CC BY
16
УДК 619:602.3:611.018:636.7
Ключевые слова: мультипотентные стволовые клетки, костный мозг, моноклональное антитело, иммуноцитохимический анализ, ядерный белок, актин, виментин, E-кадгерин, N-кадгерин
Key words: multipotent stem cells, bone marrow, monoclonal antibody, immunocytochemical analysis, nuclear proteins, actin, vimentin, E-cadherin, N-cadherin
Мазуркевич А. И., Малюк Н. А., Безденежных Н. А., Харкевич Ю. А., Адаменко И. Н., Кудрявец Ю. И.
ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКИй ПРОФИЛь МУЛКГИПОТЕНТНыХ
стволовых клеток костного мозга собаки при культивировании in vitro на ранних пассажах
IMMUNOPHENOTYPIC PROFILE OF MULTIPOTENT STEAM CELLS OF THE BONE MARROW OF DOG DURING CULTIVATION IN VITRO
ON THE EARLY PASSAGES
'Национальный университет биоресурсов и природопользования Украины Адрес: 03041, Украина, г. Киев, ул. Героев Обороны, 15
'National University of Life and Environmental Sciences of Ukraine Address: 03041, Ukraine, Kyiv, Heroyiv Oborony str., 15 2Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины
Адрес: 03022, Украина, г. Киев, ул. Васильковская, 45
2R. E. Kavetsky Institute of experimental pathology, oncology and radiobiology of the National Academy of Sciences of Ukraine Address: 03022, Ukraine, Kyiv, Vasilkovska str., 45
Мазуркевич Анатолий Иосифович, д. в. н., проф.1 /Mazurkevych Anatoly I., Doctor of Veterinary Medicine, Professor' Малюк Николай Алексеевич, к. в. н., доцент1 / Maliuk Nikolay A., Ph.D. in Veterinary Science, Associate Professor' Безденежных Наталия Александровна, к. б. н., ст. научн. сотрудник2 Bezdieniezhnykh Natalia A., Ph.D. in Biology Science, Senior Research Scientist2 Харкевич Юрий Александрович, к. в. н., ассистент1 / Kharkevych Yuriy A., Ph.D. in Veterinary Science, Assistant' Адаменко Инна Николаевна, инженер I кат.2 / Adamenko Inna N., I category engineer2 Кудрявец Юрий Иосифович, д. б. н., ст. научн. сотрудник2 Kudriavets Yuriy I., Doctor of Biology Science ст. научн. сотрудник2
Аннотация. Проведенные иммуноцитохимические исследования подтверждают, что мультипотентные стволовые клетки костного мозга собаки представлены гетерогенной фракцией. Они экспрессируют маркеры мезен-химальных, мышечных, эпителиальных и нервных клеток, а также ядерные и плазматические белки, которые регулируют пролиферативные и антиапоптические процессы в клетках.
Summary. Immunocytochemical studies confirm that multipotent stem cells of the bone marrow of dogs represent as a heterogeneous fraction. They express markers of mesenchymal, muscle, epithelial and nerve cells, as well as nuclear and plasma proteins that regulates the proliferative and antiapoptotic processes in cells.
Введение
Очень важным направлением тканевой инженерии ХХ1 века является клиническое использование стволовых клеток (СК) с лечебной целью. Важным условием для успешного клинического использования СК является решение вопросов, связанных с разработкой методов и способов для активной пролиферации этих клеток и дифференциации в соответствующий фенотип, что обеспечивает возможность полноценной заместительной терапии поврежденных тканей и органов. Явным преимуществом соматиче-
ских СК в регенеративной медицине является то, что их выделение и применение не несет этических и иммунологических проблем.
Эффективная терапия стволовыми клетками возможна при условии учета многих аспектов их взаимодействия с организмом реципиента, а именно: иммунной реакции организма животного на трансплантированные клетки, механизмов хоуминга, которые обеспечивают поступление СК в место повреждения, а также дифференциации имплантированных клеток под влиянием сигналов микроокружения, что зави-
сит от фенотипических свойств стволовых клеток.
Считают, что среди фибробластоподобных клеток костного мозга (ФБПК КМ) находится несколько разновидностей мезенхималь-ных стволовых клеток, которые отличаются по поверхностным маркерам. По данным Pittenger et al., эти клетки несут маркеры CD44, CD62L, CD90, CD120^ но не экспрес-сируют CD14, CD34, CD45, CD49а и рецептор EGF [8]. Иммунофенотип гомогенных ФБПК, который описывал Hung, отличается от клеток, описанных Pittenger по таким молекулам, как CD49d, CD62L, CD120^ CD90 и рецепторам к TGFß и EGF [7]. В то же время ФБПК отличаются от фибробластов КМ, которые всегда остаются положительными на антиген CD34 и не несут маркер STRO-1.
В связи с неопределенностью относительно иммунофенотипа мультипотентных стволовых клеток, комитет Международного общества клеточной терапии (International Society for Cellular Therapy, ISCT) предложил для определения адгезивных к пластику клеток со свойствами мезенхимальных стволовых клеток, независимо от источника их выделения, использовать аббревиатуру «мультипотентные мезенхимальные стро-мальные клетки», сохранив аббревиатуру МСК [5, 6]. При этом термин «мезенхималь-ные стволовые клетки» рекомендовано использовать только в тех экспериментальных исследованиях, в которых подтверждаются свойства стволовых клеток: 1) адгезия к пластику; 2) экспрессия специфических антигенов; 3) способность в стандартных условиях in vitro к трехлинейной дифференциации в остеобласты, адипоциты и хондробласты. В соответствии с этими критериями, МСК после экспансии должны быть положительными по CD105, CD73, CD90. Одновременно МСК не должны экспрессировать CD45, CD14, CD11b, CD79а и CD11.
Описанные критерии используют только для стандартизации МСК человека, хотя адгезивные свойства и трехлинейная дифференциация характерны также для МСК других видов млекопитающих. В то же время описанные иммунофенотипические свойства стволовых клеток человека не могут быть
использованы для идентификации стволовых клеток разных видов животных, даже стволовых клеток лабораторных мышей, на которых проводится большинство экспериментальных исследований, поскольку экспрессия поверхностных антигенов этих клеток изучена не достаточно, а протоколов исследований, которые касаются иммунофе-нотипического профиля МСК собак, кошек, кролей, лошадей и других видов животных в доступных литературных источниках не обнаружено.
Таким образом, изучение иммунофено-типичесского профиля мультипотентных стволовых клеток животных имеет как теоретическое, так и практическое значение. При этом изучение CD маркеров мультипо-тентных стволовых клеток костного мозга собак во время культивирования in vitro на ранних пассажах является своевременным и актуальным заданием.
Цель исследования - изучить экспрессию экстра-, а также интрацелюлярных специфических белков мультипотентных стволовых клеток костного мозга собаки на ранних пассажах с помощью иммуноцитохимического анализа.
Материал и методика исследования
Мультипотентные стволовые клетки (МСК) выделяли из костного мозга (КМ) собак. Выделенную клеточную массу культивировали в стандартной среде: DMEM - 80 %, сыворотка эмбрионов телят - 20 % («Sigma», США) с добавлением 10 мкл/см3 среды ан-тибиотика-антимикотика. Культивирование проводили в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С и 5 % концентрации СО2. При этом МСК оседали, прикреплялись ко дну чашек Петри и распластывались. Суспензионную культуру кроветворных клеток удаляли, после чего продолжали культивировать клетки с адгезивными свойствами. С целью получения суспензии клеток использовали 0,5 % раствор трипсина и 0,2 % ЕДТА [2]. Микроскопический анализ культуры проводили с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 40 (Карл Цейс).
Для проведения иммуноцитохимическо-го анализа исследуемые клетки выращивали
на покровных стеклах 48-72 часа (при условии 50-70 % монослоя). Фиксировали клетки в растворе метанола и ацетона в соотношении 1 : 1 в течение 2 часов при температуре -20 °С, после чего их инкубировали с 1 % раствором бычьего сывороточного альбумина (BSA). Для выявления специфических маркеров наносили на фиксированные клетки МКАт (anti: PCNA (clone PC-10, NeoMarkers), Kí-67 (clone RB-9043-P0, Neomarkers), p53 (CloneDO-7, Dako), CD44 (clone 156-3C11, DiagnosticBioSystems), PanMuscleActin (clone la45C5, DiagnosticBioSystems), E-cadherin (cloneSPM 471, ThermoScientific), N-cadherin (clon CD325, ThermoScientific), виментин (V9, DiagnosticBioSystems), bcl-2 (clone 10/D5, ThermoScientific) на 30-60 минут (согласно инструкции производителя). После этого использовали систему визуализации PolyVue (ThermoScientific), коньюгирован-ную с пероксидазой, выявляли активность фермента с использованием в качестве субстрата диаминобензидин (ThermoScientific). После проведения иммуноцитохимической реакции препараты промывали водой и докрашивали гематоксилином Майера (Sigma) (15-30 с), после чего их заключали в водной среде Faramount (Faramount, Aqueous Mounting Medium). Анализ результатов про-
водили по количеству «положительных» клеток с экспрессией (коричневый цвет) и оценивали с использованием классического метода H-Score: S = 1*Л + 2xB + 3xC, где S -показатель «H-Score», значение которого находится в пределах от 0 (белок не экспресси-руется) до 300 (сильная экспрессия в 100 % клеток); А - процент слабо «окрашенных» клеток; В - процент умеренно «окрашенных» клеток; С - процент сильно «окрашенных» клеток.
Результаты исследований
В таблице 1 приведены данные по им-мунофенотипированию МСК КМ собаки на первом и втором пассажах.
С помощью иммуноцитохимичесско-го анализа нами установлено, что на первом и втором пассажах количество PCNA-положительных (proliferative cell nuclear antigen) клеток существенно не изменялось (табл. 1, рис. 1б), что свидетельствует об их высокой пролиферативной активности.
Стоит отметить, что на втором пассаже экспрессия еще одного белка, который ха-рактеризирует пролиферативный потенциал клеток — Ki-67 повысилась на 13 % по отношению к экспрессии Ki-67 клетками первого пассажа (табл. 1, рис. 1в). Вероятно, уве-
Таблица 1.
Иммунофенотипический профиль мультипотентных стволовых клеток костного мозга собаки на ранних пассажах (M±m, п=3)
№ п/п Исследуемый антиген Пассаж клеток из костного мозга собаки in vitro
I пассаж II пассаж
Показатели Н^соге (баллы)
Ядерные белки (связанные с пролиферацией и клеточным циклом)
1 PCNA 185±10,3 180±9,8
2 Ki 67 88±9,3 101±4,8
3 р-53 17±2 242±6,8***
Белки ассоциированные с апоптозом
4 Bcl-2 50±4,1 241±9,6***
Белки клеточной адгезии и цитоскелета
5 Е-кадгерин 124±11 163±9,7
б N-кадгерин 46±7 240±11,6***
7 Виментин 225±5,8 221±9,6
8 Актин 175±8,7 170±5,8
9 CD44 101±14 230±8,7***
Примечание: *- р < 0,05;** - р < 0,01; *** - р < 0,001.
личение количества Кь67-положительных клеток на втором пассаже в условиях культивирования in vitro свидетельствует об адаптации клеток к культуральной среде на протяжении второго пассажа и активизации их пролиферативной активности. Наши исследования согласовываются с исследованиями Coltera et al. [4].
Во время культивирования in vitro муль-типотентных стволовых клеток особенно важно исследовать экспрессию белков-регуляторов клеточного цикла, в частности р53, функция которого заключается в распознавании и исправлении ошибок, которые возникают во время репликации ДНК. Во время существенных повреждений ДНК как и других внутриклеточных нарушений происходит переключение функции белка р53, вследствие чего он приобретает транскрипционную активность и меняет экспрессию генов-мишеней. В результате этого происходит остановка деления генетически измененных, аномальных клеток, их гибель и элиминация из организма. В обыкновенных условиях белок р53 находится в латентной форме со слабой транскрипционной активностью, но в результате стрессов он переходит в стрессовую конформацию, становится более стабильным и приобретает новые функции. Помимо латентной и стрессовой форм белок р53 под действием некоторых цитокинов и морфогенов может временно приобретать свойства так называемой мутантной конфор-мации, в результате чего происходит инактивация его ростингибирующей активности и потеря функции клеточного регулятора [1, 3]. В этой работе выявлено небольшое количество р53-положительных клеток на первом пассаже и значительное увеличение их числа на втором пассаже (табл. 1, рис. 2а). Полученные результаты относительно активации экспрессии белка р-53 мультипотентными СК собаки свидетельствуют об активном выходе этих клеток из дормантного состояния, их адаптации к условиям культивирования, интенсификации пролиферативных процессов и повышение устойчивости клеток к апоптогенным факторам.
Белок Вс1-2 (табл. 1, рис. 2б) принадлежит к большой группе генов, продукты ко-
торых имеют как антиапоптические (Bcl-2, Bcl-XL), так и проапоптические свойства (Bax, Bad, Bic). Он находится в составе ми-тохондриальных мембран, эндоплазмати-ческом ретикулуме, перинуклеарной мембране и даже в митотических хромосомах. Было установлено, что на втором пассаже наблюдается достоверное увеличение количества Bd-2-положительных клеток (в 4,8 раза) сравнительно с числом положительных клеток на первом пассаже. Вероятно, увеличение уровня экспрессии этого белка также свидетельствует об активации пролифера-тивной активности мультипотентных СК КМ собаки на втором пассаже и активацию анти-апоптического действия Вс1-2.
Во время изучения мультипотентных стволовых клеток костного мозга собаки на ранних пассажах уделялось особое внимание исследованиям кадгеринов - протеинов, которые отвечают за Са2+-зависимое межклеточное взаимодействие, особенно в процессе эмбриогенеза и дифференциации тканей, в частности E-кадгерину, который характерен для эпителиальных клеток взрослого организма и N-кадгерину, который содержится преимущественно на поверхности нервных и мышечных клеток. Количество E- и N-кадгерин-положительных клеток на втором пассаже увеличивалось, что свидетельствует об активации межклеточных взаимодействий и стабильной экспрессии белков, которые характерны для эпителиальных, нервных и мышечных клеток взрослого организма, что подтверждает гетерогенность некомитированных мультипотентных СК КМ собаки на ранних пассажах (табл. 1, рис. 3а, 3б).
При исследовании мультипотентных СК КМ собаки мы также акцентировали внимание на экспрессию виментина - белка промежуточных филаментов цитоскелета, который является характерным маркером мезенхимальных клеток. В частности, нами была установлена стабильно высокая экспрессия клетками этого белка на ранних пассажах, что является подтверждением доминирования в культуре клеток именно мезенхимального происхождения (табл. 1, рис. 3в).
а
б
Рис. 1. Иммунофенотипическая характеристика специфических белков мультипотентных стволовых клеток собаки (II пассаж): а -контроль; б -PCNA- положительные клетки; в - Ю67-положительные клетки, ><200.
а
б
Рис. 2. Иммунофенотипическая характеристика специфических белков мультипотентных стволовых клеток собаки (II пассаж): а - р53-положительные клетки, ><200; б - Bcl-2-положительные клетки, ><400.
а
б
Рис. 3. Иммунофенотипическая характеристика специфических белков мультипотентных стволовых клеток собаки (II пассаж): а - Е-кадгерин-положительные клетки, ><200; б - N-кадгерин-положительные клетки, х200; в - виментин-положительные клетки, х400; г - актин-положительные клетки, х200.
в
в
г
При исследовании актин-положительных клеток нами было установлено, что уровень экспрессии этого белка имеет стабильную среднюю экспрессию как на первом, так и на втором пассажах, что также свидетельствует об их мезенхимальной природе. При этом наблюдался интересный факт клональной специфичности: высокая интенсивность экспрессии актина в некоторых клеточных популяциях (табл. 1, рис. 3г).
Как известно, белок системы клеточной адгезии - СD44 - является главным рецептором клеточных мембран для гиалуроната и принимает активное участие в образовании физического контакта между клетками стро-мы и ранними предшественниками В-клеток, а также в других формах межклеточной адгезии и процессах клеточной миграции. В наших экспериментах выявлено умеренное количество СD44-положительных клеток на первом пассаже и увеличение процента положительных клеток с высоким уровнем экспрессии на втором пассаже (табл. 1).
Выводы
1. Мультипотентные стволовые клетки костного мозга собаки, культивируемые в стандартной питательной среде, являются гетерогенными и экспрессируют маркеры мезенхимальных, мышечных, эпителиальных и нервных клеток.
2. Мультипотентные стволовые клетки собаки на втором пассаже активно экспрес-
сируют ядерные и плазматические белки, которые являются регуляторами пролифера-тивных и антиапоптических процессов.
Список литературы
1. Заридзе, Д. Г. Канцерогенез / Д. Г. Заридзе. -М. : Медицина, 2004. - С. 125-156.
2. Мазуркевич, А. И. Використання мезенх1мальних стовбурових клггин для корекци репаративних процеав в оргашзм1 тварин-рецишенпв. Методичн рекомендаций / А. И. Мазуркевич, В. Б. Даншов, М. О. Малюк та ш. - К., 2012. - С. 42.
3. Чумаков, П. М. Белок р53 и его универсальные функции в многоклеточном организме / П. М. Чумаков // Успехи биологической химии. - 2007, т. 47. -С. 3-52.
4. Coltera, D. C. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow / D. C. Coltera, R. Class, C. M. DiGirolamo et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2000, Vol. 97. -P. 3213-3218.
5. Dominici, M. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement / M. Dominici, K. Le Blanc, I. Mueller et al. // Cytoterapy. -2006, Vol. 8, 4. - P. 315-317.
6. Eminli, S. Reprogramming of neural progenitor cells into iPS cells in the absence of exogenous Sox2 expression / S. Eminli, J. S. Utikal, K. Arnold et al. // Stem cells. - 2008, Vol. 26. - P. 2467-2474.
7. Hung, S. C. Isolation and characterization of size -sieved stem cells from human bone marrow / S. C. Hung, N. J. Chen, S. L. Hsieh et al. // Stem Cells. - 2002, Vol. 20. - P. 522-530.
8. Pittenger, M. F. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells / M. F. Pittenger, A. M. Maskay, S. C. Beck et al. // Scince. - 1999, Vol. 284. - P.143-147.
