CC BY
18
УДК 636.7:612.419:57. 086.13
Водоп'янова Л.А., Югай К.Д., Бобрицька О. М., AHTiniH С. Л. ©
E-mail: vodopyanova@mail.ru Харкгвська державна зооветеринарна академ1я, м. Харкгв, Украгна
ВПЛИВ КРЮПРОТЕКТОР1В ТА КРЮКОНСЕРВУВАННЯ НА КЛ1ТИННИЙ СКЛАД К1СТКОВОГО МОЗКУ СОБАК
Кгстковиймозок - це комплекс клтин, яю тдтримуютъ кровотворення тварини. Высокий терапевтичний потенщал клтин кгсткового мозку дае можливжтъ використати гх при лшувант ргзних порушенъ гемопоезу. Таким чином, клгнгчна потреба в кгстковому мозку постшно зростае г вимагае створення резерву бюматер1алу. Використання кр1озахисту дозволяе збер1гати клтинний eMicm, близький до показниюв контролю.
Шсля заморожування-в1д1гр1вання без крюзахисту збер1гаетъся не быъше 6% ККМ собак, причому eidcymm клтини еритроцитарного ряду, мегакарюцит1в i моноцит1в. Р1зко скорочуетъся кглъкгстъ зрмих гранулоцит1в, а кглъкгстъ бласт1в г л1мфоцит1в значно знижуетъся (на 46,7% г 73,8% вгдповгдно). Шсля заморожування-в1д1гр1вання з глщерином загалъне число ККМ собак значно скорочувалося. При цъому глщерин, в концентрацИ 10%, 20%, 30% зробив наименшии захист клтин гранулоцитарного ряду. ПЭ0-400 10%, 15%, 20% забезпечуе доситъ високии pieenb збереження клтин (eid 60% до 75%). Наибшъш виражем кргозахиснг властивост1 мае ДМСО в концентрацИ 7% (до 98%), та збер1гае широкий клтинний спектр. При цъому склад кгсткового мозку змшюетъся, в основному, за рахунок зниження ктъкост\ клтин, що знаходятъся на завершуючих етапах дозргвання.
Ключов1 слова: клтини кгсткового мозку, кргоконсервування.
УДК 636.7:612.419:57. 086.13
Водопьянова Л.А., Югай К.Д., Бобрицкая О. Н., Антипин С. Л.
Харьковская государственная зооветеринарная академия, г. Харьков
ВЛИЯНИЕ КРИОПРОТЕКТОРОВ И КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ НА КЛЕТОЧНЫЙ СОСТАВ КОСТНОГО МОЗГА СОБАК
Костный мозг - это комплекс клеток, которые поддерживают кроветворение у животных Высокий терапевтический потенциал клеток костного мозга дает возможность использовать их при лечении различных нарушений гемопоэза. Таким образом, клиническая потребность в костном мозге постоянно растет и требует создания резерва биоматериала. Использование криозащиты позволяет сохранять клеточный состав близкий к показателям контроля.
© Водоп'янова Л. А., Югай К.Д., Бобрицька О. М., AHTiniH С. Л., 2014
74
UDC 636.7:612.419:57. 086.13
L.A.Vodopyanova, K.D.Yugay, O.N. Bobritskaya, S.L.Antipin
Kharkiv state zooveterinary academy, vul. Akademichna 1, Mala Danilivka, Dergachi district., Kharkov, Ukraine
EFFECT OF CRYOPROTECTANTS AND CRYOPRESERVATION ON THE CELLULAR STRUCTURE OF THE BONE MARROW OF DOGS
Bone marrow is a complex of cells, which give rise to the blood cells during animal's life. The bone marrow cells (BMC) have high therapeutic potential, it gives an opportunity to use them for treatment of different destructions of hematopoiesis. Thus, a clinical requirement in marrow constantly increases and requires creation of reserve of biomaterial.
Високий терапевтичний кл1тин юсткового мозку (ККМ) дае можливють використати ix при л1куванш р1зних порушень гемопоезу. Таким чином, клмчна потреба в кютковому мозку постшно зростае i вимагае створення резерву бюматер1алу. В клмчнш ветеринара i трансплантолог!! актуальним стало збер1гання (ККМ) за допомогою технолог!! заморожування. Багато рок!в ведуться досл!дження, спрямоваш на вивчення механ!зм!в i боротьбу з негативними насл!дками кр!опошкодження [1, 2, 3, 4, 5].
Таким чином, метою роботи було дослщження впливу кр!опротектор!в i заморожування-вщ1гр1ву на м1елограму ккткового мозку собак.
Матер1али i методи. ККМ були отримаш вщ 3-4 л1тшх собак (n = 10). Yci тварини були вшьш вщ паразит1в i вакциноваш. ККМ отримували i3 стегново! к!стки методом кктковомозково! пункци з вимиванням середовищем 199. Концентрацию кл1тин в cycnemii' доводили до 1* 107 /мл шляхом розведення середовищем, 3% ембрюнально! сироватки кров1 теляти, що мктить, 91% - 199 середовища, 6% цитрату натрш (робоче середовище) [6, 7].
Заморожування проводили в пластикових контейнерах за двоетапною програмою теля додавання крюпротектор1в. BiflirpiB проводили у вод1 при 41°С. Шсля BiflirpiBy, крюпротектори вилучали з суспензи ККМ та визначали збереженост1 кл1тин. ККМ забарвлювали трипановим сишм. В мазках, забарвлених за Романовським, визначали вид ККМ (м1елограму).
Отримаш результати представлено як середне значения (М±ш) 10 незалежних експеримент1в. Статистичну обробку результата проводили за методом Стьюдента-Фшера з застосуванням програми Microsoft Office Excel.
Результати й обговорення. Вщомо, що крюпротектори, яю використовуються для зниження негативних ефекпв заморожування-вщ1гр1ву, caMi можуть впливати на кл1тини при експозицп до заморожування. 3 даних, наведених на рис. 1, видно, що Bci дослщжеш крюпротектори на eTani експозицп дещо знижують кшьккть кл1тин кюткового мозку собак. Можливо, це пов'язано з присутшстю в суспензи кл1тин, пошкоджених пщ час отримання к1сткового мозку, а також чутливих до дп самих крюпротектор1в.
75
Заморожування юсткового мозку собак без крюпротектора негативно позначаеться на життездатност1 кл1тин { робить такий бюматер1ал непридатним для трансплантаци (рис. 2).
Доведено, що глщерин був недостатньо ефективним засобом захисту юсткового мозку собак при крюконсурвуванш. ПЕО-400 в 10% та 15% концентрацп забезпечуе бшьш високий р1вень збереження кл1тин, шж глщерин, а найбшьш виражеш крюпротекторш властивост1 мае ДМСО в 7% та 10% концентраций
Рис. 1. Показники збереження ккткового мозку собак теля експозицй* (10', 30' - хвилин) з кршпротектором та без нього. Даш наведено як середш значения (М±ш) 10 незалежних експеримент1в. ** - значения достов1рш шодо контролю; Р < 0,001. * - значения достов1рш щодо контролю, Р < 0,01. Контроль - ¡нтактннй кчстковнй мозок собак.
3 метою устшно! м1елотрансплантаци важливо зберегти не тшьки кл1тини, здатш до прол1фераци i диференцшвання, але i весь кл1тинний спектр юсткового мозку на стабшьному piBHi. У зв'язку з цим реестращя м1елограми при крюконсервуванш кл1тин юсткового мозку набувае важливого практичного значения.
На рисунку 3 показано вщсоткове стввщношення кл1тин юсткового мозку собак, що характеризуе м1елограму св1жоотримано! суспензи i суспензи теля заморожування-вщ1гр1ву з крюпротектором та без крюпротектора. Використання крюпротектор1в при заморожуванш юсткового мозку собак дозволяе зберегти кл1тинний склад теля BiflirpiBy. При цьому м1тмальт його змши виявлено теля заморожування-вщ1гр1ву юсткового мозку собак у присутност! ДМСО 7% i 10%.
с-жтропь
70
«riimn ГЕСМЭЭ ДМСО
Г-н
чьчяшетч. конце ит pauiH npi oi роте кг ара, Ч
76
ГЕО - «О
-II« 4<3№30]tffsa—-
Я1™
lalonoTifioM
конце тращн npionpoTE-KTropa, Vi
Рис. 2. Показники сбережении кчсткового мозку собак теля заморожування-ввд1гр1ву без кршпротектора та з кршпротектором в рпннх концентращях. Даш наведено як середш значения (M±m) 10 незалежних експернмент1в. * - значения достов1рш щодо контролю, Р < 0,001. # - значения достов1рш щодо кл1тин теля експознци з крюпротектором, Р < 0,001. Контроль - штактний кктковнй мозок собак.
100%
90%
80%
70%
60%
50%
концентращя крюпротектора, %
Рис. 3. Показники м1елограми до та теля заморожування-вщ1гр1ву кгсткового мозку собак з кршпротектором та без нього. П - ретикулярш
юптннн, 1—1 - бластн, Н - гранулоцити, ^ - ернтроцнтн, ^ - моноцити, ®
77
- л1мфоцити, И -мегакарюцити. Даш наведено як серед Hi значения (М±щ) 10
незалежних експеримент1в.
Висновки. Шсля заморожування-вщ1гр1вання без крюзахисту збер1гаеться не бшьше 6% ККМ собак, причому вщсутш кл1тини еритроцитарного ряду, мегакарюцшгв i моноцшгв. Р1зко скорочуеться кшькють зрших гранулоципв, а кшьюсть бласт1в i л1мфоцит1в значно знижуеться (на 46,7% i 73,8% вщповщно). Шсля заморожування-вщ1гр1вання з глщерином загальне число ККМ собак значно скорочувалося. При цьому глщерин, в концентраци 10%, 20%, 30% зробив найменший захист кл1тин гранулоцитарного ряду. ПЭО-400 10%, 15%, 20% забезиечуе досить високий р1вень збереження кл1тин (вщ 60% до 75%). Найбшьш виражеш крюзахистш властивост1 мае ДМСО в концентраци 7% (до 98%), та 36epirae широкий кл1тинний спектр. При цьому склад юсткового мозку змшюеться, в основному, за рахунок зниження кшькост1 кл1тин що знаходяться на завершуючих етапах дозр1вання. Це, мабуть, не повинно вщбиватися на терапевтичних властивостях, оск1льки ефект, в основному, залежить в1д стовбурових кл1тин i кл1тин, що знаходяться на раншх стад1ях диференц1ювання, здатних забезпечити вщновлення кровотворно! функц11 к1сткового мозку.
Таким чином, юстковий мозок собак крюконсервований з ДМСО може проявити максимальний терапевтичний ефект при л1куванн1 р1зних порушень гемопоезу у собак.
Л1тература
1. Baust J. G. Advances in biopreservation / Baust J. G, Baust J. M. // Ed. by -By Tayloor & Francis Group. LLC. - 2007. - P. 15 - 62.
2. Warry E.E. Autologous peripheral blood hematopoietic cell transplantation in dogs with T-cell lymphoma / Warry E.E., Willcox J.L., Suter S.E. // Vet. Intern. Med. - 2014.- Vol. 28 (2). - P. 529-37.
3. Petersen S.M. In utero hematopoietic stem cell transplantation in canines: exploring the gestational age window of opportunity to maximize engraftment / Petersen S.M., Gendelman M., Murphy K.M., Torbenson M., Jones R.J., Stetten G., Bird C., Blakemore K.J.// Fetal Diagn. Ther.- 2013.- Vol. 33(2). - P. 116-21.
4. Escobar C. Hematologic changes after total body irradiation and autologous transplantation of hematopoietic peripheralblood progenitor cells in dogs with lymphoma / Escobar C., Grindem C., Neel J. A., Suter S.E.// Vet. Pathol. - 2012.- Vol.49 (2). - P. 341-343.
5. Zhu X. Evaluation of canine bone marrow-derived mesenchymal stem cells after long-term cryopreservation / Zhu X., Yuan F., Li H., Zheng Y., Xiao Y., Yan F.// Zoolog Sci. - 2013. - Vol. 30 (12). - P.1032-1037.
6. Гольцев A.M. Оценка гемопоэтического потенциала стволовых кроветворных клеток костного мозга с измененным исходным статусом под действием факторов криоконсервирования / А. М. Гольцев, Т. Г. Дубрава, Ю. А. Козлова, Т. М. Турина, М. В. Останков // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т. 15, №3. - С. 320-323.
7. Kawano Y. Cryopreservation of mobilized blood stem cells at a higher cell concentration without the use of a programmed freezer / Y. Kawano, C. L. Lee, T. Watanabe, T. Abe // Ann. Hematol.- 2004. - Vol. 83, №1. - P. 50-54.
Рецензент - д.вет.н., професор Головач П.1.
78
