CC BY
30
№ 3 - 2014 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки
УДК 612.313.5:612.6.054+612.018.2]-092.9
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРЕЛИМФАТИКСОВ ПОДНИЖНЕЧЕЛЮСТНОЙ СЛЮННОЙ ЖЕЛЕЗЫ КРЫС ПРИ ПЕРЕВИВНОЙ ОПУХОЛИ И ВОЗДЕЙСТВИИ МЕЛАТОНИНА
А. О. Кулишенко, А. С. Виноградов. Г. А. Асеев, Е. В. Овсянко, М. Г. Пустоветова, И. П. Жураковский, А. Н. Машак, Я. У. Овсянко, Н. В. Беляева
ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава
России (г. Новосибирск)
В исследовании использовали крыс-самцов линии Wistar массой 180-200 г. Суспензию клеток карциносаркомы Walker 256 (W256) имплантировали в мышцу бедра крыс. Крысы были случайным образом разделены на 4 группы (n = 7): 1-я группа — интактная; 2-я группа — без карциносаркомы W256 и при воздействии мелатонином (Mt); 3-я — с карциносаркомой W256 без лечения; 4-я — с карциносаркомой W256 при воздействии Mt (WMt). Mt в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно вводили в течение 14-ти суток. Изучали площадь внутри- и междольковых пространств, паренхимы слюнной железы, а также уровень экспрессии VEGF-A поднижнечелюстной слюнной железы. Опухолевый рост оказывает негативное влияние на ткань слюнной железы: токсические продукты метаболизма и распада опухолевых клеток способствуют изменению проницаемости кровеносных сосудов, что ведет к гемо- и плазморрагиям, в результате происходит увеличение площади внутридольковых пространств на фоне прогрессирующей паранеопластической эндогенной интоксикации. Мелатонин оказывает лимфотропный эффект, выражающийся в стремлении возврата показателей площади как внутридольковых, так и междольковых пространств при опухолевом росте к соответствующим показателям нормы.
Ключевые слова: поднижнечелюстная слюнная железа, VEGF-A, мелатонин, карциносаркома Walker 256.
Кулишенко Александра Олеговна — заочный аспирант кафедры патологической физиологии и клинической патофизиологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: akulishenko@mail.ru
Виноградов Александр Сергеевич — студент 5-го курса стоматологического факультета ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет»,
e-mail: vin_san92@mail.ru
Асеев Глеб Александрович — студент 4-го курса стоматологического факультета ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», e-mail: gleblove@gmail.com
Овсянко Елена Владимировна — доктор медицинских наук, доцент кафедры анатомии человека ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 225-15-24, e-mail: vin_san92@mail.ru
Пустоветова Мария Геннадьевна — доктор медицинских наук, профессор, заведующий Центральной научно-исследовательской лабораторией ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 226-35-60, e-mail: patophisiolog@mail.ru
Жураковский Игорь Павлович — доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Центральной научно-исследовательской лаборатории ГБОУ ВПО ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 226-35-60, e-mail: murash2003@mail.ru
Машак Александр Николаевич — доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой анатомии человека ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 225-15-24, e-mail: man4949@mail.ru
Овсянко Яхид Умеровна — кандидат медицинских наук, старший преподаватель кафедры анатомии человека ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 225-15-24, e-mail: vin_san92@mail.ru
Беляева Наталья Викторовна — кандидат медицинских наук, ассистент кафедры ортопедической стоматологии ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет», рабочий телефон: 8 (383) 221-29-37, e-mail: nvbeljaeva@ngs.ru
Введение. Мелатонин синтезируется не только шишковидной железой, но и во многих других органах и тканях организма, в частности, лимфатической системе. Это — костный мозг, тимус и лимфоциты. Мелатонин обладает иммуномодулирующими функциями. Мелатонин участвует в регуляции как клеточного, так и гуморального иммунитета, стимулирует выработку естественных клеток-киллеров, моноцитов и лейкоцитов, увеличивает выработку интерлейкинов ^-2, ^-6, ^-12 и интерферона-гамма [7].
Гормон мелатонин влияет на здоровье органов полости рта через мембранные рецепторы, представленные в слизистой эпителия полости рта и слюнных железах. Недавние исследования показали, что мембранные рецепторы мелатонина присутствуют в слюнных железах как крыс, так и человека [8]. Известно, что в любой патологический процесс вовлекаются структуры лимфатической системы [1]. Однако нет достаточных исследований, демонстрирующих структурные преобразования интерстициальных пространств — «корней» лимфатической системы — в слюнных железах в норме и при канцерогенезе при влиянии мелатонина.
На фоне роста числа онкологических заболеваний идет активный поиск новых препаратов для терапии пациентов. Использование мелатонина в последнее время становится особенно привлекательным, так как этот препарат, не оказывая токсического действия на организм, снижает токсическое воздействие, оказываемое как лучевой, так
и химиотерапией, и при этом не снижает их терапевтической эффективности.
Цель исследования: изучить динамику морфологических изменений тканевого звена лимфатического региона поднижнечелюстной слюнной железы крыс с карциносаркомой Walker 256 (W256) и при воздействии мелатонина (Mt).
Материалы и методы. В исследовании использовали крыс-самцов линии Wistar массой 180-200 г. Работу с животными проводили в соответствии с Европейской конвенцией и директивами по охране позвоночных животных и директивами по охране позвоночных животных, используемых в эксперименте [3, 6]. Использовали перевиваемый штамм карциносаркомы W256, поддерживаемый invivo (лаборатория физиологической генетики Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск). Суспензию клеток W256 имплантировали в мышцу бедра крыс линии Wistar в объеме 1 х 106 клеток [4]. Крысы были случайным образом разделены на 4 группы (n = 7): 1-я группа — интактная; 2-я группа — без карциносаркомы W256 и при воздействии мелатонином (Mt); 3-я — с карциносаркомой W256 без лечения; 4-я — с карциносаркомой W256 при воздействии мелатонином (WMt). Mt (ICN Biomedicals Inc. USA) в дозе 10 мг/кг вводили внутрибрюшинно в течение 14-ти суток. Объем опухоли измеряли штангенциркулем в трех взаимно перпендикулярных направлениях. Все манипуляции совершались спустя 5 суток с момента перевивки опухоли. Поднижнечелюстную слюнную железу для исследования в группе с W256 забирали на 5, 7 и 14-е сутки; в группе с W256 при лечении МТ на 10, 12 и 19-е сутки (рис. 1).
в - WMt, 19-е с^тхн
Рис. 1. Внутридольковые пространства поднижнечелюстной слюнной железы при карциносакркоме Ш256 без лечения и при воздействии МЪ ИН — интактные животные; Ш256 — крысы с перевивной карциносаркомой Ш256 без лечения; WМt — с карциносаркомой W256 при воздействии мелатонином. Препараты докрашены
гематоксилином Майера, х 400
Материал фиксировали в 10 % формалине, затем обезвоживали в серии спиртов с возрастающей концентрацией и заключали в парафин-воск. Для изучения площади внутри- и междольковых пространств, площади паренхимы слюнной железы препараты окрашивали гематоксилином Майера и эозином [2]. Иммуногистохимическое исследование уровня экспрессии фактора эндотелия роста сосудов (VEGF-A) выполняли на парафиновых срезах с помощью непрямого стрептавидин-авидинового метода [5]. Для выявления VEGFa в качестве первичных использовали поликлональные кроличьи антитела (Lab Vision Corporation, USA) в разведении 1 : 100. Срезы докрашивали гематоксилином Майера и эозином. О специфическом связывании антител свидетельствовало выявляемое дисперсное мелкогранулярное окрашивание цитоплазмы клеток — от бледно-желтого до темно-коричневого цвета. Более интенсивное окрашивание соответствовало наиболее высокому содержанию антигенов в клетках.
- : - TV у 1 iL i*- L - ' *■ 1 1 J' t № * .T \ V J ' 4 ■ ' и > - . -1 J/t- z sA * -ÏC v 5/Ä ^ л : 4О* : * 1 V ¿3 * Ш ' • - Л- ¿fr** Л
a - ИН fi — W256, 14-е с}-пси
KV s ^ ■ . ' * ï J l^VV^ Г■ Л -ï
и - WMt, 19-е супси
Рис. 2. Иммуногистохимия VEGF-A в ткани поднижнечелюстной слюнной железы при карциносакркоме W256 без лечения и при воздействии мелатонином: ИН — интактные животные; W256 — крысы с перевивной карциносаркомой W256 без лечения; WMt — с карциносаркомой W256 при воздействии Mt. Препараты докрашены гематоксилином
Майера, х 400
Морфометрическое исследование проводили на фотографических снимках при помощи микроскопа Micros MC 300A (Austria) и камерой CX 13c (Baumer) с конечным увеличением х600 и программным обеспечением ImageJ 1.42g (National Institute of Health, USA). Использовали программное обеспечение SPSS, версия 11.5.0 (SPSS, Inc., Chicago, USA) для обработки данных и статистического анализа.
Результаты исследований и обсуждение. В ходе анализа было выявлено снижение относительной площади паренхимы слюнной железы во всех изучаемых группах. Однако, если в группах с Mt как без опухоли, так и в большей степени с опухолевым ростом
снижение было незначительно по сравнению с интактным уровнем, то в группе с опухолью без лечения Мt данный показатель резко снижался на протяжении всего эксперимента (см. табл.).
Величины морфологических показателей поднижнечелюстной слюнной железы
(М ± т)
Показатели, мкм2 Группы
ИН Mt W256 WMt
Сутки
- 5 7 14 5 7 14 10 12 19
Паренхима 98,89 ± 0,11 98,7 ± 0,09 98,51 ± 0,13 98,53 ± 0,12 97,54 ± 0,17* 97,08 ± 0,19* 96,6 ± 0,24* 98,35 ± 0,18* 98,2 ± 0,22* 97,96 ± 0,31*
Внутридольковые пространства 3,08 ± 0,18 2,73 ± 0,25 3,98 ± 0,27* 3,4 ± 0,23 4,82 ± 0,35* 6,55 ± 0,41* 8,18 ± 0,43* 4,37 ± 0,36* 4,90 ± 0,29* 5,68 ± 0,43*
Междольковые пространства 1,1 ± 0,11 1,29 ± 0,93 1,48 ± 0,13* 1,46 ± 0,12* 2,45 ± 0,17* 2,91 ± 0,19* 3,35 ± 0,24* 1,64 ± 0,18* 1,77 ± 0,23* 2,03 ± 0,31*
Примечание: ИН — интактные животные; Mt — без карциносаркомы Ш256 при воздействии М^ Ш256 — крысы с перевивной карциносаркомой Ш256 без лечения; WМt — с карциносаркомой W256 при воздействии Мt; * — достоверное отличие с соответствующими показателями интакных крыс при Р < 0,05
При определении относительной площади внутри- и междольковых пространств мы наблюдали противоположную гистологическую картину. В группе с опухолью без лечения величины этих показателей, занимаемой ими площади, резко возрастали и особенно к концу эксперимента по сравнению со всеми изучаемыми группами.
Корреляционный анализ выявил умеренную положительную связь в группе с карциносаркомой W256 без лечения (г = 0,671) между величиной показателя относительной площади внутридольковых пространств и относительной площадью, занимаемой фактором эндотелия роста сосудов и его содержанием (г = 0,671; г = 0,518). Выявленные взаимосвязи позволяют считать, что изменение уровня экспрессии фактора эндотелия роста сосудов будет влиять на площадь внутридольковых пространств.
Выводы
1. Опухолевый рост оказывает негативное влияние на ткань поднижнечелюстной слюнной железы: токсические продукты метаболизма и распада опухолевых клеток способствуют изменению проницаемости кровеносных сосудов, что ведет к гемо-
и плазморрагиям, в результате происходит увеличение площади внутридольковых пространств на фоне прогрессирующей паранеопластической эндогенной интоксикации.
2. Мелатонин оказывает лимфотропный эффект, выражающийся в стремлении возврата показателей площади как внутридольковых, так и междольковых пространств при опухолевом росте к соответствующим показателям нормы.
Список литературы
1. Бородин Ю. И. Регионарный лимфатический дренаж и лимфодетоксикация / Ю. И. Бородин // Морфология : научно-теоретический мед. журн. — 2005. — Т. 127, № 4. — С. 25-28.
2. Основы гистологии и гистологической техники / В. Г. Елисеев, М. Я. Субботин, Ю. И.
Афанасьев, Е. Ф. Котовский. — М. : «Медицина», 1972. — 268 с.
3. Руководящие принципы ухода за животными и их использования в эксперименте // Журн. высш. нервной деятельности им. И.П. Павлова. — 1990. — № 1. — С. 203.
4. Динамика опухолевого роста у крыс линии Brattleboro и Wag при введении разных доз карциносаркомы Walker 256 / И. И. Хегай, Н. А. Попова, Л. С. Ганилова [и др.] // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 2008. — Т. 145, № 1. — С. 88-90.
5. Эллиниди В. Н. Практическая иммуногистохимия / В. Н. Эллиниди, Н. В. Аникиева, Н. А. Максимова. — СПб., 2002.
6. Counsil Directive of 24 November 1986 on the Approximation of Laws, Regulations o1f the Member States Regarding the Protection of Animals Used for Experimental and Other Purposes Directive (86/609/ЕЕС) // Official Journal of the European Communities. — L 262.
— P. 1-29.
7. Nuclear receptors are involved in the enhanced IL-6 production by melatonin in U937 cells / J. M. Guerrero, D. Pozo, S. Garcia-Maurino [et al.] // Biol. Signals Recept. — 2000. — P. 197-202.
8. Localization and biological activities of melatonin in intact and diseased gastrointestinal tract (GIT) / S. J. Konturek, P. C. Konturek, I. Brzozowska [et al.] // J. Physiol. Pharmacol.
— 2007. — Vol. 58. — Р. 381-405.
MORPHOLOGICAL CHANGES OF PRELYMPHATICS OF SUBMANDIBULAR SALIVARY GLAND
AT RATS WITH TRANSPLANTABLE TUMOUR AND MELATONIN INFLUENCE
A. O. Kulishenko, A.S. Vinogradov. G. A. Aseev, E. V. Ovsyanko. M. G. Pustovetova. I. P.
Zhurakovsky. A. N. Mashak. Y. U. Ovsyanko. N. V. Belyaeva
SBEIHPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health» (c. Novosibirsk)
In the research Wistar male rats line weighing 180-200 g were used. Suspension of Walker 256 carcinosarcoma (W256) cells was implanted into a hip muscle of rats. Rats were in a random way divided into 4 groups (n = 7): the 1st group — intact; the 2nd group — without W256 carcinosarcoma and at melatonin (Mt) influence; the 3rd — with W256 carcinosarcoma without treatment; the 4th — with W256 at Mt (WMt) influence. Mt in a dose of 10 mg/kg was enteinjectedred abdominally within 14 days. The area inside- and the interlobular spaces, parenchyma of salivary gland, and also level of expression of VEGF-A of submandibular salivary gland was studied. Tumoral growth has negative impact on fabric of salivary gland: toxic products of metabolism and disintegration of tumoral cells promote change of permeability of blood vessels that as a results leads to haemo- and plasmorrhagia, increase in the area of interlobular of spaces against progressing paraneoplastic endogenous intoxication. Melatonin renders the lymphotropic effect which is expressing in aspiration of return of indicators of the interlobular and intralobular area at tumoral growth to the corresponding norm indicators.
Keywords: submandibular salivary gland, VEGF-A, melatonin, Walker 256 carcinosarcoma.
About authors:
Kulishenko Aleksandra Olegovna — correspondence post-graduate student of pathological physiology and clinical pathophysiology chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», e-mail: akulishenko@mail.ru
Vinogradov Alexander Sergeyevich — student of the 5th course of stomatologic faculty at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», e-mail: vin_san92@mail.ru
Aseev Gleb Aleksandrovich — student of the 4th course of stomatologic faculty at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», e-mail: gleblove@gmail.com
Ovsyanko Elena Vladimirovna — doctor of medical science, assistant professor of human anatomy chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 225-15-24, e-mail: Vin_San92@mail.ru
Pustovetova Maria Gennadievna — doctor of medical science, professor of pathological physiology chair, head of CSRL at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry
of Health», office phone: 8 (383) 226-35-60, e-mail: patophisiolog@mail.ru
Zhurakovsky Igor Pavlovich — candidate of medical science, senior scientific worker of CSRL at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 226-35-60, e-mail: murash2003@yandex.ru
Mashak Alexander Nikolaevich — doctor of medical science, professor, head of human anatomy chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», contact phone: 8(383) 225-15-24, e-mail: man4949@mail.ru
Ovsyanko Yakhid Umerovna — candidate of medical science, senior teacher of human anatomy chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 225-15-24, e-mail: Vin_San92@mail.ru
Belyaeva Natalya Viktorovna — candidate of medical science, assistant of orthopedic stomatology chair at SBEI HPE «Novosibirsk State Medical University of Ministry of Health», office phone: 8 (383) 221-29-37, e-mail: nvbeljaeva@ngs.ru
List of the Literature:
1. Borodin Yu. I. Regionar lymphatic drainage and lymphodetoxication / Y. I. Borodin // Morphology: scientific-theoretical medical journal. — 2005. — V. 127, № 4. — P. 25-28.
2. Fundamentals of histology and histologic equipment / V. G. Yeliseyev, M. Y. Subbotin, Y. I. Afanasyev, E. F. Kotovsky. — M.: «Medicine», 1972. — 268 P.
3. The leading principles of care of animals and their uses in experiment // Journal of high. nervous activity n. a. I.P. Pavlov. — 1990. — № 1. — P. 203.
4. Dynamics of tumoral growth at rats of the Brattleboro and Wag line at introduction
of different doses Walker 256 carcinosarcoma / I. I. Khegay, N. A. Popova, L. S. Ganilova [etc.] // Bulletin of the exper. biology and medicine. — 2008. — V. 145, № 1. — P. 88-90.
5. Ellinidi V. N. Practical immunohistochemistry / V. N. Ellinidi, N. V. Anikiyeva, N. A. Maksimova. — SPb. 2002.
6. Counsil Directive of 24 November 1986 on the Approximation of Laws, Regulations o1f the Member States Regarding the Protection of Animals Used for Experimental and Other Purposes Directive (86/609/EEC) // Official Journal of the European Communities. — L 262.
— P. 1-29.
7. Nuclear receptors are involved in the enhanced IL-6 production by melatonin in U937 cells / J. M. Guerrero, D. Pozo, S. Garcia-Maurino [et al.] // Biol. Signals Recept. — 2000. — P. 197-202.
8. Localization and biological activities of melatonin in intact and diseased gastrointestinal tract (GIT) / S. J. Konturek, P. C. Konturek, I. Brzozowska [et al.] // J. Physiol. Pharmacol.
— 2007. — Vol. 58. — P. 381-405.
