CC BY
26
(BECTON DICKINSON). Жизнеспособность клеток определяли по окрашиванию трлпановым синим. Для оценки апоптоза клетки окрашивали флуоресцентным красителем Hoehst 33342 (Sigma) и бромистым этидием и анализировали на флуоресцентном микроскопе Opton.
Результаты. Было показано, что экспрессия белка Вс1-2 в линии 2В4/Ьс12 составляет 76,6±2,9% против 2,7±0,1% в линии 2В4.
Ингибиторы дыхания ротенон (2 рМ) и антимицин А (2 |iM), ингибитор митохондриального синтеза АТФ оли-гомицин (5 мкг/мл), и разобщитель окислительного фос-форилирования 2,4-динитрофенол (ДНФ, 0.4 мМ) вызывают гибель клеток линии 2В4 (~90% за 25 часов). У 40-50% клеток наблюдаются характерные морфологические признаки апоптоза (конденсация хроматина и образование апоитотических телец). Вс1-2 практически полностью защищает клетки от гибели.
Подавление гликолиза2-дезоксиглюкозой (ДОГ) вызывает практически полную гибель клеток (25 часов) без признаков апоптоза. Вс1-2 защищает от гибели -50% клеток. Комбинация ДОГ с митохондриальными ингибиторами не ускоряет гибелыслеток (30-40% за 10 часов), но предотвращает защитный эффект Вс1-2.
Заключение. Показано, что снижение уровня АТФ в клетке под действием митохондриальных ингибиторов вызывает чувствительные к Вс1-2 апоптоз и некроз. Более эффективное снижение АТФ при совместном торможении гликолиза и окислительного фосфорнлировання вызывает некротическую гибель и предотвращает защитное действие Вс1-2.
Анализ специфичности антител в сыворотках пациентов, получающих терапию экстрактами омелы белой
Малючепко Н.В., Солопова О.Н, Егорова С.Г.
Московский Государственный университет им. М.В.Ломоносова, Москва, Россия
Экстракты омелы белой получили широкое распространение в терапии опухолевых заболеваний в Европе. Противоопухолевую активность экстрактов связываютс I) цитотоксической активностью экстрактов по отношению к опухолевым клеткам, 2) активацией звеньев иммунной системы, участвующих в защите против опухоли, 3) возможной индукцией днфференцнровки трансформированных клеток, следствием которой является снижение пролиферативной активности и повышение чувствительности к апоптозу. В отношении иммунномодуляторной активности было показано, что под действием экстрактов происходит активация макрофагов, естественных киллеров, CD4+ клеток, а также индукция синтеза IL-1 a, IL-1 р, IL-6, IL-10, TNF-а и др. Во время терапии экстрактами, через 3-4 недели после начала, в сыворотках пациентов появляются антитела, направленные против основного белка омелы - вискумина (MLI) и его изоформ (MLII и MLIII). В основном, антитела - IgG класса, однако наблюдали также продукцию специфичных антител IgA
и 1§Е класса. В настоящий момент антитела, образующиеся в ответ на введение экстрактов омелы, недостаточно полно охарактеризованы. Хотя известно, что специфичные к белкам омелы антитела оказывают модулирующие действие на активность экс фактов 1п V
В данной работе проводилось изучение специфичности антител в сыворотках опухолевых пациентов, которое получали терапию экстрактами омелы белой.
Для реализации данной задачи были разработаны различные сэндвич-тест-системы на основе иммунноферментного анализа. Эти системы созданы на основе полученных ранее мышиных моноклональных антител, направленных против различных участков как А-, так и В-субъединицы вискумина. Данные системы различают конформационные состояния субъединиц вискумина.
В результате анализа образцов сывороток, взятых от опухолевых больных, принимающих терапию экстрактами омелы, нами было показано, что антитела в сыворотках активно взаимодействовали как с нативной, так с денатурированной формой А-субъединицы вискумина. Также мы обнаружили, что антитела в сыворотках практически не реагировали с нативной формой, а были, в основном, направлены к денатурированной форме В-субъединицы вискумина. Данный результат можно объяснить способностью В-субъединицы токсина вызывать апоптоз. Предполагается, что в организме, при попадании антигена (вискумина), происходит своеобразная отрицательная селекция клонов В-лимфоцитов, специфичных к нативной форме В-субъединицы белка.
Крометого, было показано, что человеческие антитела в сыворотках имеют общие с мышиными антителами антигенные детерминанты. Некоторые из данных детерминант картированы с помощью пептидного сканирования.
В заключение необходимо отметить, что благодаря полученной ранее в нашей группе панели мышиных моноклональных антител, стало возможным создание различ-пыхтест-систем и получение более полной информации о специфичности антител, продуцируемых в ответ на введение вискумина. Таким образом, можно проводить частичную оценку презентации антигена в организме пациентов, а именно: к каким формам вискумина и к каким из известных антигенных детерминант направлен иммунный ответ при терапии экстрактами омелы белой.
Моноклональные антитела против высокомолекулярного меланомо-ассоциированного антигена как вектор для синтеза иммунотоксинов
Новиков К.Н., Малючепко Н.В.,МоПсенович М.М., Егорова С.Г.
Московский Государственный университет им. М.В.Ломоносова, Москва, Россия
Иммунотоксины являются препаратами направленного действия и предназначены для избирательной элиминации клеточных популяций. ИТ состоят из векторной
молекулы и цитотоксического агента. Из цитотоксичес-ких агентов наиболее часто применяются растительные рибосоминактивирующие белки второго типа (РИБП), к которым относят рицин (1160) и вискумин (МЬI). Несмотря на то, что Я60 синтезируются в семенах клещевины, а МЫ - в листьях омелы белой, оба белка имеют сходную третичную структуру и механизм действия. В состав МЬ1 и 1160 входит связывающая (В) и каталитическая (А) субъединицы. В-субъединица имеет галактозосвязывающие центры и взаимодействует с клеточными рецепторами, содержащими терминальную галактозу. Каталитическая субъединица токсинов проникает в цитоплазму и модифицируете Б РНК эукариотических клеток, останавливая синтез белка на уровне трансляции. Замена В-цепи на векторную молекулу в ряде случаев позволяет получить высокоэффективный препарат направленного действия.
Цель работы: Иследование специфической цитоток-сической активности полученных иммунотоксинов на основе МА против высокомолекулярного меланомо-ас-социироваиного антигена (НМ\№) и А-цепей растительных токсинов.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследование специфичности взаимодействия ИТ с клетками - мишенями при помощи непрямой реакции иммунофлуоресценцип.
2. Изучение циготоксической активности ИТ при помощи цитотоксического МТТ-теста.
Материалы и методы. Четыре иммунотоксина получены в 1998 г. коныогированием моноклональных антител 763.74 изотипа ^01 и МА225.28 изотипа \gG2z против высокомолекулярного меланомо-ассоциированного антигена (получены и любезно предоставлены нам проф. Солдано Ферроне, Нью-Йоркский медицинский колледж) и А-цепей растительных токсинов вискумина и рицина.
В работе были использованы клеточные линии меланомы человека: Ме1иг, Со1о38, Ро1, любезно предоставленные нам проф. Солдано Ферроне (Ныо-Йоркский медицинский колледж, США), ЯМ 30, любезно предоставленная членом датского онкологического общества Киркиным А.ф. В качестве контрольных — антигеннега-тивных — клеточных линий были использованы лимфоб-ластоидные культуры НЬ60, Ы4.
Непрямая иммунофлуоресценция на стеклах использовалась для проверки специфичности взаимодействия иммунотоксинов с клетками-мишенями. Реакцию оценивали при помощи флуоресцентного микроскопа (Ьейг, Германия), при 250х или400х увеличении.
Цитотоксическое действие препаратов оценивали по выживаемости клеток согласно методике, описанной ранее [МоэБтап, 1983]. Для сравнения активности различных препаратов определяли дозу токсического агента, вызывающую гибель 50% клеток или ЛД50. За 100% принимали интенсивность окрашивания клеток, которые культивировались без токсинов.
Результаты. Методом непрямой иммунофлуоресценции было показано, что иммунотоксины связыва-
ются с поверхностью клеток-мишеней (100% мембранная окраска клеток линий Ме1иг, Со1о38. Ро 1, Г:М 30) н не взаимодействуют с контрольными линиями. Цитоток-сический тест показал, что полученные нами конъюгаты обладают избирательным цнтотоксическим действием по отношению к клеткам-мишеням. В качестве мишеней были выбраны клетки линии РМ 30. ЛД50 для иммунотоксинов 763.7411ТА, 763.74МЬА, 225.28ЯТА. 225.28МЬА равнялись соответственно: 10 'М, 2х 10 "’М, Ю'*М, 2х 10_УМ. ЛД50 нативных токсинов рицина и вискумина— Ю'|2М и 10'11 соответственно. При сравнении показателей видно, что ИТ на основе МА 763.74 и Д-цепи вискумина сопоставимы по активности с цельными токсинами, что делает его перспективным объектом в дальнейших исследованиях, связанных с созданием им-мунотерапевтических препаратов направленного действия. Другие ИТ из группы исследованных показали меньшую цитотоксичность. И тем не менее, эти белки в дальнейшем, также планируется использовать п исследованиях.
Изучение иммунологических механизмов фотодинамической терапии опухолей
Огурцов Р.П., Рыльков В.В., Пузырёва В.П.,
Стуков А.Н., Ивашкова Е.В., Кузнецова С.В.
Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РА МН, ВИЦ Государственный оптический институт им. С. И. Вавилова
Для лечения онкологических больных применяют фо-тодинамическую терапию (ФДТ). В основе метода ФДТ лежит идея о фотохимической деструкции опухолевых клеток. Для этого в организм вводят краситель-фотосеи-сибилизатор (ФС), избирательно накапливающийся в опухолевых клетках. В момент максимального накопления ФС производится облучение опухоли светом в полосе поглощения красителя. Фотовозбужденный краситель оказывает токсическое действие на опухолевые клетки, и опухоль рассасывается. Однако может существовать и другая причина положительного эффекта ФДТ. Так, нами получен дистанционный эффект ФДТ. При введении ФС и местном воздействии оптического излучения (ОИ) на опухоль (карцинома Эрлиха) одной из задних лай мыши наблюдали деградацию опухоли и на другой, необлученной лапе. Можно думать, что наблюдаемый эффект не связан с прямым действием ОИ на опухолевые клетки, а опосредован через систему противоопухолевого иммунитета.
Исследование проводили при внутрикожном введении клеток карциномы Эрлиха в подушечки задних лап мышей СВА, использовании ФС хлорина Р6, или фото-сана, (50мкг/мл) и облучении криптон-ионовым лазером (647 нм, 90 Дж/см). Коэффициент торможения развития опухоли при использовании хлорина Р6, или фо-тосана составил 0,062 день-1 и 0,059 день-1 против 0,101
