CC BY
29
(BECTON DICKINSON). Жизнеспособность клеток определяли по окрашиванию трлпановым синим. Для оценки апоптоза клетки окрашивали флуоресцентным красителем Hoehst 33342 (Sigma) и бромистым этидием и анализировали на флуоресцентном микроскопе Opton.
Результаты. Было показано, что экспрессия белка Вс1-2 в линии 2В4/Ьс12 составляет 76,6±2,9% против 2,7±0,1% в линии 2В4.
Ингибиторы дыхания ротенон (2 рМ) и антимицин А (2 |iM), ингибитор митохондриального синтеза АТФ оли-гомицин (5 мкг/мл), и разобщитель окислительного фос-форилирования 2,4-динитрофенол (ДНФ, 0.4 мМ) вызывают гибель клеток линии 2В4 (~90% за 25 часов). У 40-50% клеток наблюдаются характерные морфологические признаки апоптоза (конденсация хроматина и образование апоитотических телец). Вс1-2 практически полностью защищает клетки от гибели.
Подавление гликолиза2-дезоксиглюкозой (ДОГ) вызывает практически полную гибель клеток (25 часов) без признаков апоптоза. Вс1-2 защищает от гибели -50% клеток. Комбинация ДОГ с митохондриальными ингибиторами не ускоряет гибелыслеток (30-40% за 10 часов), но предотвращает защитный эффект Вс1-2.
Заключение. Показано, что снижение уровня АТФ в клетке под действием митохондриальных ингибиторов вызывает чувствительные к Вс1-2 апоптоз и некроз. Более эффективное снижение АТФ при совместном торможении гликолиза и окислительного фосфорнлировання вызывает некротическую гибель и предотвращает защитное действие Вс1-2.
Анализ специфичности антител в сыворотках пациентов, получающих терапию экстрактами омелы белой
Малючепко Н.В., Солопова О.Н, Егорова С.Г.
Московский Государственный университет им. М.В.Ломоносова, Москва, Россия
Экстракты омелы белой получили широкое распространение в терапии опухолевых заболеваний в Европе. Противоопухолевую активность экстрактов связываютс I) цитотоксической активностью экстрактов по отношению к опухолевым клеткам, 2) активацией звеньев иммунной системы, участвующих в защите против опухоли, 3) возможной индукцией днфференцнровки трансформированных клеток, следствием которой является снижение пролиферативной активности и повышение чувствительности к апоптозу. В отношении иммунномодуляторной активности было показано, что под действием экстрактов происходит активация макрофагов, естественных киллеров, CD4+ клеток, а также индукция синтеза IL-1 a, IL-1 р, IL-6, IL-10, TNF-а и др. Во время терапии экстрактами, через 3-4 недели после начала, в сыворотках пациентов появляются антитела, направленные против основного белка омелы - вискумина (MLI) и его изоформ (MLII и MLIII). В основном, антитела - IgG класса, однако наблюдали также продукцию специфичных антител IgA
и 1§Е класса. В настоящий момент антитела, образующиеся в ответ на введение экстрактов омелы, недостаточно полно охарактеризованы. Хотя известно, что специфичные к белкам омелы антитела оказывают модулирующие действие на активность экс фактов 1п V
В данной работе проводилось изучение специфичности антител в сыворотках опухолевых пациентов, которое получали терапию экстрактами омелы белой.
Для реализации данной задачи были разработаны различные сэндвич-тест-системы на основе иммунноферментного анализа. Эти системы созданы на основе полученных ранее мышиных моноклональных антител, направленных против различных участков как А-, так и В-субъединицы вискумина. Данные системы различают конформационные состояния субъединиц вискумина.
В результате анализа образцов сывороток, взятых от опухолевых больных, принимающих терапию экстрактами омелы, нами было показано, что антитела в сыворотках активно взаимодействовали как с нативной, так с денатурированной формой А-субъединицы вискумина. Также мы обнаружили, что антитела в сыворотках практически не реагировали с нативной формой, а были, в основном, направлены к денатурированной форме В-субъединицы вискумина. Данный результат можно объяснить способностью В-субъединицы токсина вызывать апоптоз. Предполагается, что в организме, при попадании антигена (вискумина), происходит своеобразная отрицательная селекция клонов В-лимфоцитов, специфичных к нативной форме В-субъединицы белка.
Крометого, было показано, что человеческие антитела в сыворотках имеют общие с мышиными антителами антигенные детерминанты. Некоторые из данных детерминант картированы с помощью пептидного сканирования.
В заключение необходимо отметить, что благодаря полученной ранее в нашей группе панели мышиных моноклональных антител, стало возможным создание различ-пыхтест-систем и получение более полной информации о специфичности антител, продуцируемых в ответ на введение вискумина. Таким образом, можно проводить частичную оценку презентации антигена в организме пациентов, а именно: к каким формам вискумина и к каким из известных антигенных детерминант направлен иммунный ответ при терапии экстрактами омелы белой.
Моноклональные антитела против высокомолекулярного меланомо-ассоциированного антигена как вектор для синтеза иммунотоксинов
Новиков К.Н., Малючепко Н.В.,МоПсенович М.М., Егорова С.Г.
Московский Государственный университет им. М.В.Ломоносова, Москва, Россия
Иммунотоксины являются препаратами направленного действия и предназначены для избирательной элиминации клеточных популяций. ИТ состоят из векторной
