CC BY
61
№ 1 - 2011 г. 14.00.00 медицинские науки
УДК 616-006.68:576.31
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМОЙ КАРЦИНОСАРКОМЫ WALKER 256 ПОД ВЛИЯНИЕМ МЕЛАТОНИНА
11 2 3 1
Е.В. Овсянко , А.В. Ефремов , Е.Л. Лушникова , Д.В. Морозов , Я.У. Овсянко
1 ГОУ ВПО «Новосибирский медицинский университет»
(г. Новосибирск)
ГУ «НИИрегиональной патологии и патоморфологии СО РАМН»
(г. Новосибирск)
3 ^
МУЗ «Городская клиническая больница № 1»
(г. Новосибирск)
Методами световой микроскопии исследована динамика морфологических показателей в перевиваемой карциносаркоме Walker 256 (W 256) крыс-самцов линии Wistar на фоне применения мелатонина. Суспензию клеток перевиваемой W 256 вводили животным в мышцу бедра в дозе 1 х 106 клеток. Мелатонин вводился в дозе 0,3 мг/кг внутрибрюшинно в течение 3-х, 7-и и 14-и суток, спустя 5 суток с момента перевивки W 256. Показатель митотической активности в группе животных, получавшей мелатонин, был ниже соответствующего показателя группы со «спонтанным» развитием W 256. Показатель апоптотического индекса был значительно выше на протяжении всего срока эксперимента, а показатель уровня дистрофических изменений опухолевых клеток был выше на 3-и и 7-е сутки эксперимента по сравнению с контролем. Объем опухоли на 3-и сутки эксперимента был больше в 5,78 раза по сравнению с контролем, в дальнейшем данный показатель имел тенденцию к снижению. Таким образом, мелатонин не оказывает ингибирующего эффекта на рост W 256 in vivo. Наши результаты позволили предположить, что ингибирующий эффект действия мелатонина реализуется последовательно на стадиях инициации, промоции и прогрессии развития опухоли.
Ключевые слова: карциносаркома Walker-256, световая микроскопия, мелатонин
Овсянко Елена Владимировна - кандидат медицинских наук, доцент кафедры анатомии, гистологии и биологии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: Vin [email protected]
Ефремов Анатолий Васильевич - доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заведующий кафедрой патологической физиологии и клинической патофизиологии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», телефон рабочий: 8 (383) 225-39-78
Лушникова Елена Леонидовна - доктор биологических наук, профессор, заместитель директора ГУ «НИИ региональной патологии и патоморфологии СО РАМН», e-mail: Vin [email protected]
Морозов Дмитрий Вильевич - кандидат медицинских наук, врач-патологоанатом МУЗ «Городская клиническая больница № 1», e-mail: Vin [email protected]
Овсянко Ясит Умеровна - кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры анатомии человека ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», телефон рабочий: 8 (383) 225-15-24
На протяжении последних лет лекарственная терапия злокачественных новообразований переживает свое второе рождение. Стремительное развитие фундаментальной науки выводит лекарственное лечение на качественно иной уровень. Благодаря более глубокому пониманию механизмов внутриклеточной передачи сигнала и регуляции клеточного цикла, мы стали свидетелями создания и появления в клинической практике препаратов целенаправленного действия - так называемых таргетных препаратов. Это явилось фундаментом для развития направления по поиску новых путей подавления опухолевого роста, названного биотерапией рака и призванного встать в будущем направлением, основанным на патогенетических методах лечения больных злокачественными новообразованиями.
Одним из самых существенных моментов противоопухолевой борьбы в настоящее время является активация системы специфической Т-клеточной зависимости. В настоящее время ни у кого не возникает сомнений, что злокачественные новообразования связаны с нарушением иммунологического надзора против онкогенных вирусов или аномальных клеток. По данным исследований, препараты на основе гормона эпифиза - мелатонина -эффективны в комплексном лечении рака [11], в основе которого заложен принцип «комплементарной онкотерапии» [10]. Установлено, что применение этого гормона приводит к активации Т-хелперов 1 типа и стимуляции продукции этими клетками у-ИФН и ИЛ-2. Выявлено, что использование мелатонина приводит к повышению эндогенной продукции моноцитами ИЛ-1, ИЛ-6 и ИЛ-12, играющими важную роль в механизмах неспецифической и противоопухолевой защиты. Ранее нами было продемонстрировано тормозящее действие мелатонина на пролиферативную активность клеток карциносаркомы Walker 256 (W 256) и повышение уровня апоптоза [6]. Имеются данные о протективном действии мелатонина при канцерогенезе [13] и свободнорадикальном повреждении [9] структур, направленном на поддержание замкнутого контура регуляции свободнорадикальных реакций по принципу отрицательной обратной связи. Нарушение динамического равновесия между антиоксидантной и радикальной физиологическими константами может стать патогенетической основой окислительного стресса и свободнорадикальной патологии [12]. Известно, что одним из универсальных механизмов канцерогенеза является окислительный стресс [4]. Полученные нами ранее результаты также свидетельствуют, что у животных с W 256, получавших мелатонин, отмечалось значительное увеличение активности реакций перекисного окисления липидов в сыворотке крови [2] с одновременным подавлением продукции свободных радикалов кислорода и стимулирование системы антиоксидантной защиты [2, 3].
Методика исследования. В эксперименте использовали крыс-самцов породы линии Wistar массой 180-200 г. Работу с животными проводили с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации. Использовали перевиваемый штамм опухоли W 256, поддерживаемый in vivo (лаборатория физиологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). Суспензию клеток перевиваемой W 256 вводили животным в мышцу бедра в дозе 1 х 106 клеток в 0,1 мл изотонического раствора NaCl
[7]. Через 5 суток с момента перевивки W 256 измеряли ее размеры штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях и определяли объем опухоли.
Животных разделили на 2 группы (n = 7): 1-я группа - контрольная со «спонтанным» развитием W 256; 2-я группа - животные с W 256 при воздействии мелатонином (ICN Biomedicals Inc. USA). Мелатонин вводился в дозе 0,3 мг/кг внутрибрюшинно в течение 3-х, 7-ми и 14-ти суток, спустя 5 суток с момента перевивки W 256. Животных содержали при фиксированном световом режиме (свет - темнота 12:12). Для получения образцов опухоли крыс декапитировали под эфирным наркозом: 1 -я группа - на 5-е, 7-е и 14-е сутки с момента перевивки карциносаркомы W 256; 2-я группа - на 3 -и, 7-е и 14-е сутки с момента введения мелатонина. Гистологические препараты W 256 окрашивали гематоксилином и эозином. Методами световой микроскопии были определены митотический индекс (учтено не менее 5 тыс. клеток); объемная плотность зон клеток с некротическими изменениями; объемная плотность дистрофически измененных опухолевых клеток; объемная плотность паренхимы опухоли; апоптотический индекс. Морфометрическое исследование изучали на фотографических снимках, сделанных при помощи моторизованного микроскопа M200 (Zeiss) и камерой AxioCam HRc (Zeiss) с конечным увеличением *630. Подсчет осуществляли с помощью компьютерной программы Axio Vision - Release 4.7.1. (Zeiss) и блока автоматических измерений (Auto measure). Для каждой группы оценивалось по 40 изображений. Площадь препарата, получаемого на одном изображении, составляла 39 437 мкм2.
Полученные в экспериментах цифровые данные обрабатывали с использованием общепринятых методов статистики [1], вычисляя среднюю арифметическую величину (М), ошибку репрезентативности средней величины (m) и уровень значимости различий средних величин (р) на основании t - критерия Стьюдента для уровня достоверности 95 % (Р < 0,05).
Результаты исследования. Объективным критерием действия препаратов является показатель митотической активности. На протяжении всего срока эксперимента уровень показателя митотической активности в группе животных, получавшей мелатонин, был ниже соответствующего показателя контроля в большей степени на 3-и и 7-е сутки в
1,54 и 1,51 раза соответственно (табл. 1), что свидетельствовало о замедлении роста опухоли. К концу эксперимента отмечали его некоторое увеличение, но прирост оставался незначительным (табл. 1). Это, по-видимому, связано с включением некоторых опухолевых потенций, а также тем, что еще не успевают полностью элиминировать из опухоли поврежденные клетки. При этом в группе контроля уровень показателя митотической активности оставался высоким в течение всего срока эксперимента, достигая своего максимального значения на 5-е сутки, что является необходимым условием для прогрессии и малигнизации опухоли в дальнейшем, так как создается материал для естественного отбора клеток, наиболее приспособленных к автономному развитию и резистентных к иммунной защите организма [8]. Ранее нами был продемонстрировано, что клеточный состав опухоли представлен двумя морфологическими отличающимися субпопуляциями клеток [5], которые морфологически не изменялись при дальнейшем развитии опухоли.
Таблица 1
Морфологические показатели карциносаркомы Walker 256 при спонтанном развитии и при воздействии мелатонином (M ± m)
Исследуемые группы Морфологические показатели, %
Митотическая активность, %о Объемная плотность дистрофии клеток, % Объемная плотность паренхимы опухоли, % Объемная плотность некрозов, % Апоптотический индекс
Walker 256
5-е сутки 34,8 ± 1,4 16,2 ± 1,9 88,5 ± 1,8 5,4 ± 2,6 0,7 ± 0,2
7-е сутки 30,0 ± 1,2 18,8 ± 1,6 86,4 ± 2,3 5,9 ± 1,8 1,2 ± 0,5
14-е сутки 29,5 ± 1,3 20,2 ± 5,5 82,4 ± 1,9 7,0 ± 2,4 2,5 ± 1,2
Walker 256 + мелатонин
3-и сутки 22,5 ± 1,8* 29,6 ± 1,8* 79,6 ± 2,4 9,7 ± 3,2 6,5 ± 0,8*
7-е сутки 19,9 ± 0,8* 32,5 ± 1,4* 76,8 ± 2,7 11,4 ± 3,3 7,7 ± 1,2*
14-е сутки 24,5 ± 0,5* 33,8 ± 2,7 77,4 ± 3,3 11,0 ± 3,7 8,2 ± 0,7*
Примечание: воздействие мелатонином (М) проводили спустя 5 суток с момента перевивки, в течение 3-х, 7-и и 14 суток; * - достоверность различий р < 0,05 по сравнению с животными со «спонтанным» развитием карциносаркомы Walker 256, соответствующего срока эксперимента.
Были выявлены значительные дистрофические изменения опухолевых клеток при воздействии мелатонином. В полях опухолевой ткани атипичные клетки располагались тесно друг к другу в виде цепочек клеток с более скудной цитоплазмой и неправильно округлыми ядрами с неравномерно распределенным хроматином. Показатель уровня дистрофических изменений опухолевых клеток был значительно выше на 3 -и и 7-е сутки эксперимента по сравнению с контролем в 1,83 и 1,73 раза соответственно (табл. 1). В кариометрических данных отмечали нарастание числа крупных клеток, что сопровождалось сдвигом ядерно-цитоплазматического соотношения с появлением укрупненных ядрышек, часто по два-три в ядре. В группе контроля опухолевая ткань характеризовалась некоторым уменьшением размеров клеток, гиперхромностью ядер в клетках, компоновалась в пластах, тяжах, солидных комплексах, часть клеток эпителиального компонента приобретала перстневидный характер со смещением ядер к периферии. Между клетками формировались кровеносные сосуды синусоидного типа, число которых увеличивалось к концу эксперимента.
На всех сроках эксперимента при воздействии мелатонином были обнаружены тенденции в сторону уменьшения опухолевой паренхимы по сравнению с соответствующим показателем группы со «спонтанным» развитием опухоли (табл. 1). Уменьшение площади паренхимы обусловлено увеличением зоны некроза, нарастающим отеком, ишемическими кровоизлияниями. С увеличением количества поврежденных клеток возрастала тенденция частоты и размеров участков некроза, выявляемые как в центральных, так и в периферических отделах опухолевой ткани (табл. 1). Однако, несмотря на отсутствие достоверных различий, на протяжении всего эксперимента происходила структурно-функциональная перестройка опухоли, отражающая степень выраженности повреждения опухоли и эффективности проведенного воздействия.
При анализе апоптотического индекса были выявлены апоптотические клетки. Они выглядели как округлые или овальные скопления интенсивно эозинофильной цитоплазмы с плотными фрагментами ядерного хроматина без воспалительной реакции вокруг. Поскольку формирование апоптотических телец происходит быстро, и также быстро они
подвергаются фагоцитозу, то на гистологических препаратах они обнаруживались в случаях значительной выраженности. В сравниваемых группах они были представлены во всех без исключения группах, отличаясь лишь по степени выраженности, являясь, по сути, показателем местных иммунных реакций. Если в контрольной группе они представлены лишь единичными клетками на протяжении всего срока эксперимента, что свидетельствовало об угнетении этой реакции, то в группе при воздействии мелатонином отмечена активация клеточной реакции с увеличением числа апоптотических телец, со снижением этого показателя к концу эксперимента (в 9,29; 6,42 и 3,28 раза соответственно) (табл. 1).
Важно отметить, что при воздействии мелатонином объем опухоли на 3-и сутки эксперимента был больше в 5,78 раза по сравнению с контролем, на 7-е и 14-е сутки опыта данный показатель имел тенденцию к снижению, однако достоверные различия выявлены не были по сравнению с группой со «спонтанным» развитием опухоли (табл. 2).
Таблица 2
Объем карциносаркомы Walker 256 при спонтанном развитии и при воздействии мелатонином (M ± m)
Исследуемые группы 5-е сутки после З перевивки, см 7-е сутки после З перевивки, см 14-е сутки после З перевивки, см
Walker 25б 2,51 ± 0,42 25,51 ± 5,42 37,67 ± 3,48 I
З-и сутки после воздействия 7-е сутки после воздействия 14-е сутки после воздействия
Walker 25б + мелатонин 14,53 ± 1,52* 17,63 ± 1,68 26,43 ± 4,12
Примечание: воздействие мелатонином (М) проводили спустя 5 суток с момента перевивки в течение 7 и 14 суток; * - достоверность различий р < 0,05 по сравнению с животными со «спонтанным» развитием карциносаркомы Walker 256 соответствующего срока эксперимента.
Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что мелатонин не оказывает ингибирующего эффекта на рост W 256 in vivo. Наши результаты позволили предположить, что ингибирующий эффект действия мелатонина реализуется последовательно на стадиях инициации, промоции и прогрессии развития опухоли.
Список литературы
1. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. - М., 1999.
2. Ефремов А. В., Мичурина С. В., Начаров Ю. В. [и др.] // Вестн. новых мед. технологий. - 2008. - Т. XV, № 3. - С. 22-24.
3. Ефремов А. В., Овсянко Е. В., Сафронов И. Д. [и др.] // Патол. физиология и эксперим. терапия. - 2009. - № 3. - С. 27-29.
4. Меньщикова Е. Б. Окислительный стресс : патологические состояния и заболевания / Е. Б. Меньшикова, Н. К. Зенков, В. З. Ланкин [и др.]. - Новосибирск : АРТА, 2008.
5. Овсянко Е. В., Ефремов А. В., Мичурина С. В. [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2009. - Т. 147, № 9. - С. 337-342.
6. Овсянко Е. В., Ефремов А. В., Лушникова Е. Л. [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2009. - Т. 147, № 10. - С. 455-460.
7. Хегай И. И., Попова Н. А., Ганилова Л. С. [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и
медицины. - 2008. - Т. 145, №1. - С. 88-90.
8. Шапот В. С. // Вопросы онкологии. - 1980. - № 3. - С. 103-108.
9. Ferreira A. C., Martins E. Jr., Afeche S. C. [et al.] // Life Sci. - 2004. - Vol. 75, N
79. - Р. 2291-2302.
10. Klaschka F. // Forum-Med. ; Verl.-Gess, 1996. - P. 15-19.
11. Maestroni G. J. // Expert. Opin Investig. Drugs. - 2001. - Vol. 10, N 3. - Р. 467-
476.
12. McCall M. R., Frei B. // Free Radical Biol. Med. - 1999. - Vol. 26. - P. 1034-1053.
13. Wang X., Quinn P. J. // Progres. Lipid Res. - 1999. - Vol. 38. - P. 309-336.
MORPHOLOGICAL DATA OF REINOCULATED CARCINO-SARCOMA WALKER 256 UNDER THE MELATONIN INFLUENCE
11 2 3 1
E.V. Ovsyanko , A.V. Efremov , E.L. Lushnikova , D.V. Morozov , Y.U. Ovsyanko
Novosibirsk State Medical University (c. Novosibirsk)
SU «SRI of Regional Pathology and Pathomorphology SD RAMS»
(c. Novosibirsk)
SGH «City Clinical Hospital №1» (c. Novosibirsk)
In the use of melatonin the morphological data dynamics in re-inoculated carcino - sarcoma Walker 256 (W 256) of mail rats is studied with luminous microscopy methods. The suspension of cells in re-inoculated W 256 was introduced in a rat thigh muscle in the dose of 1 x 10'6 cells. Melatonin was inoculated in the dose of 0,3 mg/kg intra-abdominally through 3-d, 7-th and 14-th day, after 5 days since the inoculation of W 256. In a group of rats with the reception of melatonin, the mitosis activity index was lower than that one with «spontaneous» W 256 development. Apopthosis index was significantly higher during the experiment, and malignant cells' dystrophy changes level was higher on the 3-d and 7-th days of experiment, compared to check data. In comparison with control, the tumor size was 5,78 times greater on the 3-d day, the latter had the further tendency to reduce. So, melatonin has no inhibitory influence on W 256 growth in vivo. Our findings made us think the melatonin action inhibitory effect be realized subsequently through the stages of initiation, promotion and tumor‘s development progression.
Keywords: carcino-sarcoma Walker-256, luminous microscopy, melatonin
About authors:
Ovsyanko Elena Vladimirovna - medical sciences candidate, assistant professor at anatomy, histology and biology department SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», e-mail: [email protected]
Efremov Anatoliy Vasilyevich - doctor of medical sciences, professor, correspondent member RAMS, head of pathological physiology and clinical pathophysiology department SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», office telephone 8(383) 225-39-78
Lushnikova Elena Leonidovna - doctor of biological sciences, professor, vice-director SU «SRI of Regional Pathology and Pathomorphology SD RAMS», e-mail: [email protected]
Morozov Dmitriy Vasilyevich - medical sciences candidate, pathologoanatomist SGH «City Clinical Hospital №1», e-mail: [email protected]
Ovsyanko Yasit Umerovna - medical sciences candidate, senior teacher at human anatomy department SEI HPE «Novosibirsk State Medical University», office telephone: 8(383) 225-1524
List of the Literature:
1. Glanz S. Medico-biological statistics / S. Glanz. - M., 1999.
2. Efremov A.V., Michurina S.V., Nacharov Y.V. [et. al.] // Bulletin of new medical
technologies. - 2008. - V. XV, № 3. - P. 22-24.
3. Efremov A.V., Ovsyanko E.V., Safronov I.D. [et. al.] // Pathological physiology and experimental therapy. - 2009. - № 3. - P. 27-29.
4. Menshchikova E.B. Oxidizing stress: pathological states and diseases / E.B.
Menshchikova, N.K. Zenkov, V.Z. Lankin [et.al.]. - Novosibirsk: ARTA, 2008.
5. Ovsyanko E.V., Efremov A.V., Michurina S.V. [et. al.] // Experimental Biology and Medicine Bulletin. - 2009. - V. 147, № 9. - P. 337-342.
6. Osyanko E.V., Efremov A.V., Lushnikiva E.L. [et. al.] // Experimental Biology and Medicine Bulletin. - 2009. - V. 147, № 10. - P. 455-460.
7. Hegai I.I., Popova N.A., Ganilova L.S. [et.al.] // Experimental Biology and Medicine Bulletin. - 2008. - V. 145, № 1. - P. 88-90.
8. Shapot V.S. // Oncological Questions. - 1980. - № 3. - P. 103-108.
9. Ferreira A. C., Martins E. Jr., Afeche S. C. [et al.] // Life Sci. - 2004. - Vol. 75, N 79. -P.2291-2302.
10. Klaschka F. // Forum-Med. ; Verl.-Gess, 1996. - P. 15-19.
11. Maestroni G. J. // Expert. Opin Investig. Drugs. - 2001. - Vol. 10, N 3. - P. 467-476.
12. McCall M. R., Frei B. // Free Radical Biol. Med. - 1999. - Vol. 26. - P. 1034-1053.
13. Wang X., Quinn P. J. // Progres. Lipid Res. - 1999. - Vol. 38. - P. 309-336.
