний вид колоний обусловлен преимущественно клейстотеци-ями. Оборотная сторона колоний тускло-соломенного цвета. Образование конидий и клейстотециев возможно как при 25 °С, так и при 37 °С, в последнем случае интенсивнее образуются конидии и хуже -клейстотеции.
На овсяном агаре колонии быстрорастущие, мучнистые до войлоковидных, кремовые; оборотная сторона бледно-охристая.
Микроскопические характеристики на среде Чапека и агаре с мальт-экстрактом близки. Незрелые конидиальные головки вначале свободно-радиальные, но при созревании становятся свободно-столбчатыми. Споры в массе от темно-оливково-серого до желтоватого цвета. Конидиеносцы гладкие, стекловидные или слегка желтоватые, до 200-300 мкм длиной и 4-7 мкм в поперечнике, со стекловидным субсферическим апикальным расширением диаметром 10-17 мкм. Конидиеносцы возникают на поверхности колонии или от воздушных гиф. Стеригмы однорядные, стекловидные, ампулиформные, 8-11 мкм в длину и диаметром 3,5-5 мкм. Конидии сферические до субсферических, окрашены в оттенки зеленого, гладкостенные, диаметром 3-4 мкм.
Клейстотеции берут начало от свернутых в клубок гиф, с наружным слоем из уплощенных тесно
расположенных клеток и рыхлого мицелия. Клейстотеции диаметром 150-300 мкм содержат множественные аски, из которых при растворении стенки высвобождаются зрелые аскоспоры (обычно на 7-10 день). Аскоспоры субсферические размером 4,5-5 х 4,5-6 мкм, с двумя экваториальными поясками шириной 1 мкм. Выпуклая поверхность аскоспор орнаментирована сплетением приподнятых лопастей, по форме напоминающих треугольники или длинные ребристые хребты.
Neosartorya hiratsukae Udagawa, Tsubouchi & Horie. Анаморфная стадия А. hiratsukae Udagawa, ТзиЬоисЫ & Нопе. Вид гомоталлический.
На агаре Чапека при 25 °С, спустя 14 суток инкубации, рост ограниченный, колонии диаметром 1214 мм, бархатистые, нерегулярно-складчатые, с верхушкой, от белых до желтовато-белых. Оборотная сторона темно-желтая. Спороношение отсутствует.
На агаре с мальт-экстрактом при аналогичных условиях колонии растут быстрее и достигают диаметра 40-46 мм, бархатистые, радиально-складчатые, белые или зеленовато-белые с темно-желтой оборотной стороной. Клейстотеции и конидиальные головки образуются по всей поверхности культуры. Изоляты способны к ограниченному росту при 45 °С.
Конидиеносцы стекловидные до светло-зеленых, гладкие, с толстой стенкой, высотой 100-170 мкм и 4 мкм в поперечнике. Несут столбчатые конидиальные головки зеленого или голубовато-зеленого цвета с одним рядом стеригм. Конидии темно-зеленые, сферические или субсферические, диаметром 2-2,5 мкм, имеют гладкую или слегка бугристую оболочку.
Клейстотеции безостые, поверхностные, белые до светло-кремовых, сферические или субсферические, диаметром 120-600 мкм, покрыты белым воздушным мицелием. Аскоспоры стекловидные, одноклеточные, чечевицеобразные, с двумя тесно сближенными экваториальными гребешками, размерами 6-7,5 х 4-5 мкм (включая гребешки). Выпуклая поверхность аскоспор отчетливо орнаментирована сетчатым узором.
Neosartorya udagawae Нопе, М1уаД & МзЫшига. Анаморфа - А. udagawae Нопе, М1уаД & МзЫшига. Гетероталлический вид.
На агаре Чапека с дрожжевым экстрактом колонии широко распространяются, достигают в диаметре 82-85 мм на 14 день при 25 °С или 85 мм на 7 день при 37 °С; серо-зеленые или травянисто-зеленые. Спороношение обильное. Оборотная сторона колоний бледно-золотистая или светло-золотистая.
На агаре с мальт-экстратом колонии быстро распространяющиеся, белые или желтоватые до бледно-зеленых. Спороношение обильное. Оборотная сторона светло-золотистая до серо-золотистой. На овсяном агаре колонии быстро распространяющиеся, плоские, зелено-серые или травянисто-зеленые. Спороношение обильное. Оборотная сторона серо-коричневая.
Мицелий состоит из стекловидных, ветвистых,
септированных гладкостенных гиф. Конидиальные головки серо-зеленые до тускло-зеленых, столбчатые, 95-145 х 20-50 мкм. Конидиеносцы берут начало от воздушных гиф или базального мицелия, стекловидные до темно-желтовато-коричневых, гладкие, длиной до 530 мкм, ширина в центральной части составляет 4-6 мкм. Апикальное расширение бесцветное до зеленоватого, полусферическое до колбовид-ного, диаметром 12-15 мкм. Стеригмы однорядные, бесцветные до зеленоватых, покрывают верхнюю половину головки, 5-7 х 2-2,5 мкм. Конидии стекловидные, серо-зеленые до тускло-зеленых в массе, субсферические до широкоэллипсоидных, гладкие -2,6-3,2 х 2,4-2,6.
Клейстотеции поверхностные, сначала белые, затем становятся желтовато-белыми до светло-желтых, сферические или субсферические до овальных, размером 310-620 х 280-530 мкм, окружены рыхлым воздушным мицелием из стекловидных до темно-желтовато-коричневых гиф 2-3 мкм в поперечнике. Перидий стекловидный до темно-желтовато-коричневого, тонкий, пленчатый, состоит из угловатых клеток диаметром 2-12 мкм. Клейстотеции образуются только при скрещивании штаммов с разноименными типами спаривания. Аски 8-споровые, сферические до субсферических, 11-12 х 9-12 мкм, при созревании аскоспор быстро разрушаются. Аскоспоры стекловидные до тускло-желтовато-коричневых, широко-линзовидные, тело споры 5-5,5 х 4-5 мкм, снабжено двумя экваториальными гребешками шириной до 1 мкм, которые часто бывают неправильной формы, выпуклая поверхность аскоспор бугристая.
Морфологическая идентификация неосар-торий, в силу ряда обстоятельств, затруднена. Несмотря на то, что агар Сабуро является основной питательной средой, которую используют для первичного посева при диагностике микозов, в научной литературе нет ни одного описания колоний неосар-торий на этой среде. Во всех случаях, когда изоляты Aspergillus spp. не удается идентифицировать до вида в первичном посеве, их необходимо субкультивиро-вать после трехточечного посева на двух средах: агаре Чапека с дрожжевым экстрактом (CYA) и агаре с мальт-экстрактом. Для неосарторий эта комбинация включает также овсяный агар. Только используя эти среды, можно воспроизвести макро- и микроморфологические свойства изолята, годные для работы с определителями аспергиллов и их телеоморф.
Диаметр, рельеф и цвет колоний являются значимыми признаками. Приведенные виды, кроме N. udagawae, по цвету колонии контрастно отличаются от типичных штаммов A. fumigatus. Однако на практике встречаются штаммы A. fumigatus со слабой пигментацией, иногда вовсе отсутствующей, медленным ростом и слабым конидиогенезом. Такие штаммы могут восстанавливать типичную морфологию при последовательных пассажах на различных средах, но могут и сохранять ее (мутанты - «лейкорас-сы», по П.Н. Кашкину).
По строению органов бесполого спороношения можно различить неосартории между собой, а отличить от A. fumigatus практически невозможно.
Наиболее информативным морфологическим исследованием для идентификации неосарторий является сканирующая электронная микроскопия аско-спор. Рельеф аскоспор уникален для каждого вида, но срок формирования клейстотециев, даже у авторов, впервые описавших вид, часто не указывается. Известно, что он может быть довольно длительным, что неприемлемо для диагностических исследований. Таким образом, морфологию полового споро-ношения лучше оценивать ретроспективно и использовать альтернативные подходы к идентификации.
В современных медицинских определителях грибов разделы по неосарториям либо представлены фрагментарно, либо вовсе отсутствуют. «Atlas of Clinical Fungi» под редакцией de Hoog G.S. и соавторов содержит краткие описания N. fischeri, N. pseu-dofischeri и N. spinosa, которые снабжены электронными микрофотографиями, но фото колоний этих грибов не представлены [2]. В определителе Саттон Д., Фотергилл А. и Ринальди М. приведена только N. fischeri, а в «Атласе условно-патогенных грибов рода Aspergillus - возбудителей бронхолегочных инфекций» Кулько А.Б. нет описания представителей Neo-sartorya spp.
Для идентификации Neosartorya spp. рекомендую две работы. Труд «Polyphasic taxonomy of Aspergillus section Fumigati and its teleomorph Neosartorya», созданный плеядой признанных экспертов по аспер-гиллам Samson R.A., Hong S., Peterson S.W., Frisvad J.C. и Varga J. [3], является единственным изданием, где наиболее полно описано биологическое разнообразие и морфологические свойства неосарторий. Работа богато иллюстрирована светооптическими микрофотографиями, полученными с помощью техники дифференциально-интерференционного контрастирования (DIC); помещены фотографии колоний на различных средах.
Horie Y. и соавторы в статье «Two new species of Neosartorya from Amazonian soil, Brazil» (2003), помимо видовых описаний N. indohii и N. tsurutae и их анаморф, составили уникальный дихотомический ключ для морфологической идентификации неосар-торий (таблица, ключ представлен в адаптированном переводе автора).
Таблица
Дихотомический ключ для видовой идентификации неосарторий (по Y. Horie et al. (2003) с некоторыми изменениями):
1а Гриб гетероталлический 2
1б Гриб гомоталлический 6
2а Клейстотеции сохраняют белый цвет 3
2б Клейстотеции бледно-желтые до светло-желтых 4
3а Аскоспоры с двумя экваториальными гребешками, выпуклые поверхности с отчетливым мозговидным рисунком, конидии сферические до субсферических N. fennelliae
3б Аскоспоры с двумя широкими экваториальными гребешками и шиповатой выпуклой поверхностью, конидии эллиптические N. nishimurae
4а Аскоспоры несут два экваториальных или несколько нерегулярных гребешков, выпуклая поверхность бугорчатая, конидиеносцы гладкие N. udagawae
4б Аскоспоры с двумя экваториальными гребешками, другие характеристики отличаются от п. 4а 5
5а Выпуклая поверхность аскоспор почти гладкая, конидиеносцы заметно шероховатые N. spatulata
5б Выпуклая поверхность аскоспор бугорчатая или дольчато-сетчатая, конидиеносцы гладкие N. otanii
6a Аскоспоры несут отчетливые экваториальные гребешки 7
6б Аскоспоры без выраженных экваториальных гребешков 23
7а Клейстотеции и покрывающие их гифы бледные, или бледно-желтые, или кремовые 8
7б Клестотеции и покрывающие их гифы желтые, золотистые или оранжевые 21
8а Аскоспоры несут экваториальные гребешки с цельным контуром 9
8б Экваториальные гребешки на аскоспорах зубчатые или изрезанные N. indohii
9а Аскоспоры с четырьмя экваториальными гребешками 10
9б Аскоспоры с двумя экваториальными гребешками 11
10а Выпуклая поверхность аскоспор слегка решетчатая или нерегулярно-ребристая N. quqdricincta
10б Выпуклая поверхность аскоспор складчатая до морщинистой N. tsurutae
11а Выпуклая поверхность аскоспор решетчатая 12
11б Выпуклая поверхность аскоспор другая 15
12а Выпуклая поверхность аскоспор слабо рельефная, слегка решетчатая N. hiratsukae
12б Выпуклая поверхность аскоспор с отчетливым или даже резким сетчатым рисунком 13
13а Выпуклая поверхность аскоспор сетчатая или с нерегулярным решетчатым рисунком N. fischeri
13б Выпуклая поверхность аскоспор с регулярным мелкосетчатым рисунком 14
14а Терминальное расширение конидиеносца полусферическое или колбовидное N. tatenoi
14б Терминальное расширение конидиеносца эллиптическое или почти булавовидное N. delicata
15а Аскоспоры несут плотно прижатые и очень низкие экваториальные гребешки, выпуклая поверхность мелкобугорчатая N. sublevispora
15б Аскоспоры несут отчетливо раздельные экваториальные гребешки 16
16а Выпуклая поверхность аскоспор в сканирующем электронном микроскопе бугорчатая, в световой микроскоп — почти гладкая, экваториальные гребешки широко разделены N. glabra
16б Выпуклая поверхность аскоспор с отчетливым рисунком 17
17а Экваториальные гребешки на аскоспорах на небольшом расстоянии друг от друга 18
17б Экваториальные гребешки на аскоспорах широко расставлены 19
18а Выпуклая поверхность аскоспор шероховатая или отчетливо шиповатая N. spinosa
18б Выпуклая поверхность аскоспор покрыта рельефом из треугольных лопастей N. pseudo-fischeri
19а Выпуклая поверхность аскоспор покрыта мелкими шипами и иглами или мелкобугорчатая 20
19б Выпуклая поверхность аскоспор с грубыми выступами, расположенными кругами, и мелкобугристая N. takakii
20а Выпуклая поверхность аскоспор мелкошиповатая и иглистая с длинными хребтами N. botucatensis
20б Выпуклая поверхность аскоспор нерегулярно-ребристая благодаря мелким бородавчатым и треугольным выступам N. paulistensis
21а Клейстотеции крупные (большинство в диаметре превышают 200 мкм), выпуклая поверхность аскоспор шиповатая N. aureola
21б Клейстотеции мелкие, менее 200 мкм в диаметре, выпуклая поверхность бородавчатая 22
22а Аскоспоры с выдающими экваториальными гребешками, клейстотеции светло-белые, конидии с мелкобородавчатой оболочкой N. stramenia
22б Аскоспоры с низкими экваториальными гребешками, клейстотеции оранжевые, конидии с дольчато-сетча-той оболочкой N. aurata
23а Аскоспоры с довольно неправильным рисунком, состоящим из нескольких узких гряд и треугольных или бородавчатых выступов N. primulina
23б Аскоспоры покрыты рисунком из нескольких гряд, сетчато-ребристым узором N. multiplicata
В ключе не представлена N. fumigata и половая стадия А. 1впШ1ш; авторы, впервые получившие ее, не дали специального названия.
Наиболее сложной задачей является разделение изолятов A. fumigatus и A. udagawae. Оба вида ге-тероталлические и обладают сходной пигментацией колоний. Sugui J.A., et al. провели сравнительное исследование биологических свойств штаммов этих видов. Оказалось, что A. udagawae не способен расти при температуре выше 42 °С, но хорошо растет при 10 °С; штаммы этого вида на агаре Чапека-Докса образуют розово-пурпурный растворимый пигмент, диффундирующий в среду. В гистологических препаратах, приготовленных из очагов аспергиллезной инфекции человека и лабораторных животных, видно своеобразие тканевой формы A. udagawae - в гифах образуются интеркалярные сферические расширения неодинакового диаметра, расположенные иногда цепочками [4].
Видовая идентификация с применением
молекулярных методов.
Отдельные авторы сообщали об успешном использовании ДНК-сиквенирования по генам актина, р-тубулина (последний - в комбинации с ITS), гидрофобина A [5], 1 и 2 фланкирующему региону 5,8S рДНК (ITS1-5,8S-ITS2) [6], гену кальмодулина [7], гену gliP; митохондриальному гену цитохрома b [Wang L., et al. // J. Clin. Microbiol., 2000]. Сиквени-рование микромицетов предпочтительно проводить не по Сенджеру, а используя более быстрые техники, например, «сиквенирование путем синтеза» (ионное полупроводниковое сиквенирование, пиросиквени-рование).
Есть также сообщение об успешном распознавании неосарторий RAPD-PCR [Brandt M.E., et al. //J. Clin. Microbiol., 1998].
В то же время, имеются данные, что сиквениро-ванием по D2 региону 28S рДНК не смогли верно идентифицировать N. udagawae, распознав ее как A. fumigatus [5].
В идентификацию мицелиальных грибов входят физико-химические методы, такие как MALDI-TOF-масс-спектрометрия и инфракрасная спектроскопия с преобразованиями Фурье (FTIRS), но, что касается идентификации аспергиллов, данными методами еще не показана состоятельность в этой проблеме, даже в сравнении с морфологическим исследованием. Применение FTIRS в микологии пока еще очень ограничено, и соответствующий опыт не опубликован. В отношении MALDI-TOF-MS проблема более очевидна - необходимо пополнение библиотек масс-спектров для идентификации соответствующими белковыми масс-спектро-профилями.
Штамм N. fischeri NRRL 181 прошел процедуру полногеномного сиквенирования, его геном аннотирован.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При диагностике аспергиллеза, с учетом наличия «криптических» видов (рода Neosartorya и других), целесообразно придерживаться следующего алгоритма:
1. При периодическом просмотре посевов, после обнаружения спороношения в колониях, необходимо провести микроскопическое исследование, попытаться определить изолят до секции. Сделать выводы о значимости изолята по характеру роста. Выдать ответ врачу. Примерный вид ответа на этом этапе: «В посеве мокроты обнаружен Aspergillus sp. секции Fu-migati в значимом количестве».
2. Если в посеве нет других мицелиальных грибов и спороношение культуры достаточное, поставить
тест определения чувствительности по протоколу EUCAST E.DEF 9.1. Если в посеве имеются другие мицелиальные грибы, то изоляты нужно рассеять. Изолят Aspergillus sp., в любом случае, следует отсеять на агар Чапека с дрожжевым экстрактом и мальт-агар (на чашках) и классический агар Чапека (в пробирке), инкубировать посев при 25-28 °С; а также на CYA или агаре Сабуро (в пробирке) при 50 °С.
3. Дождаться завершения инкубации микропланшета с разведениями антимикотиков (48 ч при 35 °С). Зарегистрировать минимальные ингибирующие концентрации антимикотиков, обсудить полученные значения с лечащим врачом.
4. По результатам рассевов культуры, проведенных в п. 2, провести экспертную морфологическую идентификацию, при необходимости и наличии возможности ДНК-сиквенирование по избранным ло-кусам (см. выше). Выдать окончательный ответ с указанием установленного вида.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
Balajee S.A., et al. Aspergillus species identification in the clinical setting// Studies in Mycology. - 2007. - № 59. - P. 39-46. De Hoog G.S., Guarro J., Gene J., Figuares M.F. Atlas of clinical fungi. 3Nd ed. — Utrecht.: CBS, 2011. — 1126 pp. Samson R.A., Hong S., Peterson S.W., et al. Polyphasic taxonomy of Aspergillus section Fumigati and its teleomorph Neo-sartorya// Studies in Mycology. - 2007. - № 59. - P. 147-203.
Sugui J.A., et al. Neosartorya udagawae (Aspergillus udagawae), an emerging agent of aspergillosis: how different is it from Aspergillus fumigatus?// J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48, Is. 1. - P. 220-228.
Balajee S.A., et al. Mistaken identity: Neosartorya pseudofischeri and its anamorph masquerading as Aspergillus fumiga-tus// J. Clin. Microbiol. - 2005. - Vol. 43, Is. 12. - P. 5996-5999.
Vinh D.C., et al. Invasive aspergillosis due to Neosartorya udagawae// Clin. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 49, Is. 1. - P. 102-111. Posteraro B., et al. Uncommon Neosartorya udagawae fungus as a causative agent of severe corneal infection// J. Clin. Microbiol. - 2011. - Vol. 49, Is. 6. - P. 2357-2360.
Поступила в редакцию журнала 01.04.2014 Рецензент: С.Н. Хостелиди
