CC BY
59
связан с возможностью идентифицировать апоптоз различными морфологическими, морфометрическими, цитометрическими и биохимическими методами. Применение данных методой позволяет регистрировать апоптоз, вызванный различными стимулами - например, противоопухолевыми препаратами или другими апоитоз-индуцируюшими агентами. Известно, что моноклональные антитела (MICA) ainn-I-'as и ант и-АРО-1, после связывания с поверхностным клеточным рецептором, также индуцируют апоптоз в опухолевых клетках.
Целью работы являлась идентификация программированной клеточной смерти различными методами при индукции химиотерапевтическими препаратами и моноклональными антителами IPO-4 (Ant¡-CD95) в опухолевых клетках.
Материалы и методы. Исследована способность доксорубицина, этопозида, цисплатина, циклоплотама и моноклональных антител 1РО-4 индуцировать апоптоз in vitro в Т-клеточной неходжкинской злокачественной лимфоме человека линии Jurkat. Клетки (5*105 клеток/мл) инкубировались в среде RPMI-164Ü с 10% ТЭС и антибиотиками в течение 4-24-48 часов при 37°С в атмосфере 5% СО, в присутствии различных концентраций препаратов. Индукция апоптоза оценивалась нами rio появлению популяции клеток с гиподиплоид-пым набором ДНК (окраска пропидиумом йодидом -PI), методом TUNEL (TdT-medíated dUTP nick end labeling), выявляющего клетки с одно- и двухнитевыми разрывами ДНК, характерными для ранней стадии апоптоза и методом с использованием антикоагулянта Annexin V-FITC. Регистрация апоптоза проводилась на проточном цитофлюориметре FACScan. (BECTON DICKINSON, США)
Результаты. Используемые препараты индуцировали апоптоз в зависимости от времени и концентраций препаратов. Максимальный процент апоптоз!шх клеток зарегистрирован при индукции доксорубицином 0,5 ng/ in! —48 ч„ цисплатином 40 j.im —48 ч„ этопозидом 10 |ig/ml —48 ч., циклоплатамом 10 pg/ml -24 ч. Использование Annexin V-FITC и PI позволило нам зарегистрировать три популяции клеток при индукции апоптоза МКА IPO-4. Так, после 4 часов индукции МКА определяются живые клетки (неокрашенные), клетки, окрашенные только Annexin V-F1TC —ранняя стадия апоптоза и клетки, окрашенные Annexin V-F1TC и PI — поздняя стадия апоптоза или некротические клетки.
Заключение. Оценка программированной клеточной смерти данными методами подтверждает способность химиотерапевтических препаратов индуцировать апоптоз в опухолевых клетках, что, в свою очередь, может оказаться одним из прогностических факторов в определении чувствительности опухолей к цитотоксическим препаратам и оптимизировать курс химиотерапии. Применение новейших методов регистрации апоптотических клеток позволяет существенно отличить некроз от апоптоза. Кроме того, высокая эффективность данных мето-
дов регистрации апоптоза позволит ответить на ряд вопросов в изучении молекулярных механизмов трансдуции апоптотического сигнала.
Механизм действия иммунотоксинов на основе моноклональных антител к высокомолекулярному меланомо-ассоциированному антигену и А-субъединиц растительных токсинов
Торосян H.A., Новиков К.Н., Кондратьева Т.Д.,
Егорова С.Г.
Московский государственный университет uv. М.В.Ломоносова,
Москва, Россия
В течение последнего десятилетия было синтезировано значительное количество иммунотоксинов. Результаты, полученные в экспериментах на клеточных культурах, показали высокую избирательную цитотоксическую активность большинства препаратов. Накопленный опы т позволяет определить ряд новых подходов в синтезе и применении цито токсических конъюгатов. Между тем, актуальной остается проблема создания “идеального” иммунотоксина пугем оптимизации эффективности действия его составляющих. Изучение механизмов действия на клетки-мишени позволит создавать более эффективные ИТ.
Цель работы: Изучение механизма действия иммунотоксинов.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1 .Разработка оптимальной схемы выявления клеток, содержащих фрагментированную ДНК.
2. Оценка вклада апоптоза в цитотоксическое действие иммунотоксинов.
Материалы и методы. Получены иммунотоксины на основе моноклональных МА225.28 изотипа IgG2a против высокомолекулярного меланомо-ассоциированного антигена (любезно предоставленные нам проф. Солдано Ферронс, Нью-Йоркский медицинский колледж) и А-це-пей растительных токсинов вискумина и рицина.
В работе была использована клеточная линии меланомы человека FM 3D любезно, предоставленная членом датского онкологического общества Киркиным А.Ф.
Окраска клеточного ядра для флуоресцентной микроскопии проводилась с использованием флуоресцентного красителя Hoechst.
Для цитофлуориметрического метода использовалась окраска при помощи пропидиума йодида.
Результаты. Для проведения исследований, связанных с инициацией апоптоза в клетках-мишенях при помощи полученных ранее иммунотоксинов, использовали методы цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии. Клетки-мишени предварительно инкубировали в присутствии токсических агентов в течение 4, 8,12,16,24 часов, после чего проводилось окрашивание и оценка результа-
Таблица. ТОКСИНЫ И ИММУНОТОКСИНЫ. ДОЛЯ КЛЕТОК С ЯВЛЕНИЕМ АП0ПТ03А В ДИНАМИКЕ ИНКУБАЦИИ С ИММУНОТОКСИНАМИ
Время 225MLA 225RTA ML1 R60
8 ч. 2% 2% 30% 30%
12 ч. 5% 5% 50% 40%
14 ч. 30% 10% 80% 50%
16 ч. 40% 15% 85% 60%
24 ч. 60% 17% 100% 70%
тов. В таблице приведены суммированные данные экспериментов, отображающие процентное отношение клеток, содержащих фрагментированную ДИК (апоптозные тельца) к общему количеству клеток. Из таблицы видно, Ч'ГО цельные токсины вызывают фрагметацию ДИК на более ранних сроках инкубации, что, по-видимому, связано с некоторыми различиями в способах проникновения ИТ и токсинов в цитоплазму клеток.
В дальнейшем планируется подробнее изучить инициацию апоптоза иммупотоксинамл при помощи различных методов, а также проследить способы проникновения этих белков внутрь клеток.
Свойства общего для А-субъединиц рицина и вискумина эпитопа
Челнокова О.В., Моисеиовпч М.М., Малюченко Н.В., Торосян H.A., Чичканова Ю.В., Кондратьева Т.Ю. Егорова С. Г.
Московский Государственный университет им. М.В.Ломоносова
Введение: Вискумин (ML1), из листьев омелы белой (Viscum album), и рицин (R60) из семян клещевины (Ricinus communis) принадлежат к семейству растительных рибо-сомин-активирующих белков второго тина. Они состоят из каталитической (А) и связывающей (В) субъединиц, ковалентно связанных дисульфидной связью. Молекулярный вес субъединиц - около 30 кДа. В-субъединнцы токсинов обусловливают их взаимодействие с клеточной поверхностью. Каталитические субъединицы обладают ферментативной активностью —расщепляютМ-гликозидную связь Ajrj 28S РНК эукариот, что, в конечном итоге, приводит к остановке белкового синтеза. Высокий процент гомологии RTA и MLA, сходство их третичных структур, наличие общих олигасахаридов создают предпосылки для выявления общих для этих молекул антига шых детерминант.
Цель работы: Изучение свойств общего для рицина и вискумина эпитопа.
Задачи: Изучить особенности взаимодействия моноклональных антител ТА71, ТА75, ТА77 с А-субьединица-ми рицина и вискумина. Изучить условия экспонирования эпитопа TA7I57. Определить устойчивость гибридом 'ГА71, ТА75, ТА77 к действию рицина и вискумина.
Материалы и методы: Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела ТА71, ТА75, ТА77, были полу-
чеиы в результате слияния миеломы со ешюноцитами мышей липни BALB/e. многократно иммунизированных MI .А в присутствии адъюванта Фрейнда. МонАт ич асцитной жидкости выделяли методом аффинной хроматографии на белок-А-сефарозе. Взаимодействие момАЧ с R6II, RIA, МГ.1, MLA исследовалось с помощью ТИФА. Применяемые схемы ТИФА позволяли изуч;п ь взаимодействие монА! с нативными и денатурированными антигенами, а также с антигенами, взаимодействующими с гидрофобной поверхностью полипропиленовых или иолистироло-вых 96-луночных плат. Для определения влияния гуанидин-гидрохлорида на экспонирование эпитопа, биотинилиро-ванные каталитические субъединииы (300 мкт/мл)токсинов инкубировали 1 час при комнатной температуре в 0,! М трис (рН7,7) при концентрациях гуанидинпирохло-рида от 1 до 7М. Перед проведением ТИФА объем инкубационной смеси увеличивали в 300 раз с помощью фосфатно-солевого буфера, содержащего 0.1% БСА. 25 мМ лактозу, 0,01 твин 20. Для определения устойчивости гибридом к действию токсинов использовали МТТ-тест.
Результаты: Получены новые моноклональные антитела (ТА71, ТА75, ТА77), реагирующие с каталитическими субъединицами рицина и вискумина. Конкурентный анализ показал, что эти антитела конкурируют друг с другом за место связывания как с RTA, так и с MLA и, скорее всего, имеют общий эпитоп. Эпитоп, узнаваемый монАт ТА71, ТА75.ТА77, обозначен нами как ТА7157. Особенности эпитопа ТА7157 заключаются в том, что он не экспонирован па поверхности нативных молекул токсинов и их А-субъединиц, а появляется после частичного разворачивания белковой глобулы или в результате взаимодействия белка с гидрофобной поверхностью иммунологической платы. Углеводы не входят в состав изучаемого эгштопа, поскольку он представлен надегликозилированных молекулах— рекомбинантной MLA и на изоформе вискумина ML3. С помощью моноклональных антител, реагирующих с данным эпитопом, получены данные о разнице в скорости реиатурации у каталитических субъединиц рицина и вискумина. Различия в скорости реиатурации могут влиять на цитотоксическое действие этих двух токсинов и иммуно-токсинов, синтезированных на их основе. Гибридомы, синтезирующие монАТ, были неустойчивы к действию токсинов. Изучаемые монАт не влияли на слияние азолсктиновых липосом, вызванное MLA и, следовательно, не взаимодействуют с MLA, находящейся в контакте с фосфоли-ппдиым бпелоем. Отсутствие взаимодействия атггител с токсинами в этих условиях может быть объяснено тем, что исследуемый участок молекулы экспонируется внутрь липидного слоя, и поэтому оказывается недоступным для антител.
Заключение: Конформация RTA и MLA, при которой экспонируется общий эпитоп, может быть важной для проявления биологической активности каталитических субъединиц токсинов. Полученные моноклональные антитела могут быть использованы для изучения механизмов действия рицина и вискумина, а также их производных (иммунотоксинов).
