CC BY
16
УДК 636.7:611.018.46:577.121:57.086.13
Водоп'янова Л.А. ©
E-mail: vodopyanova@mail.ru Харювська державна зооветеринарна академ1я, м. Хартв
МОРФОФУНКЩОНАЛЬШ ХАРАКТЕРИСТИКИ ТА ВМ1СТ МЕТАБОЛ1Т1В ЕНЕРГЕТИЧНОГО ОБМ1НУ В КЛ1ТИНАХ К1СТКОВОГО МОЗКУ СОБАК
КлШчна потреба в тстковому мозку посттно зростае i вимагае створення резерву. Визначення вмкту енергетичних субстратiв (глюкозо-6-фосфату, АТФ, тровтоградног та молочног кислот) в клтинах шсткового мозку собак дозволяе прогнозувати функцюнальний стан, тривалкть зберкання та ефективтсть застосування бiоматерiалу. Вiдновлення функцюнування, метаболiзму, i передуам, енергетичних процеав тсля трансплантацп станеться швидше в клтинах, де бiохiмiчнi зрушення були мшмальт. 1нкубацшний перюд в 30 хвилин, ще не викликае накопиченням лактату, хоча i приводить до зменшення рiвня АТФ, але змти мшмальт i це не повинно вiдбиватися на функцюнальних та терапевтичних властивостях ККМ, що застосовуються при лщванш ргзних порушень гемопоезу у собак.
Ключовi слова: клтини шсткового мозку, глюкозо-6-фосфат, АТФ, шровтоградна кислота, молочна кислота.
УДК 636.7: 611.018.46: 577.121: 57.086.13
Водопьянова Л.А. ©
Харьковская государственная зооветеринарная академия, г.. Харьков
МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И СОДЕРЖАНИЕ МЕТАБОЛИТОВ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА В КЛЕТКАХ КОСТНОГО МОЗГА СОБАК
Клиническая потребность в костном мозге постоянно растет и требует создания резерва. Определение содержания энергетических субстратов (глюкозо-6-фосфата, АТФ, пировиноградной и молочной кислот) в клетках костного мозга собак позволяет прогнозировать функциональное состояние, продолжительность хранения и эффективность применения биоматериала. Восстановление функционирования, метаболизма, и прежде всего, энергетических процессов после трансплантации произойдет скорее в клетках, где биохимические сдвиги были минимальны. Инкубационный период в 30 минут, еще не вызывает накоплением лактата, хотя и приводит к уменьшению уровня АТФ, но изменения минимальны и это не должно отражаться на функциональных и терапевтических свойствах ККМ, применяемых при лечении различных нарушений гемопоэза у собак.
Ключевые слова: клетки костного мозга, глюкозо-6-фосфат, АТФ, пировиноградной кислота, молочная кислота.
© Водоп'янова Л.А., 2014
52
UDC 636.7: 611.018.46: 577.121: 57.086.13
Vodopyanova L.A.
Kharkiv state zooveterinary academy, Kharkov, Ukraine
MORPHOFUNCTIONAL CHARACTERISTICS AND CONTENT OF METABOLITS OF POWER EXCHANGE IN DOGS" BONE MARROW CELLS
The bone marrow cells (BMC) have high therapeutic potential, it gives an opportunity to use them for treatment of different destructions of hematopoiesis. Thus, a clinical requirement in marrow constantly increases and requires creation of reserve of biomaterial. The research of glucoso-6-phospate, ATP, pyruvic acid and lactic acid in the dogs" bone marrow cells have been studied. It allows to forecast shelf-life and efficiency of application of biomaterial.
Restore function, metabolism, and above all, energy processes after transplantation happen faster in cells where biochemical changes were minimal. The incubation period of 30 minutes, yet does not cause accumulation of lactate, although results in reduction of ATP, but the changes are minimal and it should not affect the functional and therapeutic properties of CMC, used in the treatment of various disorders of hematopoiesis in dogs.
Key words: bone marrow cells, glucoso-6-phospate, ATP, pyruvic acid and lactic acid
Актуальнкть проблеми. Кютковий мозок (КМ) - це комплекс гемопоетичних кл^ин i елеменив мжрооточення, яю активно беруть участь в кровотворенш. Високий терапевтичний потенщал кл^ин ккткового мозку (ККМ) дае можливкть використовувати !х при лшуванш порушень гемопоезу, вщновленш дефщиту iмунноl системи, корекци гомеостазу оргашзму тсля хiмiо- i радютерапи [1, 2, 3]. Подiбнi методи терапи, е новими для ветеринара, проте вже показали свою результатившсть.
Не дивлячись на те, що ККМ активно вивчаються, багато аспекив 1х бiохiмil все ще невизначеш i заслуговують на особливу увагу. Багато роюв дослщження спрямоваш на вивчення механiзмiв i боротьбу з негативними наслщками збер^ання бюоб'екив. Для тдвищення ефективност трансплантаци, необхщно контролювати зв'язок мiж змшою енергетичного потенщалу i функцюнальним станом клiтин.
Вiдомо, що кл^инам постiйно потрiбна енергiя у видi АТФ. В той же час, запасу АТФ в кл^инах практично не кнуе i йде його постшний синтез [4, 5]. Порушення, будь-якого етапу метаболiзму, що приводить до припинення синтезу АТФ, згубно впливае на функцюнування кл^ини, у зв'язку з цим метою роботи було вивчення мiелограми та енергетичного статусу ККМ собак.
Матер1али i методи дослщження.
Отримання ттактних ККМ. ККМ були отримаш вщ собак вком 3-4 рокiв (n = 10). ККМ iз стегново! кютки отримували методом кютковомозково1 пункци з вимиванням середовищем 199. Концентрацiю кл^ин в суспензи
53
доводили до 1X 106 /мл шляхом розведення середовищем 3% ембрюнально1 сироватки кровi теляти, що мктить, 91% - 199 середовищ, 6% цитрату натрiю (робоче середовище) [6]. Всi роботи проводили при температурi не вище 4оС. У мазках, забарвлених по Романовському, визначали вид ККМ (мiелограму).
Визначення АТФ, Г-6-Ф, ПВК та лактату. Визначення змкту метаболитов проводили у безбшковому екстракт зi свiжоотриманих ККМ собак [4]. Рiвень АТФ i Г-6-Ф визначали в ходi одше1 ферментативно1 реакци, де АТФ у присутност гексокiнази фосфорилюе глюкозу, що утворюеться при цьому Г-6-Ф, у свою чергу, служить субстратом для глюкозо-6-фосфатдегидрогеназной реакци. Данi реестрували спекрофотометрично на СФ-46 (ЛОМО, Росiя) при довжиш хвилi 340 нм. Вмкт метаболiтiв в мкмоль/г бшка Визначення загально1 кiлькостi бiлка проводили по методу Бредфорд [7].
Статистичний анал1з. Даш представлен як середш значення (М±т) 10 незалежних експериментiв. Статистичну обробку результатiв проводили по методу Стьюдента-Фишера з використанням програми Microsoft ОШсе Excel.
Результати дослщження та ix обговорення.
Встановлено, що кютковий мозок собак складаеться з широкого спектру кл^ин на рiзних стадiях розвитку. При цьому переважають кл^ини гранулоцитарного ряду на завершальних стадiях диференцiювання. В таблицi 1 показано стввщношення клiтин кiсткового мозку собак, що характеризуе мiелограму свiжоотриманоl суспензи.
Iнкубацiя клiтин при 4 0С упродовж 30 хвилин не призводить до змши в мiелограмi.
Таблиця 1
Клггинний склад кiсткового мозку собак_
1нтактний КМ Клггинний склад,
(х106 /мл)
Загальна шльюсть клггин в суспензи КМ собак 10±0,01
Бласти 0,38±0,09
М1елобласти 0,07±0,01
Пром1елоцити 0,39±0,08
М1елоцити 0,49±0,01
Метам1елоцити 0,43±0,08
Палочкоядерш гранулоцити 2,87±0,13
Сегментоядерш гранулоцити 1,11±0,13
Моноцити 0,34±0,02
Л1мфоцити 0,63±0,06
Мегакарюцити 0,01±0,003
Еритробласти 0,08±0,003
Нормобласти базофшьш 0,1±0,01
Нормобласти пол1хроматофшьш 1,32±0,09
Нормоцити окафшьш 0,17±0,03
Пол1хроматофшьш еритроцити 1,35±0,05
Ретикулярш клггини 0,29±0,05
54
HayKoeuù eicnuK ÏÏHYBMET iMeni C.3. f^uцbкого
Tom 16 № 3 (60) Hacmuna 2, 2014
3m1hh b 3mîctî AT® i r-6-® b KKM Big6yBaroTbca B®:e Ha eTani iнку6ацiï (Ta6nuua 2). npu u^OMy He Big6yBaeTbca gocTOBipHHx 3mîh b 3mîctî nBK i MonoHHoï KHcnoTH b KniTHHax.
Тaôмuцн 2
KKM Cy6cTpaT eHepreTHHHoro o6MiHy (MKM0nb/r 6inKy)
AT® r-6-® nBK .HaKTaT
iHTaKTHi KKM 2,318± 0,067 0,702± 0,042 0,141±0,01 1,256±0,063
lHKy60BaHi 30 XBH.HH b cepegoBH^i 2,000±0,028* 0,500±0,06*** 0,145±0,004 1,310±0,079
- 3HaneHHH gOCTOBipHi BigHOCHO iHTaKTHHX KKM C06aK (KOHTpOnb), P < 0,05.
3HaneHHH gOCTOBipHi BigHOCHO KOHTpOnM,
Komponro, P < 0,001.
P < 0,01.
3HaneHHH gOCTOBipHi BigHOCHO
BcTaHOBneHO, ^o npu iнкy6aцiï mBHgKicTb i y3rog^emcTb 6ioxiMiHHHx пpоцeсiв b KniTHHax 3MiHroeTbca, npu цbомy nigBH^yroTbca BHTpaTH eHepreTHHHoro noTeH^any, BHKnuKaHe HucneHHHMH HHHHHKaMH: nepexig Ha aHaepo6HHH rniK0ni3 b KniTHHax in vitro, npurHo6neHHa 6ionoriHHoro OKHcneHHa pi3HHMH iHri6iT0paMH, ^opMyBaHHa gogaTKOBHx mnaxiB MeTa6oni3My [1]. Цнм
MO^Ha noacHHTH 3m1hh b BMicT AT® i r-6-® b KKM co6aK Ha eTani iнкy6aцiï.
Big0M0, ^o KKM BHKopHCTOByroTb aHaepo6HHH rniK0ni3 gna CHHTe3y AT®. Цe xapaKTepHO KniTHHaM epнтpоцнтapного, MaKpo^aranbHoro pagy, гpaнynоцнтaм, моноцнтaм i niм$оцнтaм, KniTHHaM, ^o reHeTHHHO npHCTOCOBaHi go BHKOHaHHa cboïx $yHK^H, aK b yMOBax H0pM0Kciï, TaK i rinoKciï (imeMiï npu 3ananeHHi). TaKHM hhhom, nigTBepg^yeTbca Heo6xigHicTb aKHanmBHgmoro npoBegeHHa TpaHcnnarna^ï 6ioMaTepiany, a TpHBane 36epiraHHa KKM in vitro HeMO^nHBe, ocKinbKH b KniTHHax 3MeHmyeTbca 0KHC.roBa.bHe geKap6oKCHnroBaHHa nBK i nigBH^yeTbca yTBopeHHa naKTaTy, ^o 3ry6He gna KniTHHH [8, 9, 10].
Bhchobkh. BigHOBneHHa ^yHK^OHyBaHHa, MeTa6oni3My, i nepegyciM, eHepreTHHHHx пpоцeсiв nicna TpaHcnnama^ï ctahetbca mBHgme b KniTHHax, ge 6ioxiMiHHi 3pymeHHa 6ynu MiHiManbHi. lHKy6a^HHHH nepiog b 30 xBHnHH, ^e He BHKHHKae HaKonrneHHaM naKTaTy, xona i npuBoguTb go 3MeHmeHHa piBHa AT®, ane 3m1hh MiHiManbHi i цe He noBHHHO Big6uBaTHca Ha ^yHK^OHanbHHx Ta
TepaneBTHHHHx BnacTHBOCTax KKM, ^o 3acT0C0ByroTbca npu niKyBaHHi pi3HHx nopymeHb reMonoe3y y co6aK.
^ÎTepaTypa
1. Warry E.E. Autologous peripheral blood hematopoietic cell transplantation in dogs with T-cell lymphoma / Warry E.E., Willcox J.L., Suter S.E. // Vet. Intern. Med. - 2014.- Vol. 28 (2), - P. 529-37.
2. Petersen S.M. In utero hematopoietic stem cell transplantation in canines: exploring the gestational age window of opportunity to maximize engraftment / Petersen S.M., Gendelman M., Murphy K.M., Torbenson M., Jones R.J., Stetten G., Bird C., Blakemore K.J // Fetal Diagn. Ther.- 2013.- Vol. 33(2), P. 116-3.
3. Escobar C. Hematologic changes after total body irradiationandautologous transplantation of hematopoietic peripheral blood
55
**
progenitor cells in dgs with lymphoma / Escobar C., Grindem C., Neel J.A., Suter S.E.// Vet. Pathol. - 2012. - Vol.49 (2), P. 341-343.
4. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / под ред. М.И. Прохоровой. - Л.: Изд. Ленинград. универ., 1982. - 272 с.
5. Mamprin M.E., Vega F., Rodrigues J.V. Adenosine 5 triphoshate transport and accumulation during the cold preservation of rat hepatocytes in University of Wisconsin solution // World J. Gastroenterol. - 2005. - Vol. 11, №13. - P. 19571964.
6. Kawano Y., Lee CL., Watanabe T., Abe T. et al. Cryopreservation of mobilized blood stem cells at a higher cell concentration without the use of a programmed freezer // Ann Hematol.- 2004. - Vol. 83, №1. - P. 50-54.
7. Bredford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. - 1976. - Vol. 72, №1. - P. 248-254.
8. Murdoch C., Muthana M., Lewis C.E. Hypoxia regulates macrophage functions in inflammation // The Journal of Immunology. - 2005. - Vol.175, №10. -P. 6257-6263.
9. Weisdorf D.J. Craddock P.R., Jacob H.S. Granulocytes utilize different energy sources for movement and phagocytosis // Inflammation. - 1982. - Vol. 6, № 3. - P. 245-256.
10. Patel S.D., Paroutsakis E.T., Winter J.N., Muller W.M. The lactate issue revisited: novel feeding protocols to examine inhibition of cell proliferation and glucose metabolism in hematopoietic cell cultures // Biotechnol. Prog. - 2000. - Vol. 16, № 5. - P. 885-892.
Рецензент - д.вет.н., в.о. професора Тибшка А.М.
56
